We thank Caroline Bouchard from the animal facility for the rat work. A.S. holds a J.A. De S&#232;ve master fellowship, and B.P. a COPSE fellowship from the Universit&#233; de Montr&#233;al This work was funded by grants attributed to J.B. from FRQS-Pfizer and start-up funds from H&#244;pital du Sacr&#233;-Coeur de Montr&#233;al Research Center.

倫理の声明：このプロジェクトのための動物プロトコルは、動物ケアに関するカナダの協議会のガイドラインに準拠してHôpitalデュサクレクール寺院モントリオールの動物ケア委員会の承認を得ました。 定位手術の前に1.カテーテルの準備<ol><li>浸透圧ポンプを有するカニューレを接続するために使用されるPE50カテーテルを（長さ6 cm）で ​​切断した （ 図1A参照）。人工脳脊髄液（aCSFの）とPE50カテーテルを記入し、カテーテルの両端を密封します。使用するまで4℃でカテーテルを保管してください。 </li></ol>定位2.カニューレ注入<ol><li>無菌状態で手術を行います。オートクレーブにより、すべての手術器具や材料を滅菌します。徹底的に定位固定装置と作業領域をきれいにし、そして70％のエタノール溶液で消毒。外科手術用マスク、ヘアボンネットと滅菌手袋を着用してください。</li><li>腹腔内（IP）をケタミン及びキシラジンの溶液（100ミリグラム/ kgおよび10mg / kgのそれぞれ）を注入することによってラットを麻酔。穏やかなつま先のピンチの後に動きをチェックすることにより、麻酔を確認してください。 </li><li>手術前に麻酔をかけ、動物、少なくとも30分に皮下（s）;非ステロイド性抗炎症薬（1ミリグラム/キログラムメロキシカム）を注入します。 </li><li>バリカンを用いて動物の頭を剃るとグルコン酸クロルヘキシジンの溶液2％、イソプロピルアルコール2％の3回で皮膚を消毒します。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医の眼軟膏を適用します。 </li><li>耳のバーで定位フレームに動物を置きます。定位フレームのホルダアーム上の1つのカニューレを修正しました。頭の上に（SC）局所麻酔薬（ブピバカイン（1.5ミリグラム/ kg）およびリドカイン（1.5ミリグラム/キログラム）を注入します。麻酔は、3％のイソフルランを提供するノーズコーンを配置することによって、全体の手順の間に維持している。全体手術野はする必要がありますオフドレープが、それはより良い技術を実証するためにここで行われていませんでした。 </li><li>メスで頭の上に3センチメートルの切開を行います。明確な頭蓋骨を残すために切開の周りに4クランプを取り付けます。ラウンドチップはさみを使用して、動物の肩甲骨の間の皮膚の下にポケット（2×2 cm 2の）を作ります。 </li><li>ブレードと頭蓋骨の骨膜をこすり。出血場合頭蓋骨にガーゼパッドを適用します。 </li><li>頭蓋骨は平坦でよく定位フレーム上に整列されていることを確認します。頭蓋骨が平坦であることを確認するために、高さはブレグマでラムダで座標を確認してください。基準点として使用されるブレグマの座標を取ります。 </li><li>ブレグマから出発し、海馬に両側性に移植される2つのガイドカニューレの座標計算（前後： - 0.42センチメートル;内外：0.30センチメートル±を、背腹： - 0.28センチメートルPaxinosとワトソンラット脳アトラスに応じて）29は、 。示しますマーカーとカニューレの位置。 </li><li>両方のカニューレの注入点で頭蓋骨に穴（0.5ミリメートル）を開けます。歯科用セメントを適用するときにカニューレを固化するネジを挿入するために、他の二つの穴それらの点の上下に約5mmのドリル。 </li><li>以前にメスでaCSFので満たされたカテーテルの一方の端をカットし、カニューレの角度アームに挿入します。歯科用セメントとの最初のカニューレを修正しました。第二のカニューレ上の位置の周りに歯科用セメントを置かないようにしてください。 </li><li>その後、最初のカニューレからホルダアームを削除し、その中の第二のカニューレを固定し、3分 - 2のための歯科用セメントの乾燥をしてみましょう。繰り返しは、2.11と2.12を繰り返します。両方のガイドカニューレにダミーカニューレを入れてください。ダミーとガイドカニューレは、組織浸潤およびカニューレを遮断を防止するために、同じ長さのものであることを確認してください。 </li><li>以前に動物の肩甲骨の間に作られたポケットの中に両方のカテーテルの自由端を挿入します。クランプを外し、で皮膚をステッチ縫合糸4-0。 注：トップガイドカニューレは、今後のAβo注入のためにアクセスできる必要があります。 </li><li>定位フレームから動物を削除し、そのケージに戻ってそれを置きます。動物が目覚めるまで、手術後の回復時には、暖房水毛布の上にケージを置きます。必要に応じて、ラットは熱から離れて移動することができますので、ケージは、パッドの上に部分的であるべきです。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、常に動物を監視します。 </li><li>綿密なモニタリングの下で​​10日間手術から回復するために動物施設にラットを返します。 注：完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。メロキシカム（1ミリグラム/ kg）を、痛みを治療するための手術後2日間は一日一回与えられています。 </li></ol> 3.浸透圧ポンプのインストール<ol><li>コントロールIgG1、ある日、インストールの前に、6E10抗体（100μlの1mg / mlの）と浸透圧ポンプを埋めます抗体（1 mg / mlで、100μl）を無菌条件下で製造者の指示に従って。ポンプを活性化するために37℃で一晩滅菌蒸留水でポンプを保管してください。 </li><li>浸透圧ポンプ（7日間0.5μL/時間）をインストールするためにイソフルラン3％のラットを麻酔。肩甲骨の間にひげをそるとグルコン酸クロルヘキシジンの溶液2％、イソプロピルアルコール2％で皮膚を消毒します。ガイドカニューレに接続されたPE50カテーテルを配置するために、肩甲骨の間メスで2センチの切開を行います。 </li><li>メスで歯科用セメントを含むPE50カテーテルの端をカットします。 PE50カテーテルに浸透圧ポンプを接続し、接続を確保するためのポンプとカテーテル接合部にいくつかの歯科用セメントを追加します。 </li><li>縫合糸4-0でしっかりと肌をステッチ。暖房水パッドの上に戻って、そのケージに動物を置きます。イソフルラン麻酔（約5分）から急速に目を覚ます動物を観察します。 注：手術はアプロかかりますximately 5〜10分。 </li></ol> 4.Aβo覚醒中の煎茶と自由に動くラット<ol><li>以前に報告されているようAβo溶液（0.2μgの/μl）を準備します。28,30Aβoが注入前に室温で1時間、動的かつ自然に集約できるようにします。 </li><li>輸液ポンプに210μlの注射器を取り付けます。滅菌蒸留水5μlのシリンジを埋めます。メスで長さが約60cmに2 PE50カテーテルをカット。 1ミリリットルのシリンジと21G針を用いて、滅菌蒸留水で両方のカテーテルを埋めます。 </li><li>カテーテルの一端に1ミリリットル注射器を維持し、ハミルトンシリンジにもう一方の端を接続します。 1ミリリットル注射器を取り外し、カテーテル内に気泡がないことを確認してください。 </li><li> PE50カテーテルの終わりに内部カニューレを挿入します。ハミルトンシリンジにμlでTO1までの滅菌蒸留水を使用して、PE50カテーテルに接続された内部カニューレを埋めます。 pで気泡を作ります2μlのまでピストンをバックulling。 </li><li>ピペッティング順守の最低限の先端を使用してAβo液を混ぜます。混合中に気泡を形成することは避けてください。 3.5μlのまでピストンを引き戻すことにより、Aβo液の1.5μlの持つ内部カニューレの両方を入力します。 </li><li>両方のカテーテルで行われ、気泡の前後にマーカーで線を作成します。これは現在進行中の輸液のチェックポイントとして機能します。注入のために、輸液ポンプの近くにケージを持参し、そのカバーを取り外します。 </li><li>寄り添いにおけるラットを置き、しっかりとラットの頭部を固定化するために、その首に寄り添いの腕をこすり。 2ガイドカニューレからダミーカニューレを取り外します。以前にガイドカニューレで製造した内部カニューレを挿入します。彼らは完全に挿入し、ガイドカニューレのベースにはよく固定されていることを確認します。 </li><li>寄り添いからラットを放し、競合ストレスを制限するために、そのケージに戻ってそれを置きます。カテーテルはtogetねじったりしないことを確実にするために密接に監視彼女と注入が適切に行われています。 </li><li>輸液ポンプの電源をオンにします。 0.1μL/分（10分）の速度でAβo溶液1μlを注入します。注入中、2.5μlの3.5μLから注射器ピストンが移動することを確認し、両方のPE50カテーテル内の気泡が連続的に移動すること。 </li><li> Aβoソリューションの効率的な拡散を可能にするために注入した後、別の5分間の場所に内部カニューレを残します。注入溶液の還流を防止するために、内部カニューレ、蓋をガイドカニューレを除去するために戻って寄り添いにおけるラットを持参してください。カニューレの角度アーム直前に停止ダミーカニューレを使用してください。そのケージに動物を返します。 </li><li>連続6日間にわたって1日1回Aβo注入を繰り返します。断頭により動物を安楽死させます。 </li></ol>

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特別な注意が必要で、このプロトコル内の重要なステップがあります。カニューレを移植する場合、第二のカニューレの穴をブロッキングを防止するためにあまりにも液体である歯科用セメントを入れないようにします。炎症および可能炎症反応を防止するために、ポンプに取り付けられたP50カテーテルの自由端に歯科用セメントを配置することが重要です。定位手術当日は、カニューレをブロックを回避するためにガイドカニューレと同じ長さであるダミーカニューレを使用します。しかし、ポンプをインストールした後、海馬へのポンプからの溶液の適切な注入を可能にするために、カニューレの角度アームの前に停止短いダミーカニューレを使用します。密接Aβo注入を監視し、カテーテルで行わ気泡が点滴中に連続的に移動していることを確認します。常に注入カニューレが完全に輸液中にガイドカニューレに挿入されていることを確認してください。 問題は、Aβ注入中の出会いである場合、内部カニューレがブロックされていないことを確認します。それが事実である場合、内部カニューレを通して滅菌蒸留水をフラッシュします。ガイドカニューレが閉塞されている場合は、ガイドカニューレに内部カニューレを回します。それ以外の場合は内部カニューレを上下に移動します。寄り添いにおける競合は、特に最初の日に、ラットのためにストレスになることができます。動物のストレスを減少させるために、我々は操作し、定位手術前に寄り添い匹のラットを慣らすことをお勧めします。 多くの利点は、 インビボのアプローチでは、この新規かつ柔軟に帰することができます。実際、Aβoの性質を正確に注入する前に制御することができる注入、及び（脳由来Aβ溶液対合成など）Aβ調製物の異なるタイプは、 インビボでそれらの神経毒性を評価するために注入することができます。このモデルはまたによって、様々なAβ種（ 例えば 、モノマー、低および高分子量オールメカニズムを調べるために使用することができigomers、プロトフィブリル）は、in vivoで神経毒性作用を誘導することができ、そしてどのように免疫療法などの治療法は、脳での有害な影響を打ち消すことがあります。点滴が目を覚まし、自由に動く動物で実行されているので、以前の研究で示されるように、シグナル伝達経路上の麻酔薬とAβo液との間には交絡の影響は、ありません。自由に動く動物で32,33煎茶も行動試験の任意と互換性があります注入の前と後の時間。 Aβoとポンプ設置の注入は、老化の間にAβoと治療の効果を決定するために、異なる年齢の動物で行うことができます。神経変性は、注入部位の近傍で発生するため、シナプスおよびニューロンの損失が異なり、局所的な脳領域に誘導することができます。担保Aβoの注入および制御（車両またはスクランブルAβ）は、同じ動物内の任意の変化を制御することができます。逆に、Aβoまたは制御ゾル行動タスクで動物をテストする際utionsには、例えば、左右の海馬に両側性に注入することができます。 Aβoと治療の注入は同時に行うか、代わりにポンプすることができ、治療がAβ沈着後に有効であるかどうかを評価するためにAβo注入後にインストールすることができます。 Aβoの脳室内注入を行う際に、ここで説明したものと同じプロトコルを使用することもできます。細胞内シグナル伝達経路にAβoの効果が適度に短い時間枠内でのニューロン損失の前後に評価することができます。 Aβ注入のドーズ量及び数は、多かれ少なかれ深刻なAβの病原性が得られるように調整することができます。 非常に汎用性が、この技術はいくつかの制限を有します。カニューレの移植は、手術後の最初の数日で組織および神経炎症の機械的破壊を生成します。 Aβoinfuを開始する前に、このように、手術後少なくとも1週間待つことが必須ですシオン、およびこれらのイベントを考慮に入れるために、適切なコントロール（車両または不活性スクランブルAβの注射）を追加します。また、Aβoのわずかな体積は、溶液の拡散を制限するために注入することができます。 浸透圧ポンプは、Aβ誘発性神経変性を防止するように設計された薬剤の前臨床検証のための便利でユニークな配信方法を表します。 6E10抗体を用いた免疫療法は以前に、脳内の31の Aβの蓄積を減少させることが示されているので、私たちは私たちの新しいin vivoでのアプローチを検証するために、概念実証として6E10抗体を使用します。このモデルでは浸透圧ポンプを用い今前臨床AD患者におけるAβoの堆積および神経毒性を防ぐことができる新規の疾患修飾治療薬を開発するために使用される可能性があります。

当初は、脳内の不溶性Aβ種の蓄積は、ADの病因の中心であったことを提案した。1,2しかしながら、アミロイド斑はまた、高齢者のいくつかの認知的に正常に検出された。3-7プラーク沈着と認知障害との間に存在する貧困層の相関関係を克服するためにAβオリゴマー化のプロセスは非常に動的であるので、ADで、最新のレポートは患者の臨床状態にはるかに良い相関性疾患の発症、で毒性の可溶性Aβoの存在を示している。8月14日 、それはその神経毒性を示唆されました代わりに、オリゴマーの1つの特定のタイプの様々なAβoによって誘導される。14-16を多くの研究がAβoはシナプスとニューロンの喪失の前にシナプス機能障害を開始できることが示されているので、17-24現在の理論は、Aβ関連の治療はに効果的であるかもしれないことを示しています早期ADのではなく、臨床試験において、これまでテストしたとして、後の段階で。 ADの病因の一つ顕著な特徴は、疾患の後期段階で観察された大規模かつ広範な細胞死、および記憶障害は、臨床レベルで検出可能になる局在化した脳領域で観察された重要なシナプスとニューロンの損失です。歯状回（DG）に嗅内皮質（EC）から突出し有孔質路は、ADの早期発症で顕著に乱される。25,26 ADの前駆状態では、軽度認知障害（MCI）は、見かけ上の有意な細胞死になったときDGにおけるシナプスの損失だけでなく、ECにおいて検出される。25,26 証拠の大きな体が早期ADにおいて可溶性Aβoの毒性作用を正確に指摘したが、神経細胞培養又は器官脳スライス培養で観察された8月14日 Aβo誘発性神経変性は、動物モデルで再現することがより困難となっている。27トランスジェニックADの大半Aを過剰発現するモデルβは、アミロイド斑、タウの過剰リン酸化、シナプス欠損及び記憶障害を有する。27しかし 、これらのモデルは、AD患者の海馬で観察されたモデル化された細胞死にそれほど成功しています。これらの技術的な問題を克服するために、我々は、可溶性Aβoの脳内の注入に基づくモデルを開発しました。私たちは、可溶性Aβoの海馬内注入が緩やかニューロン損失およびタウの過剰リン酸化、ADにおけるメモリの減少に関連する2つの病理学的特徴を誘導繰り返しその先に報告した。28ここでは、特別にAβoの同時注入のために設計カニューレを使用してテストAD治療に新規な方法を示していますそして、浸透圧ポンプとAβo抗体（6E10）の連続注入。 浸透圧ポンプは、直接Aβoの注入部位での生体内で Aβo誘発性神経変性に対する任意の抗体（または他の化合物）の効率をテストするためのユニークな方法を提供します。したがって、これらはポンプのrepr固体の概念実証ADにおける潜在的な治療薬の作用機序に関するを確立するための便利なツールをESENT。最近の報告は、ADの初期段階における可溶性Aβoの重大な影響を指摘しているので、Aβoに向けて多くの治療法は、実際に大学や製薬研究所によってテストされています。この新規な動物モデルは、初期ADにおいて観察されたシナプスおよびニューロンの損失を模倣することができ、浸透圧ポンプはAβo注入部位に特異的に連続的に治療剤を注入するために使用されます。患者を軽度から中等度で、過去数年間にわたって試験AD治療の繰り返しの失敗はAβoが豊富に蓄積し、不可逆的な脳損傷を生成するために開始する前に、前認知症患者に臨床試験を開始するために研究者を促しました。この文脈では、堆積およびAβoの結果として神経毒性を防止する新規化合物を試験することは前臨床患者への関心であるかもしれません。

<table><tbody><tr><td>Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-7316</td><td></td></tr><tr><td>PE 50 Catheter thin wall</td><td>Plastics one</td><td>C232CT</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml)</td><td>Bioniche</td><td>1989529</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml)</td><td>Bimeda</td><td>8XYL004C</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (5 mg/ml)</td><td>Norbrook</td><td>215670I01</td><td></td></tr><tr><td>Solution of chlorhexidine gluconate 2% and isopropyl alcohol 2%</td><td>Carefusion</td><td>260100C</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine Hydrochloride</td><td>Alveda Pharma</td><td>0122AG01</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaine Hydrochloride</td><td>Hospira</td><td>1559</td><td></td></tr><tr><td>ophthalmic ointment</td><td>Baussh and Lomb inc.</td><td>2125706</td><td></td></tr><tr><td>stereotaxic frame</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>stereotaxic cannula holder arm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-4837</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Dremel</td><td>8050-N/18</td><td></td></tr><tr><td>Guide Cannula</td><td>Plastics one</td><td>326OPG/spc</td><td></td></tr><tr><td>Injection Cannula</td><td>Plastics one</td><td>C315I/spc</td><td></td></tr><tr><td>Dummy Cannula</td><td>Plastics one</td><td>C315DC/spc</td><td></td></tr><tr><td>Suture thread coated vicryl rapide 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VR2297</td><td></td></tr><tr><td>Dental Acrylic Cement</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-6906</td><td></td></tr><tr><td>Screws</td><td>JI Morris Company</td><td>P0090CE125</td><td></td></tr><tr><td>6E10 antibody (mouse IgG1 isotype)&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>803003</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 isotype control antibody</td><td>Abcam</td><td>AB18447</td><td></td></tr><tr><td>Alzet osmotic pumps model 1007D</td><td>Durect corporation</td><td>290</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>CA2L9100</td><td></td></tr><tr><td>Amyloid-beta 1-42&amp;nbsp;</td><td>rPeptide</td><td>A-1163-1</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe (10 &amp;micro;l)</td><td>Fisher Scientique</td><td>14815279</td><td></td></tr><tr><td>Infusion Syringe Pump CMA 402</td><td>Harvard Apparatus</td><td>CMA8003110</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Needle 21 G</td><td>Terumo</td><td>NN-2125R</td><td></td></tr><tr><td>Snuggle</td><td>Lomir Biomedical</td><td>RTS04</td><td></td></tr></tbody></table>

neurodegeneration in an animal model of chronic amyloid-beta oligomer infusion is counteracted by antibody treatment infused with osmotic pumps

（事実とイベント用メモリ）海馬依存性の明示的なメモリの減少は、アルツハイマー病（AD）の最も初期の臨床症状の一つです。よくシナプス損失とその後の神経変性は、ADにおける記憶障害のための最良の予測因子であることが確立されています。最新の研究では、臨床症状が明らかになる前に、約10〜15年に人間の脳内に蓄積し始め、可溶性アミロイドβオリゴマー（Aβo）の神経毒性の役割を強調してきました。多くの報告は、可溶性AβoがADモデルおよびヒトにおける記憶障害と相関することを示しています。神経と脳スライス培養で観察されたAβo誘発性神経変性は、多くの動物モデルで再現することがより困難となっています。ここに示した繰り返しAβo注入のモデルでは、この問題を克服し、新たな疾患修飾治療薬を開発するための2つの主要なドメインに対処できるように：早期ADを診断するための生物学的マーカーを同定し、分子メカを決定しますニズムは、ADの発症にAβo誘発性記憶障害を支えます。比較的速い患者の臨床状態とあまり相関しない不溶性Aβフィブリルへの可溶性Aβo集約するので、可溶性Aβoを新たに用意されていると海馬でマークされた細胞死を生成するために6日間一日一回当たりの注射しました。我々は、特別にAβoと浸透圧ポンプを用いて、海馬におけるAβo抗体（6E10）の連続注入の同時注入のために設計カ​​ニューレを使用していました。 生体内の方法で革新的なこれは今前認知症患者におけるAβoの堆積および神経毒性を妨げる可能性がある新しいAD治療の効率を検証するための前臨床試験に使用することができます。

Aβoの神経毒性効果は、カニューレを注入することによってロングエバンスラットで調べました 海馬のDG。可溶性Aβoが6日連続にわたって毎日注射した。我々は、特別に浸透圧ポンプ（ 図1A）を使用して海馬にAβoの同時点滴と連続6E10の注入または対照IgG1抗体のために設計カニューレを使用していました。免疫組織化学ラットを麻酔したため、0.9％NaClを経心的に灌流し、脳を24時間、48時間、15％スクロース溶液を4％パラホルムアルデヒド溶液に浸漬しました。自由に浮遊冠状切片（40μm）を1時間1％ヤギ血清でブロックし、30分間、0.3％H 2 O 2で処理し、抗汎Aβ抗体と共に4℃で一晩インキュベートしました。セクションは、抗体を適用する前に、3分間70％ギ酸で処理しました。検出は、ABC複合体及び0を用いて行きました。05パーセントの3,3-ジアミノベンジジンソリューション。切片をトルエン5分間でインキュベートし、ゼラチンコートスライドガラス、空気乾燥させ、2時間、脱水し（30、70、95、100％のアルコール）に取り付けられ、カバースリップしました。クレシルバイオレット染色のために、切片を、0.5％クレシルバイオレット溶液で10分間インキュベートしたトルエン5分間に浸漬（70、95、および100％アルコール）脱色0.5％酢酸溶液で1分間インキュベートし、そしてで覆われガラスカバースリップ。 ここに示された結果は、この蓄積に関連する注入部位近傍のDGにおけるAβoの堆積、及び細胞死を示します。私たちは、レベルAβoは、実質的に6E10抗体処理（ 図1B）により減少したことがわかりました。マーク神経変性はAβoの注入部位の近くで観察し、6E10抗体処理（ 図1B）によって減衰しました。これらの結果は、我々はDGで観察Aβo蓄積と一致していますここに示した6E10抗体を用いた免疫療法によるアミロイド沈着のマウスで繰り返さAβo注入を以下に示します。28クリアランスは、トランスジェニックADマウスモデルにおいて行われ、別のレポートに沿ったものである。31 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54215/54215fig1.jpg" /> Aβo注入中二国間カニューレと動物の 図1. 写真 Aβoの溶液。（0.2μgの/μlの; 1μl）を、内部カニューレに接続されたPE50カテーテルを用いて、（6日間、1日1回）目を覚まし、自由に移動したラットに注射しましたガイドカニューレに挿入。コントロール（CTL）IgG1または6E10抗体を用いた治療は、動物の肩甲骨の間の皮下に位置する浸透圧ポンプを使用してAβo注入部位に直接注入した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54215/54215fig1large.jpg" target="_blank">目の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>図です。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54215/54215fig2.jpg" /> 。のCtl（IgG1の）で6日間連続一日一回注射し、処理したかで6E10抗体;Aβo沈着により誘発される 図2. ニューロン損失は、6E10抗体治療 A、Aβo（1μL/μlの0.2μgの） によって減衰されます浸透圧ポンプを用いて、注入のサイト。B、カニューレ挿入、およびセル損失を示すクレシルバイオレットでの代表的な染色にすぐに次のセクションにDGでAβoの代表的な蓄積。スケールバー：50μmの（n = 4）は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54215/54215fig2large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps

To study the effects of A&#946;o in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble A&#946;o coupled with continuous infusion of A&#946;o antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of A&#946;o.

慢性アミロイドβオリゴマー輸液の動物モデルにおける神経変性は、浸透圧ポンプを用いて抗体治療フューズによって打ち消されます

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It ...

neurodegeneration-an-animal-model-chronic-amyloid-beta-oligomer

Research

JoVE Journal

Medicine

9.2K ビュー.  Université de Montréal. To study the effects of Aβo in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble Aβo coupled with continuous infusion of Aβo antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of Aβo.

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Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

β-アミロイドオリゴマーの調製 1から42まで</sub海馬スライスでのシナプス可塑性の減損の>と誘導

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

神経科学

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer is widely accepted as the leading neurotoxin in the progress of Alzheimer&#39;s disease (AD) and is considered to be the crucial event in the pathogenesis of AD. Therefore, A&#946; oligomer inhibitors might prevent neurodegeneration and have the potential to be developed as disease-modifying treatments of AD. However, different formation protocols of A&#946; oligomer might lead to oligomers with different characteristics. Moreover, there are not many methods to effectively screen A&#946;1-42 oligomer inhibitors. An A11 antibody can react with a subset of toxic A&#946;1-42 oligomer with anti-parallel &#946;-sheet structures. In this protocol, we describe how to prepare an A11-positive A&#946;1-42 oligomer-rich sample from a synthetic A&#946;1-42 peptide in vitro and to evaluate relative amounts of A11-positive A&#946;1-42 oligomer in samples by a dot blotting analysis using A11 and A&#946;1-42-specific 6E10 antibodies. Using this protocol, inhibitors of A11-positive A&#946;1-42 oligomer can also be screened from semi-quantitative experimental results.

This protocol describes how to prepare A&#946; oligomers from a synthetic peptide in vitro and to evaluate relative amounts of A&#946; oligomer by a dot blotting analysis.

A11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

生化学

Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer's Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure change. With the increase of AD patients worldwide, the pathology and treatment of the disease has become a focus in the International Pharmaceutical Industry. Thus, the establishment of the animal model to mimic AD in the laboratory is of great importance.
Here, we describe a detailed protocol for establishing a mimic of AD in a rat animal model though intracerebroventricular injection of amyloid beta protein 25-35 (A&#946;25-35) combined with aluminum trichloride (AlCl3) and anterodorsal thalamic nucleus injection of recombinant human transforming growth factor-&#946;1 (RHTGF-&#946;1) to rats. The related markers of AD were measured, including: spatial memory, neuronal structure and substructure, neuronal A&#946;, and neurofibrillary tangles (NFT) production. This rat model demonstrates spatial memory impairment, neuronal structure and substructure pathological changes, neuron intracellular A&#946; burden, and NFT aggregation, and provides a close mimic of the neuronal structure and function disorder to that of clinical AD patients. Thus, the presented AD rat modelprovides a valuable in vivo tool for exploring neuronal function, neuronal pathology, and drug screening of AD.

This is a protocol to mimic Alzheimer&#39;s Disease in rats by evaluation of spatial memory impairment, neuronal pathological changes, neuronal amyloid beta protein (A&#946;) burden, and neurofibrillary tangles aggregation, induced by the injection of A&#946;25-35 combined with aluminum trichloride and recombinant human transforming growth factor-&#946;1.

合成アミロイド β 蛋白の脳室内投与によるラットの動物モデルにおけるアルツハイマー病の貴重な模倣の確立

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure ...

行動学

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Intracerebroventricular Injection of Amyloid-&#946; Peptides in Normal Mice to Acutely Induce Alzheimer-like Cognitive Deficits

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, progressive accumulation of A&#946; oligomers and plaques is observed. Such A&#946; abnormalities are believed to block long-term potentiation, impair synaptic function, and induce cognitive deficits. Clinical and experimental evidences have revealed that the acute increase of A&#946; levels in the brain allows development of Alzheimer-like phenotypes. Hence, a detailed protocol describing how to acutely generate an AD mouse model via the intracerebroventricular (ICV) injection of A&#946; is necessary in many cases. In this protocol, the steps of the experiment with an A&#946;-injected mouse are included, from the preparation of peptides to the testing of behavioral abnormalities. The process of preparing the tools and animal subjects before the injection, of injecting the A&#946; into the mouse brain via ICV injection, and of assessing the degree of cognitive impairment are easily explained throughout the protocol, with an emphasis on tips for effective ICV injection of A&#946;. By mimicking certain aspects of AD with a designated injection of A&#946;, researchers can bypass the aging process and focus on the downstream pathology of A&#946; abnormalities.

The amyloid-&#946; (A&#946;)-injected animal model enables the administration of a defined quantity and species of A&#946; fragments and reduces individual differences within each study group. This protocol describes the intracerebroventricular (ICV) injection of A&#946; without stereotactic instruments, enabling the production of Alzheimer-like behavioral abnormalities in normal mice.

急性アルツハイマーなどの認知障害を誘発するために正常マウスにおけるアミロイドβペプチドの脳室内注射

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, ...

Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible for phagocytosis and clearance of debris and detritus. These cells include CNS-resident macrophages known as microglia, and mononuclear phagocytes infiltrating from the periphery. Light microscopy has generally been used to visualize phagocytosis in rodent or human brain specimens. However, qualitative methods have not provided definitive evidence of in vivo phagocytosis. Here, we describe quantitative 3D in silico modeling (q3DISM), a robust method allowing for true 3D quantitation of amyloid-&#946; (A&#946;) phagocytosis by mononuclear phagocytes in rodent Alzheimer&#39;s Disease (AD) models. The method involves fluorescently visualizing A&#946; encapsulated within phagolysosomes in rodent brain sections. Large z-dimensional confocal datasets are then 3D reconstructed for quantitation of A&#946; spatially colocalized within the phagolysosome. We demonstrate the successful application of q3DISM to mouse and rat brains, but this methodology can be extended to virtually any phagocytic event in any tissue.

Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

We developed a methodology for quantitative 3D in silico modeling (q3DISM) of cerebral amyloid-&#946; (A&#946;) phagocytosis by mononuclear phagocytes in rodent models of Alzheimer&#39;s disease. This method can be generalized for the quantitation of virtually any phagocytic event in vivo.

定量的3D<em&gt;インシリコ</emアルツハイマー病の齧歯類モデルにおける脳アミロイドベータ食作用の&gt;モデリング（q3DISM）

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible ...

医学

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing neuronal dysfunction which eventually leads to cognitive decline. Hyperphosphorylated tau aggregates in the neuron are believed to cause most of the pathology associated with AD. These aggregates are assumed to be released into the extracellular compartment and taken up by adjacent healthy neurons where they induce further tau aggregation. This &#34;prion-like&#34; spreading can be interrupted by antibodies capable of binding and &#34;neutralizing&#34; extracellular tau aggregates as shown in preclinical mouse models of AD. One of the proposed mechanisms by which therapeutic antibodies reduce pathology is antibody-mediated uptake and clearance of pathological aggregated forms of tau by microglia. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess tau uptake by microglia. This assay uses the mouse microglial cell line BV-2, allows for high specificity, low variability and medium throughput. Data generated with this assay can contribute to a better characterization of anti-tau antibody effector functions.

Here we describe a cell-based assay to quantitatively assess tau uptake by microglia with the aim of creating an investigational tool to better characterize the mechanisms of action of anti-tau antibodies.

タウの抗体を介したミクログリアによってクリアランスを勉強するセルベースのアッセイ

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic amyloid-&#946; (A&#946;) fragments, eventually leading to the classical features of the disease: amyloid plaques, neurofibrillary tangles and synaptic and neuronal loss. The lack of relevant non-transgenic preclinical models reflective of disease progression is one of the main factors hindering the discovery of effective drug treatments. To this end, we have developed a protocol for the fabrication of alginate microbeads containing amyloid-secreting cells useful for the study of the effects of chronic A&#946; production.
Chinese hamster ovary cells previously transfected with a human APP gene, secreting A&#946; (i.e., 7PA2 cells), were used in this study. A three-dimensional (3D) in vitro model for the sustained release of A&#946; was fabricated by encapsulation of 7PA2 cells in alginate. The process was optimized to target a bead diameter of 500-600 &#956;m for further in vivo studies. Optimization of 7PA2 cell encapsulation in alginate was performed altering fabrication parameters, e.g., alginate concentration, gel flow rate, electrostatic potential, head vibration frequency, gelling solution. Levels of secreted A&#946; were analyzed over time and compared between alginate beads and standard cell culture methods (up to 96 h).
A concentration of 1.5 x 106 7PA2 cells/mL and an alginate concentration of 2% (w/v) buffered with HEPES and subsequent gelation in 0.5 M calcium chloride for 5 min were found to fabricate the most stable microbeads. Fabricated microbeads were 1) of uniform size, 2) with an average diameter of 550 &#956;m, 3) containing about 100-150 cells per microbead and 4) able to secrete A&#946;.
In conclusion, our optimized method for the production of stable alginate microbeads containing amyloid-producing 7PA2 cells might enable the modeling of important aspects of AD both in vitro and in vivo.

This protocol illustrates a cell encapsulation method by rapid physical gelation of alginate to immobilize cells. Obtained microbeads allow controlled and sustained secretion of amyloid-&#946; over time and can be used to study the effects of secreted amyloid-&#946; in in vitro and in vivo models.

アルツハイマー病のモデリングに用いられるアミロイドβ分泌アルギン酸マイクロビーズの製造

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...

生物学

Controlled Infusion of A&beta; Peptide-Specific Antibodies and A&beta; Oligomers into the Rat Hippocampus

Source: Sajadi, A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54215">Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a technique for the continuous infusion of amyloid-beta (A&#946;) peptide-specific antibodies into the hippocampus of a rat. The study employs implanting a bilateral cannula system for a controlled infusion of A&#946; peptide-specific antibodies coupled with the infusion of soluble A&#946; oligomers (A&#946;o) into the rat hippocampus to study the interactions between the oligomers and the antibodies.

Aβペプチド特異的抗体とAβオリゴマーのラット海馬への制御注入

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

抗体ベースの技術

抗体ベースのイメージングと検出方法

Direct Stereotaxic Brain Infusion of Amyloid-Beta Proteins for an Alzheimer's Disease Model

Source: Jean, Y. Y. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52805">Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the precise stereotaxic infusion of amyloid beta into the dentate gyrus to establish a mouse model of Alzheimer&#39;s disease. Accurate coordinate determination and controlled delivery of amyloid beta proteins result in neuronal degradation, disrupting memory processing and contributing to Alzheimer&#39;s disease development.

慢性アミロイドβオリゴマー輸液の動物モデルにおける神経変性は、浸透圧ポンプを用いて抗体治療フューズによって打ち消されます

要約

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この動画の章

β-アミロイドオリゴマーの調製_{1から42までと誘導}

A11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析

合成アミロイド β 蛋白の脳室内投与によるラットの動物モデルにおけるアルツハイマー病の貴重な模倣の確立

マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入

急性アルツハイマーなどの認知障害を誘発するために正常マウスにおけるアミロイドβペプチドの脳室内注射

定量的3D

タウの抗体を介したミクログリアによってクリアランスを勉強するセルベースのアッセイ

アルツハイマー病のモデリングに用いられるアミロイドβ分泌アルギン酸マイクロビーズの製造

Aβペプチド特異的抗体とAβオリゴマーのラット海馬への制御注入

アルツハイマー病モデルのためのアミロイドベータタンパク質の脳定位直接注入

慢性アミロイドβオリゴマー輸液の動物モデルにおける神経変性は、浸透圧ポンプを用いて抗体治療フューズによって打ち消されます

要約

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β-アミロイドオリゴマーの調製 1から42までと誘導

A11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析

合成アミロイド β 蛋白の脳室内投与によるラットの動物モデルにおけるアルツハイマー病の貴重な模倣の確立

マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入

急性アルツハイマーなどの認知障害を誘発するために正常マウスにおけるアミロイドβペプチドの脳室内注射

定量的3D

タウの抗体を介したミクログリアによってクリアランスを勉強するセルベースのアッセイ

アルツハイマー病のモデリングに用いられるアミロイドβ分泌アルギン酸マイクロビーズの製造

Aβペプチド特異的抗体とAβオリゴマーのラット海馬への制御注入

アルツハイマー病モデルのためのアミロイドベータタンパク質の脳定位直接注入

β-アミロイドオリゴマーの調製_{1から42までと誘導}