We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).

1. C2C12細胞培養<ol><li> 20％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを補充した増殖培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））中で100mMのプレートでC2C12マウス筋芽細胞を維持します。 60％コンフルエント - C2C12継代細胞が約50になることを許可します。 </li><li>増殖培地を廃棄3 mLの室温のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でC2C12細胞を洗浄します。 PBSを削除し、細胞を剥離するために、500μlの0.25％トリプシン-EDTAを追加します。 5分- 37°C、3、5％CO 2インキュベーターでプレートを置きます。 </li><li> 3mlの増殖培地を添加することによりトリプシンを中和します。細胞を懸濁するために8回 - 6ピペット。新規の100mmプレートに懸濁させ、細胞1 mlを加え、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 </li></ol> 2. C2C12細胞トランスフェクション/形質導入および選択<ol><li> C2C12のプラスミドトランスフェクション<ol><li>トランスフェクション前、pまで24時間各トランスフェクションのための6ウェルプレートの1ウェルに遅れて7.0×10 5 C2C12細胞。 注：これは50につながる - トランスフェクションの時点で60％コンフルエンス。 </li><li>トランスフェクション試薬は使用前に室温に戻します。 </li><li>簡単に予熱した無血清培地と渦を200μlにプラスミドDNA（GFP-CUG5またはGFP-CUG200）2μgのを追加します。培地に6μlのトランスフェクション試薬を加え、ボルテックスを用いて30秒間、すぐに混ぜます。室温で30分間混合物をインキュベートします。 </li><li> 2.5ミリリットルの無血清増殖培地にC2C12細胞のメディアを変更します。インキュベーション後、細胞にトランスフェクション混合物を追加します。 5％CO 2、37℃のインキュベーターにプレートを返します。 </li><li> 4時間または一晩までのトランスフェクション混合物/無血清増殖培地中で細胞を保管してください。翌日バック増殖培地へのメディアを変更するか、または細胞傷害性は明らかであるとき。 注：細胞毒性は、CEの顕微鏡検査によって評価されますLLS。細胞の形態と細胞の剥離の変化を観察します。限り、明白な細胞毒性がないように、無血清増殖培地中で一晩インキュベートし、トランスフェクションを増強します。 </li><li> （プラスミドなしでトランスフェクト）コントロール培養物は、生細胞を持っていないまで、10日〜のために1.6mg / mlのG418 - 1.2を追加することによって、細胞をトランスフェクション後48時間を選択します。 G418を補充した成長培地で2日毎に培地を変更します。 </li><li>その後の実験のために、37℃で増殖培地および5％CO 2でG418耐性細胞を維持します。 </li></ol></li><li>レトロウイルスの調製およびC2C12レトロウイルス形質導入<ol><li> 10％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含むDMEM高グルコースを補充することによりHEK 293培地を準備します。 <ol><li>約24時間のトランスフェクションの前に、100ミリメートルプレート（トランスフェクション80％コンフルエンス）に4.0×10 6エコトロピックHEK 293ベースのパッケージング細胞をプレートContaining細胞培養培地。 </li></ol></li><li>トランスフェクション試薬は使用前に室温に戻します。 </li><li> 1ミリリットルの無血清増殖培地中で15μgのプラスミドDNA（のpMSCV-PuroのかのpMSCV-Celf1Flag-プーロ）を混ぜます。簡単にボルテックス。 DNA /無血清増殖培地チューブにステップ2.2.2から30μlのトランスフェクション試薬を追加し、ボルテックスを用いてよく混ぜます。室温で30分間混合物をインキュベートします。 </li><li>エコトロピックHEK 293ベースのパッケージング細胞にトランスフェクション混合物の滴下を追加します。静かにプレートを旋回し、5％CO 2、37℃のインキュベーターに戻し、それらを返します。 24時間後、10ミリリットル予め温めた新鮮な増殖培地にメディアを変更します。 </li><li>上清（含むレトロウイルス）ピペットを用いてトランスフェクションの48時間後に収穫し、50mlの遠心チューブに上清を移します。プレートに新しい暖かいメディアの10ミリリットルを加え、インキュベーターに戻します。 4℃で上清を保管してください。 注：メディアはトンに静かに追加されます彼は井戸の側細胞単層を破壊しないように。 </li><li>トランスフェクション後の上清60時間の第二のバッチを収穫し、2.2.5からの上清と、それをプールします。細胞破片を除去するために7分間500×gで、4℃で遠心分離します。 </li><li>新しい50ミリリットルの遠心管に上清を移します。 2.2.9またはアリコートに進み、将来の使用のために-20℃で上清を保存するために進むことによって、この時点でC2C12細胞を形質導入するためにレトロウイルスを使用してください。 </li><li>凍結ストックがここで使用されている場合、室温で2.2.7からレトロウイルスを解凍します。 注：複数の凍結融解の繰り返しは避けてください。 </li><li>合流の40％ - 30を目指し伝達の同じ日にC2C12細胞をプレート。 <ol><li>増殖培地を捨て、3ミリリットルの室温PBSでC2C12細胞を洗います。 PBSを削除し、500μlの0.25％トリプシン-EDTAを追加し、37°C、3、5％CO 2インキュベーター内でプレートをインキュベートする- 5分。 </li><li> 3ミリリットルの成長MEDを追加することにより、トリプシンを中和イウム。細胞を懸濁するために8回 - 6ピペット。血球計数器を用いて細胞を数え、60ミリメートルプレートに8.0×10 5 C2C12細胞を追加します。 </li></ol></li><li> 3ミリリットル成長培地中の細胞の1 60ミリメートルプレートを感染させるために0.5ミリリットルレトロウイルスを追加します。インキュベーターにプレートを返します。 </li><li> （ - 3 / mlのピ​​ューロマイシン1）感染後48時間で3ミリリットル選択抗生物質を補った新鮮な培地と交換してください。形質導入されていないC2C12制御文化が出て死ぬまで〜5日間、毎日抗生物質を含む培地3ミリリットルを交換してください。 </li></ol></li><li>レンチウイルスの調製およびC2C12のレンチウイルス形質導入 注：バイオセーフティレベル2キャビネット内のすべてのレンチウイルス関連の手順を実行し、生物学的安全性のガイドラインに従ってください。ウイルスを含有する液体廃棄物は、廃棄前に消毒する必要があります。 <ol><li> 10％の胎児を補充したHEK 293細胞培地（DMEM高グルコース100ミリメートルプレート（〜トランスフェクションの日に80％コンフルエント）でプレート4.0×10 6個の293T細胞を、ウシ血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミン）トランスフェクション前に24時間。 </li><li>室温へのトランスフェクション試薬を温めます。 8μgのレンチウイルス導入ベクターと一緒にレンチウイルスパッケージングベクター（4μgのpMD2.Gと6μgのpsPAX2）ミックス（Celf1のshRNAをまたは対照shRNAをスクランブル）1ミリリットルの無血清細胞培養培地中。簡単にボルテックス。 </li><li> DNA / DMEMチューブに36μlの予熱したトランスフェクション試薬を加え、ボルテックスでよく混ぜます。室温で30分間混合物をインキュベートします。 </li><li>インキュベーターから293T細胞を除去し、プレートにトランスフェクション混合物を追加します。静かにプレートを旋回し、戻って5％CO 2、37℃インキュベーターにそれを返します。 24時間後、10ミリリットルの新鮮な培地でトランスフェクション混合物を交換してください。 </li><li>トランスフェクション後にレンチウイルスの48時間を含む上清を収集し、50ミリリットルの遠心分離管にそれを転送します。プレートに10ミリリットル新しい暖かいメディアを追加し、それを返しますインキュベーターへ。 4℃で上清を保管してください。 </li><li>トランスフェクション後の上清60時間の第二のバッチを収集し、2.3.5からの上清とそれを組み合わせます。 7分間500×gで、4℃で遠心分離簡単。 </li><li>新しい50ml遠心管に上清を移します。新鮮なウイルスを使用している場合は、2.3.9に進みます。将来の使用のために、店舗の10ミリリットルの分注して-20℃で上清をウイルス含有。 </li><li>凍結ストックが使用される場合、使用前に室温2.3.7からウイルスを解凍。 注：複数の凍結融解の繰り返しは避けてください。 </li><li> （2.1節）で得られたプレートC2C12-CUG200細胞の形質導入の同じ日に2.2.9で説明したように。 注：30を目指して - コンフルエンスの40％。 </li><li> C2C12-CUG200の60ミリメートルプレートに感染し、インキュベーターにプレートを返すために、0.5ミリリットルのウイルスを追加します。 </li><li>形質導入後72時間 - 選択抗生物質（3 / mlのピ​​ューロマイシン1）を補った新鮮な培地と培養液を交換してください。すべての形質導入されていないC2C12-CUG200制御文化が出て死ぬまで〜5日間の選択抗生物質で培養培地を毎日更新します。 </li><li> GFP-CUG200トランスフェクションした細胞でCelf1ノックダウンを確認するために、ウエスタンブロットを使用してください。 </li></ol></li></ol> 3. C2C12細胞の分化<ol><li>プレート分化の開始前に、2.5ミリリットルの増殖培地24時間で6ウェルプレートの1ウェル中の2×10 6個の細胞。 注：完全なコンフルエンスが24時間で達成されるように、プレーティング密度を調整することができます。 <ol><li> PBSでコンフルエント細胞をリンスし、低血清分化培地2.5 mLを加え（2％ウマ血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、および1μMインスリン） 。 2日毎に培地を交換してください。 注：凍結ストックのインスリンを保持し、各培地交換時にメディアに追加します。 </li></ol></li><li> C2C12分化の間に、泉のためのサンプルを収集titative以下の時点でのRT-PCR（セクション4を参照してください）​​：Day0、1、2、4、6日目に免疫染色のための培養6.プロセス - 8（第5節参照）。 </li></ol> 4. RNAの単離および定量的RT-PCR <ol><li> RNA単離のために、製造業者のプロトコルを使用してください。単離後、30μlのRNaseフリー水でRNAペレットを再懸濁し、上下に数回をピペットと。 注：サンプルは、定量的RT-PCRに進むか、または-80℃で保存することができます。 </li><li>定量的RT-PCR 10のためのRT定量PCRキットを使用し、製造元の指示に従ってください。 表1に従って反応ミックスを調製します。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 成分 </td><td> 容量（μL） </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> 2×反応緩衝液</td><td> 10 </td><td> 1倍</tD&gt; </tr><tr><td>フォワードプライマー</td><td> 0.5 </td><td> 200 nMの</td></tr><tr><td>リバースプライマー</td><td> 0.5 </td><td> 200 nMの</td></tr><tr><td>プローブ</td><td> 0.5 </td><td> 200 nMの</td></tr><tr><td>転写酵素＆RNアーゼ阻害剤を逆に</td><td> 0.1 </td><td> 0.25 U / mlの</td></tr><tr><td>テンプレート</td><td> 1 </td><td> 100 ngの全RNA </td></tr><tr><td> RNaseを含まない水</td><td> 7.4 </td><td> NA </td></tr><tr><td>合計ミックス</td><td> 20 </td><td></td></tr></tbody></table> 表1定量的RT-PCRマスターミックス調製 <ol start="3"><li>熱プロファイルの表2を用いて、20μlのRT-qPCRの反応を実行します。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>逆転写ステップ</td><td> 30分間、48°C </td></tr><tr><td> DNAポリマーアーゼ活性化/逆転写酵素の不活化</td><td> 10分間、95°C </td></tr><tr><td rowspan="2"> 40サイクル</td><td> 15秒、95°C </td></tr><tr><td> 1分、60°C </td></tr></tbody></table> 表2の定量的RT-PCR温度プロファイル 5.免疫染色<ol><li>たて10分間室温で4％パラホルムアルデヒド/ PBSを用意し2.5ミリリットルで単層培養を修正しました。 </li><li>室温で30分間、2.5 mlの0.1％トリトンX-100 / PBSで試料を透過。 </li><li>加湿チャンバーにサンプルを転送します。 37℃で30分間、緩衝液（0.1％の非イオン性界面活性剤/ PBS、10％正常ヤギ血清）でブロッキング2.5 ml中にサンプルを遮断します。 </li><li>ブロッキングバッファーを捨て、バッファ（1：100）をブロックで希釈したミオシン重鎖に対して800μlの一次抗体を適用します。室温で一晩加湿チャンバー内でインキュベートします。 </li><li>プレート3ティムを洗います2日目に2.5ミリリットルの洗浄緩衝液（0.1％ポリソルベート20 / PBS）とエス（各10分）。 </li><li>洗浄バッファーを削除し、800μlの二次抗体（ヤギ抗マウスIgG、1：PBSで希釈した500）を適用します。 1時間室温で加湿チャンバー内でインキュベートします。 </li><li> 2.5ミリリットル洗浄緩衝液で2回（各10分）を洗浄します。 </li><li> 5分間（1μgの/ mlの蒸留脱イオンH 2 Oで希釈）800μlのDAPIと共にインキュベートします。 </li><li> 10分間再び2.5ミリリットルの洗浄緩衝液で洗浄します。 </li><li> 2.5ミリリットルのPBSに洗浄緩衝液を変更し、イメージをキャプチャするために、蛍光顕微鏡を使用しています。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

C2C12細胞株は、筋形成11-14を研究するためのモデルとして使用されてきました。これらの細胞は、線維芽細胞様の外観を保持し、20％ウシ胎児血清を含む培地中で急速に増殖し、容易に2％ウマ血清15を含む培地中で分化します。速い増殖および分化は、筋形成細胞モデルにおいて有利な特性です。ここでは、C2C12細胞にcDNAを、3&#39;-UTR、およびshRNAをを導入するプラスミド、レ?...

筋強直性ジストロフィー（DM）は、複数のシステム、最も特に心臓および骨格筋1に影響を与える常染色体優性疾患です。この病気、DM1とDM2の2つのサブタイプがあります。 DM1は、より一般的であり、DM2 2よりも深刻な症状を持っています。 DM1の根底にある遺伝的変異は、DMプロテインキナーゼ遺伝子（DMPK）3の3 &#39;非翻訳領域（UTR）に位置するCUGトリプレットリピートの拡大です。影響を受けていない個体でのCUG繰り返し数は対照的に、5から37まで変化し、それが50以上に、そして時にはDM1患者4で数千にまで増加します。その結果、のようなRNA結合タンパク質、マッスルのような1（MBNL1）、CUGBP、及びELAV様ファミリー1（Celf1）、誤調節されています。拡大CUGリピート上の隔離に、MBNL1は、選択的スプライシング5を調節する能力を失います。 Celf1が、一方、6,7アップレギュレートされています。 Celf1の過剰発現は、筋肉の損失に関連付けられていますMBNL1機能の喪失に起因しておらず、衰弱、。 DMPK 3&#39;-UTR CUG拡張、MBNL1の損失、およびCelf1の過剰発現を含むDM1​​関連の変化をシミュレートする動物モデルは、確立されています。しかし、筋芽細胞にDM1をモデル化することは、特にDM1に関連する細胞および分子事象を解剖するために、効率的な代替手段を提供しています。 C2C12筋芽細胞株は、最初に負傷したC3Hマウスの筋肉から単離され、広く筋原性分化8,9を研究するために使用しました。 C2C12細胞は急速にウシ胎児血清（FBS）培地を含有して増殖し、容易にFBSが枯渇したとき分化を受けます。しかし、この筋芽細胞分化モデルを使用して2つの課題を提示する：C2C12細胞は、多くの場合、遺伝子導入/形質導入、ウイルスに対して耐性です。および細胞取り扱いおよび分化手順のわずかな変動は、筋管形成の著しい変化につながることができます。 私たちの研究室では、日常的に交流としてC2C12筋芽細胞を使用していますエル・モデルと効果的C2C12細胞株10へのプラスミドのトランスフェクション、レトロウイルス形質導入、およびレンチウイルス形質導入によって遺伝子を送達プロトコルを開発しました。ビデオでは、我々は/トランスフェクトC2C12細胞に形質導入​​し、DM1の筋芽細胞モデルの確立に分化一貫性を維持するための最適化された手順を示しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="804">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, high glucose</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">11965-084</td>
			<td style="width:325px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum - Premium</td>
			<td style="width:112px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:151px;">S11150</td>
			<td>for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">10378-016</td>
			<td>for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin from bovine pancreas</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">I6634-100MG</td>
			<td>for differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">equine serum</td>
			<td style="width:112px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:151px;">S12150</td>
			<td>for differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FuGENE&#160;HD&#160;Transfection Reagent</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">E2311&#160;</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">G418 sulfate&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Gold Biotechnology&#160;</td>
			<td style="width:151px;">G-418-10</td>
			<td>for drug resistant selection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">sc-108071</td>
			<td>for drug resistant selection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0323BOX</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP00061</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0002</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m</td>
			<td style="width:112px;">GE healthcare life science</td>
			<td style="width:151px;">10600015</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MF 20</td>
			<td style="width:112px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:151px;">MF 20</td>
			<td>primary Ab for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate</td>
			<td style="width:112px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">T-862</td>
			<td>secondary Ab for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">One step qRT-PCR MasterMix</td>
			<td style="width:112px;">AnaSpec</td>
			<td style="width:151px;">05-QPRT-032X</td>
			<td>for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TriPure Isolation Reagent</td>
			<td style="width:112px;">Roche</td>
			<td style="width:151px;">11667165001</td>
			<td>for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CUG-BP1 Antibody (3B1)</td>
			<td style="width:112px;">santa cruz</td>
			<td style="width:151px;">sc-20003</td>
			<td>primary Ab western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Actin Antibody</td>
			<td style="width:112px;">santa cruz</td>
			<td style="width:151px;">sc-1615</td>
			<td>goat polyclonal IgG for loading control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">293T Ecopack</td>
			<td style="width:112px;">Clontech</td>
			<td style="width:151px;">631507</td>
			<td>cells for retrovirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pMSCV-puro</td>
			<td style="width:112px;">Clontech</td>
			<td style="width:151px;">634401</td>
			<td>empty retroviral vector for retrovirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pMSCV-Celf1Flag-puro</td>
			<td style="width:112px;">house-constructed</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">psPAX2</td>
			<td style="width:112px;">gift from Didier Trono</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>for lentivirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pMD2.G</td>
			<td style="width:112px;">gift from Didier Trono</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>for lentivirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GFP-CUG5</td>
			<td style="width:112px;">gift from M.S. Mahadevan</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>details in reference 10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GFP- CUG200</td>
			<td style="width:112px;">gift from M.S. Mahadevan</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>details in reference 10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton&#160;X-100</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">X100</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P6148</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TWEEN&#160;20</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P9416</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D9542</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling myotonic dystrophy 1 in c2c12 myoblast cells

筋強直性ジストロフィー1（DM1）は、筋ジストロフィーの一般的な形式です。いくつかの動物モデルは、DM1のために確立されてきたが、彼らは細胞および分子事象を研究するための効率的な細胞の代替を提供するので、筋芽細胞モデルは依然として重要です。 C2C12筋芽細胞は広く遺伝子トランスフェクション、またはウイルス形質導入に筋形成、抵抗性を研究するために使用されているが、C2C12細胞の研究を妨げています。ここでは、C2C12筋芽細胞および筋細胞分化の誘導に遺伝子を導入するために日常のメンテナンス、トランスフェクションおよび形質導入手順が含まれて最適化されたプロトコルを記述します。まとめると、これらの手順は、最高のトランスフェクション/形質導入効率を可能にするだけでなく、一貫性の分化の結果。筋緊張性ジストロフィーの研究だけでなく、他の筋肉疾患に利益をもたらすDM1筋芽細胞モデルの確立に記載されているプロトコル。

C2C12細胞を、GFP-CUG5またはGFP-CUG200でトランスフェクトしました。薬剤耐性の選択の後、安定したプールは、GFP発現（ 図1A）によって可視化することができる、確立しました。分化した筋芽細胞における筋管形成は、10（ 図1B）を免疫染色重鎖ミオシンによって検出しました。筋管形成の定量化は、融合指数は2.6±1.1％に35.4±4.1％から減...

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Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

このプロトコルでは、我々は、最適化されたC2C12細胞の維持、遺伝子トランスフェクション/形質導入、および筋細胞分化を含む、筋緊張性ジストロフィー1筋芽細胞モデルを確立する手順を提示します。

C2C12筋芽細胞における筋強直性ジストロフィー1のモデル化

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.2K ビュー.  University of Houston. このプロトコルでは、我々は、最適化されたC2C12細胞の維持、遺伝子トランスフェクション/形質導入、および筋細胞分化を含む、筋緊張性ジストロフィー1筋芽細胞モデルを確立する手順を提示します。 

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Modeling Intracerebral Hemorrhage in Mice: Injection of Autologous Blood or Bacterial Collagenase

Spontaneous intracerebral hemorrhage (ICH) defines a potentially life-threatening neurological malady that accounts for 10-15% of all stroke-related hospitalizations and for which no effective treatments are available to date1,2. Because of the heterogeneity of ICH in humans, various preclinical models are needed to thoroughly explore prospective therapeutic strategies3. Experimental ICH is commonly induced in rodents by intraparenchymal injection of either autologous blood or bacterial collagenase4. The appropriate model is selected based on the pathophysiology of hemorrhage induction and injury progression. The blood injection model mimics a rapidly progressing hemorrhage. Alternatively, bacterial collagenase enzymatically disrupts the basal lamina of brain capillaries, causing an active bleed that generally evolves over several hours5. Resultant perihematomal edema and neurofunctional deficits can be quantified from both models. In this study, we described and evaluated a modified double injection model of autologous whole blood6 as well as an ICH injection model of bacterial collagenase7, both of which target the basal ganglia (corpus striatum) of male CD-1 mice. We assessed neurofunctional deficits and brain edema at 24 and 72 hr after ICH induction. Intrastriatal injection of autologous blood (30 &mu;l) or bacterial collagenase (0.075U) caused reproducible neurofunctional deficits in mice and significantly increased brain edema at 24 and 72 hr after surgery (p&lt;0.05). In conclusion, both models yield consistent hemorrhagic infarcts and represent basic methods for preclinical ICH research.

Clinically relevant animal models of intracerebral hemorrhage (ICH) are needed to extend our knowledge of hemorrhagic stroke and to examine novel therapeutic strategies. In this study, we describe and evaluate two ICH models that implement unilateral injections of either autologous whole blood or bacterial collagenase into the basal ganglia (corpus striatum) of mice.

マウスにおけるモデリング脳出血：自己血または細菌性コラゲナーゼの注入

Spontaneous intracerebral hemorrhage (ICH) defines a potentially life-threatening neurological malady that accounts for 10-15% of all stroke-related ...

医学

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully recapitulate early- and late-stage metastatic disease progression. Typical tumor implantation models utilize ectopic or orthotopic primary tumor implantation, but few include systemic spontaneous metastatic disease that mimics the clinical setting. This protocol describes the key steps to develop RCC disease progression stages similar to patients. First, it uses a highly metastatic mouse tumor cell line in a syngeneic model to show orthotopic tumor cell implantation. Methods include superficial and internal implantation into the sub-capsular space with cells combined with matrigel to prevent leakage and early spread. Next it describes the procedures for excision of tumor-bearing kidney (nephrectomy), with critical pre- and post- surgical mouse care. Finally, it outlines the steps necessary to monitor and assess micro-and macro-metastatic disease progression, including bioluminescent imaging as well provides a detailed visual necropsy guide to score systemic disease distribution. The goal of this protocol description is to facilitate the widespread use of clinically relevant metastatic RCC models to improve the predictive value of future therapeutic testing.&#160;

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma mRCC in Mice Following Nephrectomy

Models of spontaneous metastatic renal cell carcinoma (RCC) disease progression can be used for evaluating treatments in a clinically relevant setting. This protocol demonstrates different procedures for orthotopic kidney tumor cell implantation, proper nephrectomy, and finally outlines a necropsy guide for visual and bioluminescent scoring of metastatic burden and localization.

腎摘出後のマウスにおける自発転移性腎細胞癌（MRCC）をモデル化する

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

マウスにおけるモデリングのストローク：遠位中大脳動脈の永久的な凝固

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with muscular dystrophy is an invaluable cellular source for in&#160;vitro disease model systems and can be used for drug screening studies. Patient-derived urine cells have been used in successful reprogramming into induced pluripotent stem cells in order to model dystrophic cardiomyopathy1. Addressing the safety concerns of integrating vector systems, we present a protocol using a non-integrating Sendai virus vector for transduction of Yamanaka factors into urine cells collected from patients with muscular dystrophy. This protocol generates fully reprogrammed clones within 2&#8211;3 weeks. The pluripotent cells are vector-free by passage-13. These dystrophic iPSCs can be differentiated into cardiomyocytes and used either to study disease mechanisms or for drug screening.

This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.

筋ジストロフィー患者から人工多能性幹細胞の生成：尿由来細胞の効率的な統合·フリーリプログラミング

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

モデル化学療法抵抗性白血病<em&gt;インビトロ</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon skipping employs short DNA/RNA-like molecules called antisense oligonucleotides (AONs) that restore the reading frame and produce shorter but functional proteins. However, exon skipping therapy faces two major hurdles: limited applicability (up to only 13% of patients can be treated with a single AON drug), and uncertain function of truncated proteins. These issues were addressed with a cocktail AON approach. While approximately 70% of DMD patients can be treated by single exon skipping (all exons combined), one could potentially treat more than 90% of DMD patients if multiple exon skipping using cocktail antisense drugs can be realized. The canine X-linked muscular dystrophy (CXMD) dog model, whose phenotype&#160;is&#160;more similar to human DMD patients, was&#160;used to test the systemic efficacy and safety of multi-exon skipping of exons 6 and 8. The CXMD dog model harbors a splice site mutation in intron 6, leading to a lack of exon 7 in dystrophin mRNA. To restore the reading frame in CXMD requires multi-exon skipping of exons 6 and 8; therefore, CXMD is a good middle-sized animal model for testing the efficacy and safety of multi-exon skipping. In the current study, a cocktail of antisense morpholinos targeting exon 6 and exon 8 was designed and it restored dystrophin expression in body-wide skeletal muscles. Methods for transfection/injection of cocktail oligos and evaluation of the efficacy and safety of multi-exon skipping in the CXMD dog model are presented.

Exon skipping is currently a&#160;most promising therapeutic option for Duchenne muscular dystrophy (DMD). To expand the applicability for DMD patients and to optimize the stability/function of the resulting truncated dystrophin proteins, a multi-exon skipping approach using cocktail antisense oligonucleotides was developed and we demonstrated systemic dystrophin rescue in a dog model.

マルチエクソンイヌX連鎖筋ジストロフィーでカクテルアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​使用してスキップ

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

ヒト腫瘍異種移植片からマウス細胞の枯渇は大幅に標的細胞の下流分析を向上させます

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

フォルスコリン誘発性腸オルガノイドに腫れ：<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ嚢胞性線維症患者における薬物反応を評価するための

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide (AON)-mediated therapy. While SMN1 mutations are responsible for the disease, AONs targeting intronic splice silencer (ISS) sites in SMN2, including FDA-approved nusinersen, have been shown to restore SMN expression and ameliorate the symptoms. Currently, many studies involving AON therapy for SMA focus on investigating novel AON chemistries targeting SMN2 that may be more effective and less toxic than nusinersen. Here, we describe a protocol for in vitro evaluation of exon inclusion using lipotransfection of AONs followed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative polymerase chain reaction (qPCR), and Western blotting. This method can be employed for various types of AON chemistries. Using this method, we demonstrate that AONs composed of alternating locked nucleic acids (LNAs) and DNA nucleotides (LNA/DNA mixmers) lead to efficient SMN2 exon inclusion and restoration of SMN protein at a very low concentration, and therefore, LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides may be an attractive therapeutic strategy to treat splicing defects caused by genetic diseases. The in vitro evaluation method described here is fast, easy, and sensitive enough for the testing of various novel AONs.

Various antisense oligonucleotides (AONs) have been shown to induce exon inclusion (splice modulation) and rescue SMN expression for spinal muscular atrophy (SMA). Here, we describe a protocol for AON lipotransfection to induce exon inclusion in the SMN2 gene and the evaluation methods to determine the efficacy in SMA patient fibroblasts.

によるエクソン介在物評価スプライスの SMA 患者の繊維芽細胞でスイッチング アンチセンスオリゴヌクレオチド

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...