この作品はLeverhulmeトラスト、工学物理科学研究会議からの助成金によってサポートされていました[EP / H018301 / 1、EP / G037221 / 1];アルツハイマー病研究UK [ARUK-EG2012A-1];ウェルカム・トラスト[089703 / Z / 09 / Z]および医学研究審議会[MR / K015850 / 1、MR / K02292X / 1]。我々は、HEK293培養物の調製のために、それぞれLifeAct-GFPのトランスフェクションおよび細胞質-GFP細胞のためのE. AvezovとM.呂に感謝し、そしてW.陳。また、有益な議論や提案のための顕微鏡の設計の支援のためのK. O&#39;Holleranに感謝し、そしてL.シャオとR. Heintzmann。

<ol>
	<li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laterally+modulated+excitation+microscopy:+improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating.">Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Shim, S. 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The authors have nothing to disclose.

<html>例えば、このプロトコルで詳述設定として特注TIRF-SIMシステムは、市販の顕微鏡に比べて高速で多色超解像度イメージングが可能です。超解像技術としてSIMの固有の利点は、単一分子局在顕微鏡（SMLM）、または誘導放出の枯渇顕微鏡（ある点走査法などの他の方法に比べて、時間分解能は、フルオロフォアの光物理によって限定されるものではないということですSTED）。多色イメージングが簡単であるように、これらの他の技術とは異なり、SIMはphotoswitchableまたは枯渇蛍光団を必要としません。ここで報告された2倍の改善とは対照的に、SIMおよび多焦点SIMを区画などの光などの非TIRF-SIMシステムは、通常、実際には1.7倍以下の解像度の向上を達成することができ、および商用システムは、システムよりも頻繁に遅く、あまり柔軟性がありますこのプロトコルで提示。 &quot;&gt;この技術を実装する2つの主要な困難は、まずSIMが高いパターンのコントラストを生成するために、第二光学アライメント手順を消費労力と時間を必要とする目的の背面開口部のTIRゾーン内梁6の正確な位置決めのために必要ですサンプルにおいて、偏光回転は、低NA 2D-SIMシステムでは、偏光回転を直線偏光の向きを注意深く選択することによって回避することができる。必須であるが、これはTIRF-SIM 25は不可能になる。高速多色画像化のために、電気光の偏光制御が必要であり、これは、システムの複雑さおよび費用を増加させます。 技術の制限事項 TIRF-SIMは、従来のTIRFように、自然に生物学的構造とエバネッセント場の150-200 nmの侵入深さによって照明することができる基底細胞膜に位置するプロセスの観察に制限されています。同時にSIMは、多くの場合、STEDまたはSMLMのいずれかよりも細胞に対してよりphotodamagingものとして引用され、横方向の解像度の倍増は、依然として従来のTIRF顕微鏡と比較して少なくとも4倍5により光子の必要数を増やすん。短い露光時間で高フレームレートで撮影するために、この光子の増加は、増加した照明強度の使用を必要とします。任意のフルオロフォアが固定または低速で移動サンプルのSIMイメージングのために使用することができるが、強化された光安定性と高輝度蛍光タンパク質または次世代合成染料は、生細胞イメージングのために推奨されています。 この実装では、20ヘルツを超えるSIMフレームレートで、単一の色を撮像することができるが、提示システムにおける多色画像は電動発光フィルタホイールのスイッチング時間により制限されます。 sCMOSカメラチップのサイズが大きいため、多帯域発光フィルターと画像分割光学系の使用が可能であると同時に私を可能にしますなしスピードペナルティで複数の波長でmaging。別の可能性は、異なる励起レーザを交互に励起光を拒絶するためにマルチバンドノッチフィルタを使用することです。この実装ではバイナリ強誘電体SLMの使用も最適ではありません。そのようなSLMの回折効率は非常に低いので、入射光の大部分は、空間マスクによってフィルタリングされたゼロ次反射です。非常に高いフレームレートを必要とするアプリケーションの場合、イメージング速度は、従って、レーザダイオードの出力パワーによって制限されます。 SLMはまた、離れた画素はとして理想的な半波長板を動作させてください550 nmの設計波長からの波長に対する偏光のいくつかの楕円率を導入しています。この追加のLCVRを使用することによって補償することができるが、理想的な解決策は、パターン発生器などのデジタルマイクロミラーデバイス（DMD）を使用することができます。 可能な修飾セットアップpresaの複数形ここnted柔軟性があり、より簡単に修正された市販の装置よりも、このような3D-SIM、高速2D-SIMように、他の画像診断法、多焦点SIM（MSIM）および非線形SIM（NL-SIM）は21,34,35を実装することができます。 2D-SIMは、末梢小胞体などの比較的平坦な、動きの速い構造を画像化するのに適しすることができます。周辺ERは、TIRFエバネッセント場を使用して照明することができるが、原因で、そのフラットな構造に無視できるピンボケ背景に、標準的な2D-SIMを使用して画像化することができるよりも細胞内の深くにあります。さらに、改良された光学セクショニング再構成アルゴリズムの使用は、光が光学的に厚いサンプルは、いえ軸方向分解能倍増が21必要とされないため、2D-SIMの使用を拡張するピンボケ抑制することができます。 MSIMでは、サンプルは、励起焦点36の疎な格子によって照明されます。この様式は、SM（単に空間マスクを除去することによって実現することができます）と偏光子によってそれを置き換えます。 SLMは現在、振幅変調器として動作します。 SLM上に表示されたバイナリSIM格子像面における回折限界の焦点の大きさに等しくなるように選択されたスポットのサイズが、スポットの2次元格子で置き換えることができます。 図7Aでは、4×4ピクセルの正方形の格子は13.62ミクロンの物理的なSLMのピクセルサイズを考えると、試料上に縮小時150×150nmの回折限界の焦点を生成するSLM（挿入図）に表示されます。励起の焦点は、次に、SLM上の格子パターンをシフトすることによって変換することができ、これは、視野全体を照明するために複数回繰り返されます。画像は各翻訳パターン位置とスタックのために取得されている倍までの解像度向上と再構成画像を得るために、ポスト処理され、 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq19.jpg" />そして、同等の広視野画像と比較して、アウト・オブ・フォーカス光減少30。取得時間を伴う生フレームの数が多いに増加させるが、この様式は、例えば、染色された赤血球（ 図7C）のような低コントラスト構造を標準SIMは不向きであるため厚く、高密度のサンプルを撮像するために有用であり得ます（この場合はN = 168）の視野ごとに必要。 Li らによって最近提示最後に、セットアップは、高NAリニアTIRF-SIMまたはパターン化された活性化非線形SIM（PA NL-SIM）のいずれかを有効にするように変更することができる。、超高1.7 NAの客観的または付加を使用することによって405 nmの光活性化レーザとSLM格子パターン35の慎重な最適化。 将来の応用 SIMはまだ急速に進化技術であり、生命科学の多くのアプリケーションは、将来的に有効になります。技術のスピード、解像度、コントラストの強化と標準フルオロフォアメートルを使用する能力バイオイメージングのために、SIMは、例えば、共焦点及び広視野プラットフォームのような従来の多くの顕微鏡システムを置き換えるために設定されているEAN。商業用SIMシステムが決定的に、彼らは分野の最新の研究開発を実施するように変更し、開発される柔軟性がない、しかし、彼らは多くの研究機関の財務範囲を超えている、優れた技術仕様で、すでに今日利用可能である、と。彼らはまた、「手元の実験のために適合させる」ために必須の能力、エッジ生命科学研究を切削しばしば重大なボトルネックを欠いています。ここで説明するシステムは、再構成された二層系のインビトロ研究、材料、物理科学、表面の化学的性質を研究するために、 例えば 、細胞表面の近くに動的プロセスを研究するために特によく適しているであろう。 2Dの材料、および他の多くのアプリケーション。

最後の5年にわたり、超解像顕微鏡は成熟しており、生物学者の手に専門光学研究室から移動しました。商業用顕微鏡ソリューションは、光超解像を実現するための3つの主要なバリアントのために存在する：単一分子の局在顕微鏡（SMLM）、排出量の枯渇顕微鏡（STED）を刺激し、構造化照明顕微鏡（SIM）1,2。 SMLMは、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）と確率的光学再構成顕微鏡（STORM）のような容易にダウンして20 nmまで、主として光学セットアップの簡単さと高空間分解能の約束に、最も人気のある技術となっています。しかし、単一分子の局在化を介した超解像顕微鏡は、本質的なトレードオフが付属しています：空間分解能の達成可能では時間分解能を制限するため、個々のフルオロフォアローカライズの十分な数を蓄積に依存しています。イメージング動的プロセス1が適切にも画像を再構成するためにその時間内に十分なローカライズイベントを取得しながらモーションアーチファクトをpreventする関心のある構造の動きをサンプリングしなければならないため、生細胞におけるESは、したがって、問題となります。これらの要件を満たすために、生細胞SMLMデモが大きく励起パワーを増加させることによって、フルオロフォアphotoswitching率の必要な増加が得られており、これにより、サンプルの生存時間および生物学的関連性3制限毒性および酸化ストレスに順番につながります。 SIMとSMLM両方を超えるSTEDの明確な利点は、それは厚い試料中の超解像度の画像は、例えば60nm程度の横方向の解像度は、最大120ミクロン〜4の深さで器官脳スライスで達成されたことができますされていること。 SMLMまたはSIMの単一目的の実装と、そのような深さでのイメージングが実現不可能であるが、単一分子光シートまたは格子光シートマイクのどちらかで可能になりますroscopy 5。これまでのところ、これは図6の小さなフィールドを撮像するために制限されているが、ビデオレートSTEDはまた、実証及びシナプス小胞の移動をマッピングするために使用されてきました。 細胞生物学および分子の自己集合反応7における用途のために-それは特定の蛍光の光物理的特性に依存しないように、多くの時間点にわたって高時間分解能でイメージングを必要とする12、構造化照明顕微鏡（SIM）よく適合することができますプローブ。 SIMのこの固有の利点にもかかわらず、今までその使用は、主に固定された細胞または動きの遅いプロセスを画像化するために限定されています。これは、市販されているSIMシステムの限界によるものである。これらの商品の獲得フレームレートが必要と正弦波照明パターン並びに光学偏光維持を生成するために使用される回折格子の回転速度によって制限されました。商業SIMの最新世代機器は、高速撮像が可能であるが、彼らは中央イメージング施設が、すべてに非常に高価です。 このプロトコルは、薄い試料中の生細胞の基底面付近で高速処理を撮像するための柔軟なSIMシステムの構築へのガイドを提示します。それは非常にフォーカス背景信号のうちを減少させ、サンプル13にノー深く約150 nm未満を貫通照明パターンを生成するために、全反射蛍光（TIRF）を採用しています。 TIRFでSIMを組み合わせるという発想は、SIM自体14とほぼ同じくらい古いですが、2006年15前に実験的に実現しなかった。TIRF-SIMで得られた第一のin vivo画像がチューブリンとキネシンを視覚化するために11ヘルツのフレームレートを達成2009年16で報告されましたダイナミクス、2色TIRF-SIMシステムは17,18を提示されました。最近では、単一色2ビームSIM秒の構築および使用のためのガイドystemは最大18 Hzの19,20のフレームレートをフィーチャー発表されました。 ここに提示され、セットアップは、TIRF-SIMで動作することができる2つのうちの3色で20HzでSIM超解像度イメージングが可能です。システム全体は、倒立顕微鏡のフレームの周りに構築され、ピエゾ作動Zステージと電動式のXY移動ステージを使用しています。 TIRF-SIMに必要な正弦波励磁パターンを生成するために、提示システムは、強誘電体空間光変調器（SLM）を使用します。バイナリ格子パターンがSLM上に表示され、結果の±1回折次数は、フィルタリング中継され、対物レンズのTIRリングに重点を置いています。必要な位相シフト及び格子の回転は、表​​示されたSLMの画像を変更することによって適用されます。このプロトコルは、このような励起パスを構築し、位置合わせする方法について説明し、排出路の位置合わせを詳述し、最適なアラインメントを確保するための試験サンプルを提示します。また、デ<html>スクライブ偏光制御とコンポーネントの同期に関する高速TIRF-SIMに特定の問題や課題を。 設計上の考慮事項と制約このプロトコルで提示TIRF-SIMシステムを組み立てる前に、光学部品の選択を決定考慮すべきいくつかの設計上の制約があります。光学部品の全ての略号は図1を参照してください。 空間光変調器（SLM） それは、サブミリ秒パターン切替が可能であるようにバイナリ強SLMは、この設定で使用されています。階調ネマチックのSLMを使用することができるが、これらはスイッチング時間を大幅に提供減少しました。二位相のピクセルをオンまたはオフに各SLMは、入射面波面にオフセットπまたは0相のいずれかを付与する周期的な格子パターンがSLM上に表示されている場合はそのためには、位相回折格子として動作します。 ENT &quot;&gt;全反射（TIR） TIRを達成し、エバネッセント場を生成するために、ガラスサンプル界面における励起ビームの入射角が臨界角よりも大きくなければなりません<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq1.jpg" /> 。また、これは、したがって、エバネッセント照明パターンの最大間隔または期間を、必要とされる最小の入射角を設定し、。最大入射角<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq2.jpg" /> （受光角）を定義から計算することができ、対物レンズの開口数（NA）によって制限されます<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq3.jpg" /> 。これは、アッベ式に従って達成間隔の最小パターンを決定します<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq4.jpg" /> NAと波長をリンクします<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq5.jpg" />最小パターン間隔に<imgALT = &quot;式&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg&quot; /&gt;。実際には、1.49のNA油浸TIRF対物レンズは、約79°の最大入射角と488nmでの励起波長を用いて164 nmでのサンプルの最小限のパターン周期をもたらします。これら二つの角度は、（TIRリング。 すなわち ）機器がTIR照明を実現する上で、対物レンズの後部開口部のリングを定義し、2つの励起焦点を正確に位置決めして正確に各照明パターンを生成するために回転する必要があります。 TIRF-SIMの画像の再構成は、パターン回転あたり3位相シフトの最小の買収は、したがって、SLMパターン期間は3で割り切れる必要があります必要があります（ 図1を参照）。例えば、488nmの照明用の9画素と640 nmの照明のための12ピクセルの期間。剪断された格子を用いたパターン間隔のサブピクセル最適化などのSLMパターン設計の包括的な議論については、、16及びLu-ヴァルターら ら Knerの前の仕事を参照してください。2つの励起焦点の20位置は全ての波長のためのTIRリングの内側にある必要があります、しかし、SLMからの±1次数の回折角は波長であります依存。標準SIMため、多色画像は、最長波長に対する格子周期を最適化し、より短いチャンネルに対する性能の損失を許容することによって達成することができます。 TIRF-SIMの場合はしかし、一つの波長を最適化すると、他の波長の焦点は、もはやTIRリング内であることを意味しません。病巣バック開口部の直径の95％で、およびTIRリング内にあるが、640nmのため、この期間外焦点を配置と同じように、例えば、9画素の格子周期を使用して、488 nmのためのTIRFを提供するのに十分ですアパーチャ。この理由のために、異なるピクセルパターンの間隔は、各励起波長のために使用されなければなりません。 TIRF-SIM励起経路のアラインメントはるかので、従来のSIMよりも、顕微鏡本体内のダイクロイックミラーの位置における小さな変化（ 図1中のDM4）に非常に敏感です。回転フィルタキューブターレットの使用は、固定位置に保持され、使用される励起波長のために特別に設計されたシングル、マルチバンドダイクロイックミラーを使用する代わりに、推奨されません。最高品質のダイクロイックミラーを使用することが必須です。これらは、少なくとも3mmの厚さの基板を必要とし、多くの場合、製造業者によって「撮影フラット」として指定されます。他のすべての基板は、TIRF-SIMに耐え難い収差や画像劣化につながります。 偏光制御 TIRF-SIMを達成するために、それが光軸に対して対物レンズの瞳面内の方位角方向に偏光ままであるように照明パターンと同期して励起光の偏光状態を回転させることが不可欠である（ すなわち。 s偏光）。偏光制御光学系の位置合わせは、電動式回転ステージ22、例えば、使用される特定の光学素子のポッケルスセル21、または半波長板を左右される。このプロトコルでは、カスタム液晶可変リターダ（LCVR）は、それが高速（〜ミリ秒）のスイッチングを可能にするように640 nmの波長範囲488を完全に波（2π）リターダンスを提供するように設計、使用されています。液晶リターダを使用する場合には、高品質のコンポーネントを使用することが必須である：標準部品は、典型的には、照明パターンと低い変調コントラストのうち、ぼけにつながるカメラの露光時間の長さにわたって一定のリターダンスを与えるのに十分安定ではありません。液晶リターダは、また、温度に強く依存し、温度制御に内蔵必要。 同期レーザーは、SLMと同期する必要があります。バイナリ強誘電体のSLMは、内部のでバランスされていますオン状態とオフ状態の間魔術。ピクセルは、いずれか一方のみでそれらの状態をオンまたはオフではなく、時間を切り替えインターの間に半波長板として作用します。したがって、レーザーはのみによるピクセルの中間状態にパターンコントラストの低下を防止するために、SLMからの信号を有効にLEDを介してオン/オフ状態の間にオンにする必要があります。レーザをデジタル変調することができない場合、音響光学変調器（AOM）を交互に高速シャッターとして使用することができます。 レンズの選択これらの制約に基づいて、所望の照明パターンを生成するために試料面上にSLM面の必要な縮小を決定することができます。これは、画像中継望遠鏡励起集光レンズL5に2つのレンズL3とL4の焦点距離を計算することができます。このシステムでは100X / 1.49NAの油浸対物レンズ488 nmおよび640 nmの励起で使用され、従って300および140ミリメートルの焦点距離を使用してL4およびL3のための、およびL5のための300ミリメートル、試料面での38ナノメートルのSLMの画素サイズに相当357Xの合計縮小を与えます。レンズの組み合わせを使用して、SLMは、それぞれ70°と67°の入射角に対応し、488 nmの照明とサンプルで172および229 nmでのパターン間隔を与えるnmの640のための12画素について9の期間を格子。ガラス - 水界面の場合、臨界角は、したがって、これらの2つのパターンの間隔は、両方の波長のためのTIRF励起を可能にする、61°であり、かつ波長とは無関係です。 37℃で動作する場合、または補正環を備えた対物レンズは、カバーガラスの厚さの変動によって導入される球面収差の補正のために有用です。 画像再構成生SIMデータが取得されると、それは、2段階のプロセスで超解像を生成するための計算量の問題です。まず、照明パターンのために決定されなければなりませんすべての画像および第二に、SIMスペクトルの構成要素は、（ 図6、インセットを参照してください）効果的なOTF支援を倍増するように適切に分離して再結合する必要があります。 超解周波数成分が重複する成分の残留部分によって引き起こされるアーティファクトを防止するためにできるだけ正確に純粋でなければならないように投影された照明パターンの正確な知識は、最も重要です。我々は、照明パターンのそれぞれについて発見されたグスタフソンら要するに23、正規化された二次元の正弦波を記述する照明パラメータのセットによって導入された手順に従って、生の画像データから事後パラメータ決定します<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq7.jpg" />励起パターン<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq8.jpg" /> ： <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq9.jpg" />これによって<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" />そして<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq11.jpg" />縞コントラストとそれぞれ個別の画像メートルのフェーズを開始するパターンを記述しています。波数ベクトルの成分<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq12.jpg" />そして<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq13.jpg" /> 、唯一の異なる向きに変更<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq14.jpg" />パターンと缶のそれ以外の場合は一定であると仮定。粗重なりを最適化するように相互相関のイメージのいずれかにサブピクセルシフトを適用することによって、精製された原画像のスペクトルの相互相関が実行される波数ベクトルの成分を決定します。これは、実空間位相勾配の乗算を介して行われます<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq15.jpg" />それがfreにおけるサブピクセルシフトを誘発します波数空間。前に実際のパターン推定に波ベクトルの良好な推定値を有することが有用であり、これは蛍光ビーズ層を画像化することにより求めることができることに注意してください。 シフトパターンとの間の位相ステップがあるように<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq16.jpg" /> 、 すなわち 。 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq17.jpg" /> 、周波数成分の分離は、「相軸」に沿ってフーリエ変換することにより行うことができます。大域的位相<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq18.jpg" />フリンジのコントラスト<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" />次いで、異なる成分の複雑な線形回帰を用いて決定することができます。個々の分離された成分は、その後、一般的なウィーナーフィルタを使用して合成されます。一般化ウィナーフィルタの両方のパラメータ抽出と実装の詳細については、我々はグスタフソンに読者を参照してください。ら 23と同じアルゴリズムが使用されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1149">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:143px;">Toptica</td>
			<td style="width:181px;">iBeam SMART</td>
			<td style="width:535px;">with digital modulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">561 nm laser</td>
			<td style="width:143px;">Coherent</td>
			<td style="width:181px;">OBIS LS</td>
			<td>with digital modulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">640 nm laser</td>
			<td style="width:143px;">Cobolt</td>
			<td style="width:181px;">MLD</td>
			<td>with digital modulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Long-pass dichroic mirrors&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td>for combining excitation beams</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Quad band dichroic mirror</td>
			<td style="width:143px;">Chroma</td>
			<td style="width:181px;">ZT405/488/561/640rpc</td>
			<td>3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Quad band dichroic mirror</td>
			<td style="width:143px;">Chroma</td>
			<td style="width:181px;">ZT405/488/561/640rpc</td>
			<td>From same batch as above, 25 x 25 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">1&#34; square kinematic mount</td>
			<td style="width:143px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:181px;">58-860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Glan-Taylor calcite polarizers</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">GT5-A</td>
			<td>For alignment of LCVR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Glan-Taylor mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">SM05PM5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Achromatic half wave plate</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AHWP05M-600</td>
			<td>400 - 800 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotation cage mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CRM1/M</td>
			<td>For HWP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Liquid Crystal Variable Retarder</td>
			<td style="width:143px;">Meadowlark Optics</td>
			<td style="width:181px;">SWIFT</td>
			<td>Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">LCVR controller</td>
			<td style="width:143px;">Meadowlark Optics</td>
			<td style="width:181px;">D3060HV</td>
			<td>Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Achromatic quarter wave plate</td>
			<td style="width:143px;">Meadowlark Optics</td>
			<td style="width:181px;">AQM-100-0545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotation cage mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CRM1P/M</td>
			<td>For QWP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">10 mm achromatic doublet</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AC080-010-A-ML</td>
			<td>For beam expander</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">200 mm achromatic doublet</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>For beam expander</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Cage XY Translators</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Ferroelectric spatial light modulator</td>
			<td style="width:143px;">Forth Dimension Displays</td>
			<td style="width:181px;">M0787-00249&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1280 x 1024 pixels, with driver board</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">SLM mounting frame</td>
			<td style="width:143px;">Forth Dimension Displays</td>
			<td style="width:181px;">M0787-10014</td>
			<td>Fixed to custom built aluminium mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">&#216;50.8 mm Gimbal Mirror Mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">GM200/M</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">XYR1/M</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rail carrier</td>
			<td style="width:143px;">Newport</td>
			<td style="width:181px;">M-PRC-3</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Precision Optical Rail</td>
			<td style="width:143px;">Newport</td>
			<td style="width:181px;">PRL-6</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">300 mm achromatic doublet lens</td>
			<td style="width:143px;">Qioptiq</td>
			<td style="width:181px;">G322 273 322&#160;</td>
			<td>f = 300 mm, 31.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">140 mm achromatic doublet lens</td>
			<td style="width:143px;">Qioptiq</td>
			<td style="width:181px;">G322 239 322</td>
			<td>f = 140 mm, 31.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Precision XY Translation Mounts</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">LM2XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Lens Mounting Adapters</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">SM2AD32</td>
			<td>For mounting 31.5 mm lenses in 2&#34; mounts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Translation stages</td>
			<td style="width:143px;">Comar</td>
			<td style="width:181px;">12XT65</td>
			<td>Dovetail, side drive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">XY Translator with Differential Drives</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">ST1XY-D/M</td>
			<td>for spatial filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotation cage mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CRM1/M</td>
			<td>for spatial filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">300 mm achromatic doublet</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AC508-300-A-ML</td>
			<td>Excitation tube lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Automated XY stage with Z-piezo top plate</td>
			<td style="width:143px;">ASI</td>
			<td style="width:181px;">PZ-2150-XYFT-PZ-IX71&#160;</td>
			<td>with MS-2000 controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Inverted microscope frame</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:181px;">IX-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Objective lens</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:181px;">UAPON100XOTIRF</td>
			<td>100X/1.49NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">High speed filter wheel</td>
			<td style="width:143px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:181px;">HF110A</td>
			<td>with Prior ProScan III controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Bandpass emission filters</td>
			<td style="width:143px;">Semrock</td>
			<td style="width:181px;">FF01-525/30, FF01-676/29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:143px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:181px;">ORCA Flash v4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Stage top incubator</td>
			<td style="width:143px;">OKO Lab</td>
			<td style="width:181px;">H301-K-FRAME</td>
			<td>For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Stainless steel optical posts</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">TR series</td>
			<td>for mounting optical components</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Post holders</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">PH series</td>
			<td>for mounting optical components</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Kinematic mirror mounts</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">KM100</td>
			<td>for mounting 1&#34; mirrors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Shearing interferometer</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">SI100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">100 nm fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">T-7279</td>
			<td>Tetraspeck</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:143px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">83697-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">8 well glass bottom dishes</td>
			<td style="width:143px;">ibidi</td>
			<td style="width:181px;">80827</td>
			<td>with #1.5 coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">155409</td>
			<td>with #1.5 coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">0.01mm microscope reticle slide</td>
			<td style="width:143px;">EMS</td>
			<td style="width:181px;">68039-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">C10613</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to structured illumination tirf microscopy at high speed with multiple colors

構造化照明顕微鏡（SIM）と光学的に超解像イメージングは​​、化学および生物医学科学の分子レベルでのプロセスの可視化のためのキーテクノロジーです。商用SIMシステムが利用可能であるが、カスタム商用システムを上回ることができ、実験室で設計されているシステムでは、後者は、典型的には、イメージングの忠実度と速度の点で両方、使用および汎用アプリケーションを容易にするために設計されました。この記事では、全反射（TIR）照明を使用し、100nmでの到達分解能で3色で最大10 Hzで撮像が可能であるSIMシステムを構築するための綿密なガイドを提示します。 SIMとTIRFの組み合わせに、システムは、ライバルの技術よりも優れた画像コントラストを提供します。これらの仕様を達成するために、いくつかの光学要素は、すべての利用可能な励起WAVする照明光の偏光状態と空間構造上の自動制御を可能にするために使用されていますelengths。ハードウェア実装および制御の詳細は、励起光パターン生成、波長、偏光状態、および最大の取得フレームレートを達成することに重点を置いてカメラ制御との間の同期を達成するために与えられています。システムのアライメントおよびキャリブレーションのためのステップバイステップのプロトコルが提示され、達成可能な解像度の向上は、理想的な試験サンプルで検証されています。ビデオレートの超解像画像化する能力は、生きた細胞を用いて実証されています。

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A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

複数の色で高速構造化照明TIRF顕微鏡のガイド

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

a-guide-to-structured-illumination-tirf-microscopy-at-high-speed-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.0K ビュー.  University of Cambridge. This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

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Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

シルバーシード媒介成長法によるゴールドNanostarの合成

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

生物工学

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

ハイスループットマイクロカプセル化シングルセルと複数セル

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

マルチアングル照明とピクセル超高解像度を採用しLensfreeオンチップ·トモグラフィー顕微鏡

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, enabling the visualization of large macromolecular machines, such as adhesion complexes, as well as higher-order structures, such as the cytoskeleton and cellular organelles in their respective cell and tissue context. Given the inherent complexity of cellular volumes, it is essential to first extract the features of interest in order to allow visualization, quantification, and therefore comprehension of their 3D organization. Each data set is defined by distinct characteristics, e.g., signal-to-noise ratio, crispness (sharpness) of the data, heterogeneity of its features, crowdedness of features, presence or absence of characteristic shapes that allow for easy identification, and the percentage of the entire volume that a specific region of interest occupies. All these characteristics need to be considered when deciding on which approach to take for segmentation.
The six different 3D ultrastructural data sets presented were obtained by three different imaging approaches: resin embedded stained electron tomography, focused ion beam- and serial block face- scanning electron microscopy (FIB-SEM, SBF-SEM) of mildly stained and heavily stained samples, respectively. For these data sets, four different segmentation approaches have been applied: (1) fully manual model building followed solely by visualization of the model, (2) manual tracing segmentation of the data followed by surface rendering, (3) semi-automated approaches followed by surface rendering, or (4) automated custom-designed segmentation algorithms followed by surface rendering and quantitative analysis. Depending on the combination of data set characteristics, it was found that typically one of these four categorical approaches outperforms the others, but depending on the exact sequence of criteria, more than one approach may be successful. Based on these data, we propose a triage scheme that categorizes both objective data set characteristics and subjective personal criteria for the analysis of the different data sets.

The bottleneck for cellular 3D electron microscopy is feature extraction (segmentation) in highly complex 3D density maps. We have developed a set of criteria, which provides guidance regarding which segmentation approach (manual, semi-automated, or automated) is best suited for different data types, thus providing a starting point for effective segmentation.

ボクセルからの知識へ：複雑な電子顕微鏡3D-データのセグメンテーションの実用ガイド

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

トラクション力顕微鏡用の細胞培養表面近くのローカライズレポーター蛍光ビーズのための新しい方法

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

ブリルアン散乱分析用高速サブGHzの分光

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in medical diagnostics, and for life detection by robotic missions to other planets and moons of the solar system. Currently, sparse bacterial samples are counted by culture plating or epifluorescence microscopy. Culture plates require long incubation times (days to weeks), and epifluorescence microscopy requires extensive staining and concentration of the sample. Here, we demonstrate how to use off-axis digital holographic microscopy (DHM) to enumerate bacteria in very dilute cultures (100-104 cells/mL). First, the construction of the custom DHM is discussed, along with detailed instructions on building a low-cost instrument. The principles of holography are discussed, and a statistical model is used to estimate how long videos should be to detect cells, based on the optical performance characteristics of the instrument and the concentration of the bacterial solution (Table 2). Video detection of cells at 105, 104, 103, and 100 cells/mL is demonstrated in real time using un-reconstructed holograms. Reconstruction of amplitude and phase images is demonstrated using an open-source software package.

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Digital holographic microscopy (DHM) is a volumetric technique that allows imaging samples 50-100X thicker than brightfield microscopy at comparable resolution, with focusing performed post-processing. Here DHM is used for identifying, counting, and tracking microorganisms at very low densities and compared with optical density measurements, plate count, and direct count.

デジタル ホログラフィー顕微鏡 (DHM) を用いた低濃度で微生物の定量化

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used method, but has the drawback that it requires fluorescent labeling, which can interfere with the activity of the molecules. Also, photobleaching and photodamage are concerns. In the case of microtubules, we have found that images of similar quality to TIRF can be obtained using interference reflection microscopy (IRM). This suggests that IRM might be a general technique for visualizing the dynamics of large biomolecules and oligomers in vitro. In this paper, we show how a fluorescence microscope can be modified simply to obtain IRM images. IRM is easier and considerably cheaper to implement than other contrast techniques such as differential interference contrast microcopy or interferometric scattering microscopy. It is also less susceptible to surface defects and solution impurities than darkfield microscopy. Using IRM, together with the image analysis software described in this paper, the field of view and the frame rate is limited only by the camera; with a sCMOS camera and&#160;wide-field&#160;illumination&#160;microtubule length can be measured with precision up to 20 nm with a bandwidth of 10 Hz.&#160;

This protocol is a guide for implementing interference reflection microscopy on a standard fluorescence microscope for label-free, high-contrast, high-speed imaging of microtubules using in vitro surfaces assays.

微小管のラベルフリー高速イメージングのための干渉反射顕微鏡の実装

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

複数の色で高速構造化照明TIRF顕微鏡のガイド

要約

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シルバーシード媒介成長法によるゴールドNanostarの合成

ハイスループットマイクロカプセル化シングルセルと複数セル

マルチアングル照明とピクセル超高解像度を採用しLensfreeオンチップ·トモグラフィー顕微鏡

ボクセルからの知識へ：複雑な電子顕微鏡3D-データのセグメンテーションの実用ガイド

トラクション力顕微鏡用の細胞培養表面近くのローカライズレポーター蛍光ビーズのための新しい方法

ブリルアン散乱分析用高速サブGHzの分光

Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

デジタルホログラフィー顕微鏡 (DHM) を用いた低濃度で微生物の定量化

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

微小管のラベルフリー高速イメージングのための干渉反射顕微鏡の実装

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デジタル ホログラフィー顕微鏡 (DHM) を用いた低濃度で微生物の定量化

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