スピニングディスク TIRF 顕微鏡は、細胞骨格ネットワーク形成中のタンパク質の役割を研究するのに有用なツールです。この技術により、細胞内で起こる高速細胞アプローチの3次元イメージングが可能となり、同時に、細胞膜に配置された蛍光分子の正確な局在化が可能になった。この方法は、微生物学、細胞生物学、および細胞膜と細胞環境との相互作用を研究することが重要なすべての枝のような研究分野に洞察を提供することができます。
この方法は、細胞膜内の構造を局所化することが重要であり、残りの細胞容積の高解像度を維持したいライブイメージング実験に拡張することができます。考慮しなければならない重要なことは、TIRF照明および他のイメージングパラメータを設定し、トランスフェクトされた細胞の焦点を見つけるために適切な細胞ラインの選択である。このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは、画像取得時のセルの処理に関する問題を避けるのに役立ちます。
実験の2日前に、6ウェル細胞培養プレートの各ウェルに完全増殖培地の2ミリリットルの種子3,000 HELAまたはNIH 3T3細胞。翌日、トランスフェクション試薬を準備します。まず、RFPリバクトのマイクログラム1個とYFPヴィンクリン1マイクログラムを、合計200マイクロリットルの減らされた血清培地で希釈します。
トランスフェクション試薬を短時間ボルテックスする。その後、混合物の4マイクロリットルを200マイクロリットルのDNAに加える。再度試薬をボルテックスし、室温でトランスフェクションミックスを15~20分間インキュベートします。
インキュベーション後、トランスフェクションミックス全体を直接細胞に滴下して追加します。プレートを振って井戸を混ぜ、インキュベーターに戻します。実験当日、まず35ミリメートルガラス底皿をPBSでフィブロネクチンの1ミリリットル当たり10マイクログラムでコーティングして、ライブイメージング用のサンプルを準備します。
ガラス表面に溶液を室温で30分間放置し、取り除き、皿の空気を乾燥させます。次に、直径0.1ミクロンのマルチ蛍光ビーズ溶液を蒸留水中の1ミリリットル当たり18億粒子の密度に希釈します。フィブロネクチンコーティングガラス表面に30〜60秒間溶液を加えます。
その後、溶液を取り出し、皿の空気を乾燥させます。蛍光ビーズで皿のプレコーティングは、細胞を播種する前にTIRF平面を見つけたい場合、または画像登録のための2色のビーズ画像を取得したい場合、2つの理由でのみ必要です。次に、0.1モルアスコルビン酸溶液を最終濃度の0.1ミリモルで増殖培地に添加することにより、抗酸化成長培地を調製する。
37°Cの水浴に入れ、培地を予熱します。次に、2ミリリットルのPBSで細胞を洗い、プレートの各ウェルに250マイクロリットルのトリプシンEDTAを加えます。37°Cで細胞をインキュベートし、細胞が完全に切り離されるまで2〜3分待ちます。
細胞を1ミリリットル前から添加した抗酸化成長培地に慎重に再懸濁し、15ミリリットルの細胞培養チューブに培地の4ミリリットルを加えます。セル懸濁液をわずかに開いた蓋を5%の二酸化炭素で緩衝した摂氏37度に設定したインキュベーターに入れます。まず、顕微鏡の環境制御を開始し、安定した細胞培養条件を達成します。
次に、予熱した顕微鏡のサンプルホルダーに、1ミリリットルの前温化抗酸化成長培地を含むガラス底皿を入れます。次に、撮像ソフトウェアで、顕微鏡で取得設定を行う。取得時間間隔を 30 秒、継続時間を 60 ~ 90 分に設定します。
また、値を 1 に設定して、各時間のハードウェアベースのオートフォーカスの自動焦点機能をアクティブにします。カメラの露出を 200 ミリ秒、ゲイン レベルを 500 に、レーザーパワーを各チャンネルに 20% に調整します。高いゲインレベル、低露出時間、低レーザーパワーは、光毒性を低減するために推奨されます。
次に、回転するディスク チャネルの Z スタックを 0.4 ミクロンの間隔で 10 ミクロンに設定し、下のオフセットをゼロに設定して、最も低い面がハードウェアオートフォーカスのフォーカス位置になり、TIRF チャネルの Z スタックを非アクティブにします。最後に、マルチポイント関数ステージポジションをアクティブにします。これにより、30秒間隔で最大3つのポジションを記録できます。
ここで、蛍光光灯を持つ蛍光ビーズを見つけ、1つのTIRFチャンネルをアクティブにし、TIRF照明を示す値に照明角度を設定します。次に、顕微鏡パネルのボタンを押してオートフォーカスをアクティブにし、オフセットホイールでフォーカスを調整します。フォーカスが入ったら、TIRF 488 と TIRF 561 を使用して 2 色のデータ・セットを獲得し、後続のビード・ベースのイメージ登録を行います。
培養器から細胞を取り出し、閉じたチューブを2~3回反転して細胞懸濁液を混合する。次に、細胞の1ミリリットルをイメージング皿に塗布する。低レベルの蛍光照明を持つ二重のトランスフェクトされた細胞を素早く見つけます。
見つかったら、明視野照明を使用してライブカメラプレビューでセルを中央に配置し、位置をマークします。次に、目的の追加の 1 ~ 2 つのポイントを見つけ、それらを職位リストに保存し、シーケンス ボタンをクリックしてデータ取得を開始します。最初は、ステージの動きのために細胞を簡単に取り外すことができるので、4~5つのポジションを設定し、後で1つまたは2つを破棄することをお楽しめます。
フィジーで登録フリーのハイパースタックを生成するために、まず、提供されたファイルSD-TIRF_helper_joveをダウンロードして保存してください。フィジーサブフォルダマクロの ijm。メニューコマンドをクリックしてマクロを実行し、プラグインからマクロを始め、最後に実行します。
カラーチャンネルで登録補正が必要な場合は、オプションを選択し、ランドマークファイルと呼ばれる新しいビードベースの登録参照を作成します。次に、バイオフォーマットインポーターでデータをインポートし、表示オプションとしてハイパースタックを選択します。画像データセットをロードし、第1ステップで回転ディスクシリーズを選択し、第2ステップでTIRFシリーズを選択します。
この時点で、フィジーはチャネルとステージ位置で並べ替えられたデータを表示します。所定のランドマークファイルをロードして、登録補正を各チャンネルに適用します。次に、回転するディスクと TIRF チャネルごとに目的の色参照テーブルを選択し、それらを単一の多次元ハイパースタックにマージします。
TIRF イメージの処理中に、いくつかの zed プレーンが下面に追加され、この数は回転するディスク・データ・セット内の平面の番号と一致します。これは、最終的なハイパースタックの視覚的表現にとって非常に重要です。このビデオで説明した設定を用いて、YFPおよびRFP発現細胞を選択し、60分間のタイムラプスの間にそれらの接着プロセスを観察した。
予想通り、細胞は丸い形をしており、最初は環境を感知し、基材に接触する膜突起で弱く付着しただけです。細胞マトリックス接触は、いわゆる新生接着の形成時に迅速に強化された。時間の経過とともに、接着複合体は拡大し、焦点付着に成熟した。
これらの細長い構造は、主に細胞の周辺で明らかであった。これは、アクチン繊維の束縛と同様に細胞マトリックス接着の強化を誘発するアクトミオシン繊維によって作用された力から生じた。また、アクチンネットワーク形成の結果として細胞が平坦化した。
取得速度は、次のパラメータ、時間間隔、露光時間、zed 平面の数、および位置数に依存します。したがって、高い取得率のためにこれらのパラメータを最適化することは非常に重要です。最新の回転ディスク技術の実装により、回転ディスクTIRF顕微鏡を新しい超解像度顕微鏡技術に変え、高い時間レートでイメージングを可能にします。
回転ディスク顕微鏡は、細胞内部と細胞膜の間で発生するプロセスを研究するための非常に強力な技術です。我々は、数秒以内に非常に大きな画像スタックを取得することによって、小胞のダイナミックに従うことができることが示されています。コリメートレーザー光は目にとって危険です。
ビームを直接見て、直接光の露出を避けるために、機器の安全上の注意を使用しないでください。
