We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).

1. תרבית תאי C2C12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור myoblasts העכבר C2C12 בצלחת 100 מ&quot;מ במדיום הגידול (המדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM)) בתוספת 20% בסרום שור עוברית, 100 פניצילין U / ml, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, ו -2 מ&quot;מ L- גלוטמין. אפשר תאי passaged C2C12 להיות כ 50 - 60% ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את מדיום הגידול ולשטוף תאים C2C12 עם 3 מ&quot;ל בטמפרטורת החדר פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). הסר את PBS ולהוסיף 500 μl 0.25% טריפסין- EDTA כדי לנתק את התאים. מניחים את צלחת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 3 - 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את טריפסין על ידי הוספת מדיום הגידול 3 מ&quot;ל. פיפטה 6 - 8 פעמים כדי להשעות את התאים. הוסף 1 מ&quot;ל של תאים מושעה לצלחת 100 מ&quot;מ חדש לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 2. Transfection Cell C2C12 / התמרה בחירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transfection פלסמיד C2C12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לפני transfection, עמ &#39;7.0 מאוחר x 10 5 C2C12 תאים לתוך אחד טוב של צלחת שש היטב עבור כל transfection. הערה: זה מוביל 50 - 60% מפגש ידי בזמן transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מגיב transfection כדי להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד (GFP-CUG5 או GFP-CUG200) לתוך 200 μl מחומם מראש בינוני חופשי בסרום ו מערבולת בקצרה. הוסף מגיב transfection 6 μl למדיום ומערבבים מיד למשך 30 שניות בעזרת מערבולת. דגירה את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את התקשורת של תאי C2C12 2.5 מ&quot;ל מדיה סרום ללא צמיחה. מוסיפים את תערובת transfection לתאים לאחר דגירה. החזר את הצלחות על 5% CO 2, 37 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התאים ב תערובת transfection / מדיה סרום ללא צמיחה עבור 4 שעות או עד הלילה. שינוי תקשורת חזרה תקשורת הצמיחה למחרת או כאשר cytotoxicity ניכר. הערה: Cytotoxicity נבחנת על ידי בדיקה מיקרוסקופית של ceLLS. בוחן את שינויי מורפולוגיה תאי ניתוק תא. כל עוד אין cytotoxicity גלויה, דגירה לילה במדיה סרום ללא צמיחה משפרת transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התאים 48 שעות לאחר transfection ידי הוספת 1.2 - G418 1.6 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​עבור ~ 10 ימים עד שהתרבות מלאה (טרנספקציה ללא פלסמידים) אין תאים חיים. שנה את התקשורת כל יומיים עם התקשורת צמיחה בתוספת G418. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על התאים G418 עמידים במדיום הגידול ו 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך הניסויים הבאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת רטרו-וירוס תמרת retroviral C2C12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני תרבות HEK 293 על ידי השלמת גלוקוז DMEM גבוהה עם 10% בסרום שור עוברית, 100 U / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, ו -2 מ&quot;מ L- גלוטמין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 24 שעות לפני transfection, צלחת 4.0 x 10 6 ecotropic HEK תאי אריזת 293 מבוססים בבית (מפגש 80% ב transfection) 100 מ&quot;מ צלחת גתרבית תאים בינוני ontaining. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מגיב transfection כדי להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 15 מיקרוגרם DNA פלסמיד (pMSCV-Puro או pMSCV-Celf1Flag-Puro) ב 1 בינוני מ&quot;ל סרום ללא צמיחה. בקצרה וורטקס. הוסף 30 מגיבים transfection μl משלבים 2.2.2 לתוך צינור מדיום גידול DNA / סרום ללא, ומערבבים בעזרת מערבולת היטב. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף dropwise תערובת transfection אל HEK ecotropic מבוסס 293 תאי האריזה. מערבולת בעדינות את הצלחות ולהחזיר אותם בחזרה 5% CO 2, 37 ° C חממה. לאחר 24 שעות, לשנות את התקשורת עד 10 מיליליטר מחומם מראש מדיום גידול טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר supernatant (המכיל רטרו-וירוס) 48 שעות לאחר transfection בעזרת פיפטה ולהעביר את supernatant לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל. הוסף 10 מיליליטר של תקשורת החמה החדשה לצלחת ולהחזיר אותו אל האינקובטור. שמור את supernatant על 4 מעלות צלזיוס. הערה: התקשורת מתווספת בעדינות כדי לאהוא בצד של הבאר כדי לא לשבש את monolayer התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את המנה השנייה של supernatant 60 שעות לאחר transfection וברכה זה עם supernatant מ 2.2.5. צנטריפוגה ב 500 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל חדש. השתמש רטרו-וירוס כדי transduce תאים C2C12 בשלב זה על ידי שתמשיך לשלב 2.2.9 או aliquot ולאחסן את supernatant ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה רטרו-וירוס מ 2.2.7 בטמפרטורת החדר, אם מניה קפוא משמש כאן. הערה: הימנע להקפיא להפשיר מחזורים מרובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי C2C12 באותו היום של התמרה המכוונת במשך 30 - 40% של מפגש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את מדיום הגידול ולשטוף תאים C2C12 עם 3 מ&quot;ל בטמפרטורת החדר PBS. הסר את PBS, להוסיף 500 μl 0.25% טריפסין- EDTA, דגירה צלחת 2 באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO עבור 3 - 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 3 מ&quot;ל med צמיחהium. פיפטה 6 - 8 פעמים כדי להשעות את התאים. ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולהוסיף 8.0 x 10 5 C2C12 תאים לצלחת 60 מ&quot;מ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל רטרו-וירוס להדביק צלחת אחת 60 מ&quot;מ של תאים בתקשורת צמיחה 3 מ&quot;ל. מחזירים את הצלחת אל האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף עם 3 מ&quot;ל התקשורת טריים בתוספת אנטיביוטיקה הבחירה (puromycin 1 - 3 מיקרוגרם / מ&quot;ל) 48 שעות לאחר ההדבקה. החלף 3 מ&quot;ל בינוני עם אנטיביוטיקה כל יום במשך ~ 5 ימים עד שהתרבות מלאה C2C12 untransduced גוועת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Lentivirus ו התמר lentiviral C2C12 הערה: בצע את כל ההליכים הקשורים lentivirus ב בטיחות ביולוגית רמה 2 ארון ולפעול בהתאם להנחיות בטיחות ביולוגיות. פסולת נוזלית בעלת הנגיף יש לחטא לפני סילוק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 4.0 x 10 6 293T תאים בצלחת 100 מ&quot;מ (~ 80 מפגש% ביום של transfection) עם תרבית תאים בינוניים HEK 293 (גלוקוז DMEM גבוהה, בתוספת 10% עובריתבסרום שור, 100 U / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, ו -2 מ&quot;מ L- גלוטמין) 24 שעות לפני transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ לחמם את מגיב transfection לטמפרטורת החדר. מערבבים את וקטורים אריזה lentiviral (4 מיקרוגרם pMD2.G ו -6 מיקרוגרם psPAX2) יחד עם וקטור העברת 8 מיקרוגרם lentiviral (Celf1 shRNA או מקושקשות shRNA שליטה) ב 1 בינוני מ&quot;ל תרבית תאים חופשית בסרום. בקצרה וורטקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 36 μl מגיב transfection מחומם מראש ל הצינור DNA / DMEM ומערבבים היטב על ידי מערבולת. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאי 293T מן החממה ולהוסיף לתערובת transfection לצלחת. מערבולת בעדינות את הצלחת ולהחזיר אותו בחזרה 5% CO 2, 37 ° C חממה. לאחר 24 שעות, להחליף את תערובת transfection עם המדיום תרבות טרי 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את lentivirus supernatant המכיל 48 שעות לאחר transfection ולהעביר אותו לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל. הוסף 10 מדיה חמה חדשה מיליליטר לצלחת ולהחזירוחממה. אחסן את supernatant על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את המנה השנייה של supernatant 60 שעות לאחר transfection, ולשלב אותו עם supernatant מ 2.3.5. בקצרה צנטריפוגה ב 500 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant לתוך צינור 50 מ&quot;ל צנטריפוגות טריים. אם אתה משתמש וירוס טרי, המשך לשלב 2.3.9. לשימוש עתידי, חנות וירוס המכילים supernatant ב -20 מעלות צלזיוס aliquots של 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר מהווירוס 2.3.7 בטמפרטורת החדר לפני השימוש, אם מניה קפוא משמש. הערה: הימנע להקפיא להפשיר מחזורים מרובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי C2C12-CUG200 (המתקבלים בסעיף 2.1) כמתואר 2.2.9 באותו היום של תמרה. הערה: כוון 30 - 40% של מפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל וירוס להדביק צלחת 60 מ&quot;מ של C2C12-CUG200 ולהחזיר את הצלחת אל האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מדיום התרבות עם תקשורת טריה בתוספת אנטיביוטיקת הבחירה (puromycin 1 - 3 מיקרוגרם / מיליליטר) 72 שעות לאחר תמרה.רענן היומיום תקשורת והתרבות עם אנטיביוטיקת הבחירה ~ 5 ימים עד שכל התרבות מלאת C2C12-CUG200 untransduced גוועת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש כתם מערבי לאמת מציאת Celf1 בתאי transfected GFP-CUG200. </li></ol></li></ol> 3. התמיינות תאים C2C12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 2 x 10 6 תאים אחד טוב של צלחת 6-היטב 2.5 מיליליטר תקשורת צמיחת 24 שעות לפני תחילת הבידול. הערה: צפיפות הציפוי עשויה להיות מותאמת כך מפגש מלא הוא הגיע ב -24 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים ומחוברות עם PBS ולהוסיף 2.5 מ&quot;ל של מדיום בידול נמוכה בסרום (בינוני של הנשר שונה של Dulbecco בתוספת 2% נסיוב סוס, 100 U / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין ו -1 מיקרומטר אינסולין) . החלף את המדיום כל יומיים. הערה: שמור אינסולין המניות קפוא ולהוסיף אותו בתקשורת בכל שינוי בינוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך התמיינות C2C12, לאסוף דגימות עבור קוואןtitative RT-PCR (ראה סעיף 4) בנקודות הזמן הבאות: יום 0, 1, 2, 4, ו -6 תהליך ההתרבות עבור immunostaining ביום 6 - 8 (ראה סעיף 5). </li></ol> בידוד RNA 4. וכמותי RT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פרוטוקול של היצרן עבור בידוד RNA. לאחר בידוד, resuspend גלולה רנ&quot;א 30 מים μl RNase ללא ו pipet מעלה ומטה מספר פעמים. הערה: הדוגמות תהיינה רשאיות להמשיך כמוני RT-PCR או יכולות להיות מאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ערכת qPCR RT עבור כמותי RT-PCR 10 ובצע את ההוראות של היצרן. מכינים את תערובת התגובה על פי טבלה 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רְכִיב </td><td> נפח (μl) </td><td> ריכוז סופי </td></tr><tr><td> מאגר התגובה 2x </td><td> 10 </td><td> 1x </tד&gt; </tr><tr><td> פריימר קדימה </td><td> 0.5 </td><td> 200 ננומטר </td></tr><tr><td> פריימר הפוך </td><td> 0.5 </td><td> 200 ננומטר </td></tr><tr><td> בְּדִיקָה </td><td> 0.5 </td><td> 200 ננומטר </td></tr><tr><td> הפוך transcriptase &amp; RNase אינהיביטור </td><td> 0.1 </td><td> 0.25 U / ml </td></tr><tr><td> תבנית </td><td> 1 </td><td> 100 RNA סך ng </td></tr><tr><td> מים חינם RNase </td><td> 7.4 </td><td> NA </td></tr><tr><td> מערבבים סה&quot;כ </td><td> 20 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1. כמותי RT-PCR מיקס מאסטר הכנה <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תגובת 20 μl RT-qPCR באמצעות טבלה 2 פרופיל תרמית. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> צעד שעתוק הפוך </td><td> 30 דקות, 48 ° C </td></tr><tr><td> פולימר DNAאיון ASE הפעלה / הפוך transcriptase </td><td> 10 דקות, 95 ° C </td></tr><tr><td rowspan="2"> 40 מחזורים </td><td> 15 שניות, 95 ° C </td></tr><tr><td> 1 דק &#39;, 60 ° C </td></tr></tbody></table> טבלה 2. כמותי פרופיל תרמי RT-PCR 5. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התרבות monolayer ב 2.5 מ&quot;ל מוכן טרי 4% paraformaldehyde / PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize דגימות 2.5 מ&quot;ל 0.1% Triton X-100 / PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות בתא humidified. חסום את דגימות 2.5 מ&quot;ל חסימת חיץ (0.1% nonionic פעילי שטח / PBS, 10% נסיוב עז רגיל) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל חסימת חיץ ולהחיל 800 μl נוגדן ראשוני נגד שרשרת שרירן כבד מדולל חסימת חיץ (1: 100). מדגירים לילה בתא humidified בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 3 times (10 דקות כל אחד) עם חיץ 2.5 מ&quot;ל לשטוף (0.1% polysorbate 20 / PBS) ביום 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיץ לשטוף ולהחיל 800 נוגדנים משני μl (IgG אנטי העכבר העז, 1: 500 בדילול מלא PBS). דגירה בתא humidified בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים (10 דקות כל אחד) עם חיץ לשטוף 2.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם 800 μl DAPI (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל, בדילול מלא O H 2 deionized מזוקקים) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חיץ 2.5 מ&quot;ל לשטוף שוב למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את חיץ כביסה 2.5 מ&quot;ל PBS ולהשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי ללכוד תמונות. </li></ol>

<ol>
	<li>Harper, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Myotonic dystrophy. 3rd edn. , (2001).</li><li>Timchenko, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+muscle+atrophy+in+myotonic+dystrophies.">Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).</li><li>Brook, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+myotonic+dystrophy:+expansion+of+a+trinucleotide+(CTG)+repeat+at+the+3'+end+of+a+transcript+encoding+a+protein+kinase+family+member.">Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member.</a> Cell. 68 (4), 799-808 (1992).</li><li>Chau, A., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+insights+into+the+pathology+of+and+therapeutic+strategies+for+DM1:+Back+to+the+basics.">Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics.</a> Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).</li><li>Ho, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscleblind+proteins+regulate+alternative+splicing.">Muscleblind proteins regulate alternative splicing.</a> EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).</li><li>Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+steady-state+levels+of+CUGBP1+in+myotonic+dystrophy+1+are+due+to+PKC-mediated+hyperphosphorylation.">Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation.</a> Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).</li><li>Kalsotra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mef2+transcription+network+is+disrupted+in+myotonic+dystrophy+heart+tissue,+dramatically+altering+miRNA+and+mRNA+expression.">The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression.</a> Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li><li>Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+activation+of+human+nuclear+genes+in+stable+heterocaryons.">Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons.</a> Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).</li><li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celf1+regulates+cell+cycle+and+is+partially+responsible+for+defective+myoblast+differentiation+in+myotonic+dystrophy+RNA+toxicity.">Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).</li><li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myotonic+dystrophy+expanded+CUG+repeat+tract+is+necessary+but+not+sufficient+to+disrupt+C2C12+myoblast+differentiation.">The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation.</a> Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).</li><li>Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis+and+trans+effects+of+the+myotonic+dystrophy+(DM)+mutation+in+a+cell+culture+model.">Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model.</a> Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).</li><li>Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(CTG)n+repeats+markedly+inhibit+differentiation+of+the+C2C12+myoblast+cell+line:+implications+for+congenital+myotonic+dystrophy.">(CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy.</a> Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).</li><li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+defects+in+myotonic+dystrophy.">Myogenic defects in myotonic dystrophy.</a> Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).</li><li>Emerson, C. P., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in muscle biology. 52, (1997).</li><li>Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUGBP1+overexpression+in+mouse+skeletal+muscle+reproduces+features+of+myotonic+dystrophy+type+1.">CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).</li><li>Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart-specific+overexpression+of+CUGBP1+reproduces+functional+and+molecular+abnormalities+of+myotonic+dystrophy+type+1.">Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

שורת תאים C2C12 נוצל בעבר כמודל ללמוד myogenesis 11-14. תאים אלה לשמור על המראה כמו-פיברובלסטים, להתרבות במהירות מדיה המכילה 20% בסרום שור העובר ולבדל בקלות מדיה המכילה 2% נסיוב סוס 15. הצמיחה וההתבדלות מהר הם מאפייני יתרון מודל תא myogenesis. הנה, אנחנו מדגימים את השימוש פל?...

ניוון Myotonic (DM) הוא מחלה דומיננטית אוטוזומלית המשפיעה מערכות מרובות, בעיקר שרירי לב שלד 1. ישנם שני תת סוגים של המחלה הזאת, DM1 ו DM2. DM1 נפוץ יותר ויש לו ביטוי חמור יותר DM2 2. המוטציה הגנטית הבסיסית DM1 היא רחבה של חזרות שלישיית CUG הממוקמות באזור המתורגם &#39;3 (UTR) של גן החלבון קינאז DM (DMPK) 3. מספר חוזרי CUG אצל אנשים לא מעושה משתנה בין 5 ל 37. לעומת זאת, היא מגדילה ליותר מ -50, ולפעמים עד אלף בחולי DM1 4. כתוצאה מכך, חלבונים קושרי RNA, כגון muscleblind דמוי 1 (MBNL1), CUGBP, ו Elav-כמו משפחה 1 (Celf1), הם misregulated. בשל התפיסה על חזרות CUG המורחבות, MBNL1 מאבד את יכולתו לווסת שחבור חלופי 5. Celf1, ומצד שני, הוא למעלה מוסדר 6,7. התבטאות יתר של Celf1 קשורה לאובדן שרירחולשה, אשר אינן מיוחסות אובדן תפקוד MBNL1. במודלים של בעלי חיים לדמות שינויים הקשורים DM1, ובכלל זה, הרחבת DMPK 3&#39;-UTR CUG, אובדן MBNL1, ואת יתר של Celf1, הוקמו. עם זאת, דוגמנות DM1 ב myoblasts מציעה אלטרנטיבה יעילה, במיוחד עבור לנתח הקשורות DM1 אירועים תאיים ומולקולריים. C2C12 שורת תאי myoblast בודד לראשונה מ שריר עכבר C3H נפצע בשימוש נרחב ללמוד 8,9 בידול myogenic. תאי C2C12 להתרבות במהירות בסרום שור עובר (FBS) המכיל תקשורת לעבור התמיינות בקלות כאשר FBS ייגמר. עם זאת, באמצעות מודל בידול myoblast זה מציג שני אתגרים: תאי C2C12 הם בדרך כלל עמידים בפני transfection גן / תמרה ויראלית; ו שינויים קלים טיפול תא הליך בידול יכולים להוביל לשינויים חדים בהשקעות myotube. המעבדה שלנו באופן שגרתי משתמש myoblasts C2C12 כמו acell מודל פתח פרוטוקולים להעברת גנים ביעילות על ידי transfection פלסמיד, תמרת retroviral, תמרת lentiviral לתוך תא C2C12 קו 10. בסרטון, אנחנו מדגימים את הנהלים אופטימיזציה עבור transfecting / transducing C2C12 תאים ושמירה על עקביות בידול בהקמת מודלים myoblast DM1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="804">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, high glucose</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">11965-084</td>
			<td style="width:325px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum - Premium</td>
			<td style="width:112px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:151px;">S11150</td>
			<td>for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">10378-016</td>
			<td>for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin from bovine pancreas</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">I6634-100MG</td>
			<td>for differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">equine serum</td>
			<td style="width:112px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:151px;">S12150</td>
			<td>for differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FuGENE&#160;HD&#160;Transfection Reagent</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">E2311&#160;</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">G418 sulfate&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Gold Biotechnology&#160;</td>
			<td style="width:151px;">G-418-10</td>
			<td>for drug resistant selection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">sc-108071</td>
			<td>for drug resistant selection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0323BOX</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP00061</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0002</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m</td>
			<td style="width:112px;">GE healthcare life science</td>
			<td style="width:151px;">10600015</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MF 20</td>
			<td style="width:112px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:151px;">MF 20</td>
			<td>primary Ab for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate</td>
			<td style="width:112px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">T-862</td>
			<td>secondary Ab for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">One step qRT-PCR MasterMix</td>
			<td style="width:112px;">AnaSpec</td>
			<td style="width:151px;">05-QPRT-032X</td>
			<td>for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TriPure Isolation Reagent</td>
			<td style="width:112px;">Roche</td>
			<td style="width:151px;">11667165001</td>
			<td>for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CUG-BP1 Antibody (3B1)</td>
			<td style="width:112px;">santa cruz</td>
			<td style="width:151px;">sc-20003</td>
			<td>primary Ab western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Actin Antibody</td>
			<td style="width:112px;">santa cruz</td>
			<td style="width:151px;">sc-1615</td>
			<td>goat polyclonal IgG for loading control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">293T Ecopack</td>
			<td style="width:112px;">Clontech</td>
			<td style="width:151px;">631507</td>
			<td>cells for retrovirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pMSCV-puro</td>
			<td style="width:112px;">Clontech</td>
			<td style="width:151px;">634401</td>
			<td>empty retroviral vector for retrovirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pMSCV-Celf1Flag-puro</td>
			<td style="width:112px;">house-constructed</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">psPAX2</td>
			<td style="width:112px;">gift from Didier Trono</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>for lentivirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pMD2.G</td>
			<td style="width:112px;">gift from Didier Trono</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>for lentivirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GFP-CUG5</td>
			<td style="width:112px;">gift from M.S. Mahadevan</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>details in reference 10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GFP- CUG200</td>
			<td style="width:112px;">gift from M.S. Mahadevan</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>details in reference 10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton&#160;X-100</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">X100</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P6148</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TWEEN&#160;20</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P9416</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D9542</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling myotonic dystrophy 1 in c2c12 myoblast cells

Myotonic ניוון 1 (DM1) היא צורה נפוצה של ניוון שרירים. למרות במודלים של בעלי חיים כמה הוקמו DM1, מודלי תא myoblast הם עדיין חשובים משום שהם מציעים אלטרנטיבה הסלולר ביותר ללימוד אירועים תאיים ומולקולריים. למרות תאים myoblast C2C12 כבר בשימוש נרחב ללמוד myogenesis, עמידות transfection הגן, או התמרה ויראלית, מעכבת מחקר בתאי C2C12. כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה הכולל תחזוקה יומית, נהלי transfection התמר להציג גנים לתוך myoblasts C2C12 ואת האינדוקציה של בידול myocyte. ביחד, נהלים אלה לאפשר יעילות transfection / תמרה הטובות ביותר, כמו גם תוצאות בידול עקביות. הפרוטוקול המתואר בהקמת מודלי תא myoblast DM1 ירוויח לחקר ניוון myotonic, כמו גם מחלות שרירים אחרות.

תאי C2C12 היו transfected עם GFP-CUG5 או GFP-CUG200. לאחר בחירת התרופה-התנגדות, ברכות יציבות הוקמו, אשר ניתן דמיינו ידי ביטוי של GFP (איור 1 א). היווצרות Myotube ב myoblasts הבדיל זוהה על ידי שרירן שרשרת כבדה immunostaining 10 (איור 1 ב). כימות של היווצרות myotube הראו ...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells at JoVE.com

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים בהקמת מודלי myoblast myotonic ניוון 1, כוללים תחזוקת תא מותאם C2C12, transfection גן / תמרה, והבחנת myocyte.

דוגמנות Myotonic ניוון 1 בתאים C2C12 myoblast

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

modeling-myotonic-dystrophy-1-in-c2c12-myoblast-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

15.1K Views.  University of Houston.  בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים בהקמת מודלי myoblast myotonic ניוון 1, כוללים תחזוקת תא מותאם C2C12, transfection גן / תמרה, והבחנת myocyte. 

Video: Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Modeling Intracerebral Hemorrhage in Mice: Injection of Autologous Blood or Bacterial Collagenase

Spontaneous intracerebral hemorrhage (ICH) defines a potentially life-threatening neurological malady that accounts for 10-15% of all stroke-related hospitalizations and for which no effective treatments are available to date1,2. Because of the heterogeneity of ICH in humans, various preclinical models are needed to thoroughly explore prospective therapeutic strategies3. Experimental ICH is commonly induced in rodents by intraparenchymal injection of either autologous blood or bacterial collagenase4. The appropriate model is selected based on the pathophysiology of hemorrhage induction and injury progression. The blood injection model mimics a rapidly progressing hemorrhage. Alternatively, bacterial collagenase enzymatically disrupts the basal lamina of brain capillaries, causing an active bleed that generally evolves over several hours5. Resultant perihematomal edema and neurofunctional deficits can be quantified from both models. In this study, we described and evaluated a modified double injection model of autologous whole blood6 as well as an ICH injection model of bacterial collagenase7, both of which target the basal ganglia (corpus striatum) of male CD-1 mice. We assessed neurofunctional deficits and brain edema at 24 and 72 hr after ICH induction. Intrastriatal injection of autologous blood (30 &mu;l) or bacterial collagenase (0.075U) caused reproducible neurofunctional deficits in mice and significantly increased brain edema at 24 and 72 hr after surgery (p&lt;0.05). In conclusion, both models yield consistent hemorrhagic infarcts and represent basic methods for preclinical ICH research.

Clinically relevant animal models of intracerebral hemorrhage (ICH) are needed to extend our knowledge of hemorrhagic stroke and to examine novel therapeutic strategies. In this study, we describe and evaluate two ICH models that implement unilateral injections of either autologous whole blood or bacterial collagenase into the basal ganglia (corpus striatum) of mice.

דימום דוגמנות intracerebral בעכברים: הזרקה של דם או השתלת collagenase קטריאלי

Spontaneous intracerebral hemorrhage (ICH) defines a potentially life-threatening neurological malady that accounts for 10-15% of all stroke-related ...

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully recapitulate early- and late-stage metastatic disease progression. Typical tumor implantation models utilize ectopic or orthotopic primary tumor implantation, but few include systemic spontaneous metastatic disease that mimics the clinical setting. This protocol describes the key steps to develop RCC disease progression stages similar to patients. First, it uses a highly metastatic mouse tumor cell line in a syngeneic model to show orthotopic tumor cell implantation. Methods include superficial and internal implantation into the sub-capsular space with cells combined with matrigel to prevent leakage and early spread. Next it describes the procedures for excision of tumor-bearing kidney (nephrectomy), with critical pre- and post- surgical mouse care. Finally, it outlines the steps necessary to monitor and assess micro-and macro-metastatic disease progression, including bioluminescent imaging as well provides a detailed visual necropsy guide to score systemic disease distribution. The goal of this protocol description is to facilitate the widespread use of clinically relevant metastatic RCC models to improve the predictive value of future therapeutic testing.&#160;

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma mRCC in Mice Following Nephrectomy

Models of spontaneous metastatic renal cell carcinoma (RCC) disease progression can be used for evaluating treatments in a clinically relevant setting. This protocol demonstrates different procedures for orthotopic kidney tumor cell implantation, proper nephrectomy, and finally outlines a necropsy guide for visual and bioluminescent scoring of metastatic burden and localization.

Nephrectomy דוגמנות קרצינומה ספונטני גרורתי של תאי כליות (mRCC) בעכברים בעקבות

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

דוגמנות שבץ בעכברים: קרישה קבועה של עורקי דיסטלי התיכון מוחין

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with muscular dystrophy is an invaluable cellular source for in&#160;vitro disease model systems and can be used for drug screening studies. Patient-derived urine cells have been used in successful reprogramming into induced pluripotent stem cells in order to model dystrophic cardiomyopathy1. Addressing the safety concerns of integrating vector systems, we present a protocol using a non-integrating Sendai virus vector for transduction of Yamanaka factors into urine cells collected from patients with muscular dystrophy. This protocol generates fully reprogrammed clones within 2&#8211;3 weeks. The pluripotent cells are vector-free by passage-13. These dystrophic iPSCs can be differentiated into cardiomyocytes and used either to study disease mechanisms or for drug screening.

This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מחולי ניוון שרירים: תכנות מחדש ללא אינטגרציה יעילה של תאים שתן נגזר

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

לוקמיה עמידה דוגמנות כימותרפיה<em&gt; במבחנה</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon skipping employs short DNA/RNA-like molecules called antisense oligonucleotides (AONs) that restore the reading frame and produce shorter but functional proteins. However, exon skipping therapy faces two major hurdles: limited applicability (up to only 13% of patients can be treated with a single AON drug), and uncertain function of truncated proteins. These issues were addressed with a cocktail AON approach. While approximately 70% of DMD patients can be treated by single exon skipping (all exons combined), one could potentially treat more than 90% of DMD patients if multiple exon skipping using cocktail antisense drugs can be realized. The canine X-linked muscular dystrophy (CXMD) dog model, whose phenotype&#160;is&#160;more similar to human DMD patients, was&#160;used to test the systemic efficacy and safety of multi-exon skipping of exons 6 and 8. The CXMD dog model harbors a splice site mutation in intron 6, leading to a lack of exon 7 in dystrophin mRNA. To restore the reading frame in CXMD requires multi-exon skipping of exons 6 and 8; therefore, CXMD is a good middle-sized animal model for testing the efficacy and safety of multi-exon skipping. In the current study, a cocktail of antisense morpholinos targeting exon 6 and exon 8 was designed and it restored dystrophin expression in body-wide skeletal muscles. Methods for transfection/injection of cocktail oligos and evaluation of the efficacy and safety of multi-exon skipping in the CXMD dog model are presented.

Exon skipping is currently a&#160;most promising therapeutic option for Duchenne muscular dystrophy (DMD). To expand the applicability for DMD patients and to optimize the stability/function of the resulting truncated dystrophin proteins, a multi-exon skipping approach using cocktail antisense oligonucleotides was developed and we demonstrated systemic dystrophin rescue in a dog model.

Multi-אקסון דילוג שימוש אנטיסנס קוקטייל של ניוון השרירים הצמוד X לכלבים

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide (AON)-mediated therapy. While SMN1 mutations are responsible for the disease, AONs targeting intronic splice silencer (ISS) sites in SMN2, including FDA-approved nusinersen, have been shown to restore SMN expression and ameliorate the symptoms. Currently, many studies involving AON therapy for SMA focus on investigating novel AON chemistries targeting SMN2 that may be more effective and less toxic than nusinersen. Here, we describe a protocol for in vitro evaluation of exon inclusion using lipotransfection of AONs followed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative polymerase chain reaction (qPCR), and Western blotting. This method can be employed for various types of AON chemistries. Using this method, we demonstrate that AONs composed of alternating locked nucleic acids (LNAs) and DNA nucleotides (LNA/DNA mixmers) lead to efficient SMN2 exon inclusion and restoration of SMN protein at a very low concentration, and therefore, LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides may be an attractive therapeutic strategy to treat splicing defects caused by genetic diseases. The in vitro evaluation method described here is fast, easy, and sensitive enough for the testing of various novel AONs.

Various antisense oligonucleotides (AONs) have been shown to induce exon inclusion (splice modulation) and rescue SMN expression for spinal muscular atrophy (SMA). Here, we describe a protocol for AON lipotransfection to induce exon inclusion in the SMN2 gene and the evaluation methods to determine the efficacy in SMA patient fibroblasts.

הערכה של הכללה אקסון שנגזרות אחוי Oligonucleotides Antisense מיתוג ב SMA החולה Fibroblasts

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...