この方法は、同じ顕微鏡を使用して超解像度画像やFRET画像を取る方法など、光学顕微鏡分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、3つの異なるイメージングモジュールを1つの顕微鏡に組み合わせることができ、全体的なコストを大幅に削減できることです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、励起経路の組み立てが学習しにくいため重要です。
それらは部品の適切な選択および敏感な光学的な直線を要求する。まず、PCIインターフェイスを介してデータ取得カードを取り付け、それを使用してレーザーをコンピュータに接続します。トランジスタ-トランジスタロジック出力によるレーザーのオン/オフ動作、およびこのカードのアナログ出力によるパワー調整を制御します。
次に、ここに示すように、それに付随するテキストプロトコルに記載されているように、鏡とビームスプリッターを備えた振動分離光学表を準備します。Z軸変換台にファイバーアダプタプレートを取り付けて、レーザービームをシングルモード光ファイバに組み合わせます。次に、ケージプレートに伴奏式ダブレットレンズを取り付けます。
アダプターとレンズを接続してケージを形成するために、延長棒を使用します。次に、1インチの厚い光ポストを使用して、光テーブルにケージを取り付けます。コンポーネントを調整して、ファイバーを通して最大のレーザー出力を得るようにして、647ナノメートルのレーザーを位置合わせします。
最初のレーザーのアライメントが完了したら、一時的に一対のアイリスを取り付け、残りのレーザーを1つずつ揃えます。パワーメーターを使用して、各レーザーのアライメント効率を確認します。レーザーの反射を減らすために、アダプタプレートの前に虹彩を1つ残してください。
次に、付属のテキストプロトコルに記載されているように、拡大レンズを設計して設置します。1つの分子のZ座標を抽出するのに必要な乱視効果を作り出すために、10メートルの焦点距離を持つ3Dレンズをカセットに入れ、それを放射ビーム経路に挿入します。連続多色蛍光イメージングの際の振動を最小限に抑えるには、顕微鏡の隣に接続されたバリアフィルターホイールに配置されたエミッションフィルタを使用します。
単一分子 FRET 実験中の同時多色検出では、別のフィルターセットをエミッション スプリッタに配置します。エピ励起を使用して回折限定画像撮影を設定するには、まず励起レーザーの付随角度を照明アームのエピモードに調整します。次に、3D レンズを外し、バイパス立方体を放出スプリッタに挿入します。
次に、広い照明用のマグレンズを挿入します。設定が完了したら、目的の結果に基づいて、マルチチャンネル、Zスタック、および/またはサンプルの時間経過画像を取得します。表面固定化分子の多色単分子検出を設定するには、まずフィルタホイールを空の位置に移動します。
これにより、レーザーが通過できるようになります。次に、励起レーザーの付随角度を芝の角度に調整し、マグレンズと3Dレンズの両方を外します。次に、まずバイパスキューブをキャリブレーションキューブに置き換えて、すべてのライトがすべてのチャネルを通過できるようにして、エミッション スプリッターで 3 チャンネル モードを調整します。
次に、DICの下でカメラをオンにし、3つの完全に分離されたチャネルが画面に表示されるまで、放出スプリッターの開口部を調整します。エミッションスプリッタの垂直水平調整コントロールノブを回し、3つのチャンネルを大まかに揃えます。次に、カメラの電源を切り、キャリブレーションキューブをトリプルキューブに置き換えます。
100ナノメートルのマルチチャンネルビーズのサンプルを配置します。488ナノメートルで励起すると、100ナノメートルのマルチチャンネルビーズは異なる波長の光を放出し、3チャンネルのアライメントを可能にします。次に、カメラと488ナノメートルのレーザーをオンにし、明るいビーズの1つをズームインし、最後に調整コントロールノブを再び回して3つのチャンネルを整列させます。
サンプルを配置し、弱いレーザーを使用して、妥当なスポット密度の領域に移動し、レーザーパワーと露出時間を調整して、許容可能な信号対雑音および光発光レベルを達成します。次に、イメージングソフトウェアを使用して、タイムラプス画像を撮影します。超解像度のイメージングの場合は、まず3Dレンズを挿入して、マグレンズを取り外します。
次に、最適な励起レーザーの付随角度を芝の角度に決定します。SRイメージングの適切な目標高さを求めるには、DICイメージングを使用して細胞の中間面を見つけます。セルが透明になる高さで平面を識別します。
目的の焦点面が決定されたら、超解像度イメージングを開始します。イメージング中に、405ナノメートルのレーザーのパワーを変え、点滅するスポットの適切な密度を維持します。バイオレットレーザーパワーなしでイメージングを開始します。
一定期間の点滅スポットの数をカウントし、ビューの分野でユーザー定義のカウントしきい値を超えて点滅スポットの数が維持されるように、バイオレットレーザーパワーを増加させます。イメージングフレーム内の各スポットの重心を検出してデータを分析し、X幅とY幅から各スポットのZ値を抽出します。再構築されたイメージを構築し、3D でオブジェクトを視覚化します。
この顕微鏡のセットアップは慣習的な蛍光イメージ投射、単分子検出ベースの超解像のイメージ投射および多色単一分子の検出を含む異なったイメージ投射方法間の適用範囲および再生可能な切り替えを可能にする。分子集合体の詳細を明らかにするために、超解像顕微鏡は、このような画像の数千を組み合わせたものです。これらの画像は、最終的な超解像度の画像を生成するために再構築されます。
超高解像度の手法では、空間解像度が高く、他のテクニックでは見ることができない詳細な情報を提供します。これは、ここに示す 2 つの画像で強調表示されます。超解像画像は、蛍光画像と同じ細菌調節RNaseを示していますが、単一分子検出を可能にします。
SmFRETは、ナノメートル分解能に対するオングストロームが可能な別の方法である。ここで、折り畳まれたRNA分子は、緑色ドナー色素と赤色のアクセプター色素で標識した。蛍光強度の軌跡は、個々の単一分子から抽出することができ、時間の関数としてFRET効率を生成する。
レーザーを使用すると危険な場合があり、眼の保護を着用したりレーザーパワーを下げたりするなどの予防措置は、常にこの手順を実行する場所で取られるべきであることを忘れないでください。
