治療抗タウ抗体がアルツハイマー病における病理を低下させる提案されたメカニズムの1つは、ミクログリアによる病理学的凝集元タウのクリアランスにおける取り込みである。ここでは、ミクログリアによるタウの取り込み評価用の細胞ベースアッセイを提示する。このアッセイは、抗タウ抗体の作用機序をより良く特徴付けるための有用な調査ツールを表す。
実験の初日に、培養したフラスコに1xPBSでBV-2細胞を最初に洗浄して調製します。その後、37°Cで05%トリプシンEDTA、フラスコから取り外すまで5%C02でインキュベートします。3~5回上下にピペットを入れ、培地中の細胞を再懸濁する。
細胞を数え、1ミリリットルヘパリン当たり200マイクログラムを含有する培地中で1ミリリットル当たり100,000個の細胞を最終的に濃度100,000個の細胞懸濁液で調製する。96ウェル組織培養フラットボトムプレートにウェルあたりこの細胞懸濁液の250マイクロリットルを追加します。一晩で5%C02で摂氏37度でプレートをインキュベートします。
前に調製したpH色素タウ凝集体を氷上で解凍した後、血清遊離培地の条件ごとに65マイクロリットルで希釈し、500ナノモル溶液を作った。65マイクロリットルの血清遊離培地で希釈抗体を用い、所望の濃度の2倍を達成する。pH色素タウ凝集体と抗体を96ウェルU-底板に混ぜます。
この希釈板を密封し、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、BV-2細胞を含む96ウェルプレートから培地を取り除きます。室温1x PBSの100マイクロリットルで各ウェルの細胞を洗浄します。
BV-2細胞板からPBSを取り除きます。マルチチャネルピペットを使用して、希釈板から96ウェルBV-2セルプレートの各ウェルに125マイクロリットルのアミノ複合体を移し、5%CO2で摂氏37度で2時間インキュベートします。培養後、細胞からアミノ複合体を除去し、各ウェルの細胞を100マイクロリットルの室温1x PBSで洗浄します。
1x PBSを取り除いた後、25%トリプシンEDTAの50マイクロリットルを加え、5%CO2で摂氏37度で20分間インキュベートします。その後、培養培地を200マイクロリットル加え、上下にピペットしてウェルを再中断して細胞を取り外します。細胞を96ウェルUボトムプレートに移し、400 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
プレートを氷の上に置き、培地を取り除きます。氷冷1x PBSの150マイクロリットルを加え、400 gで摂氏4度で5分間遠心分離機を追加します。プレートを氷の上に置き、以前に添加した1x PBSを取り除き、井戸あたり150マイクロリットルの氷冷PBSを加えて再び洗います。
同じ条件下で再び遠心分離機。プレートを氷の上に置き、以前に添加したPBSを取り除き、ウェルあたり150マイクロリットルのFACSバッファーを加えることによって細胞を洗浄します。摂氏4度で5分間400gで再び遠心分離機。
プレートを氷の上に置き、以前に追加したFACSバッファを取り除き、ウェルあたり200マイクロリットルのFACSバッファで細胞を再中断します。すぐにFACSによる分析に進み、生細胞ゲートで20,000のイベントを獲得します。FACS 解析では、前方散乱領域または FSCA 対側散乱領域または SSCA 密度プロットを使用して、破片や死んだ細胞などの前方散乱レベルが低いイベントを除外して、ライブ セルにゲートします。
次に、生細胞集団内でFSCAと前方散乱高さまたはFSCHを使用して、シングルゲートを作成し、セルのダブレットと集計を除外します。次に、シングルゲートのイベントを使用して、pH色素の単一パラメータヒストグラムを生成します。生成されたヒストグラムを使用して、まず平均蛍光強度を決定します。
その後、BV-2の唯一の対照を決定した陰性細胞を除外してpH色素タウ陽性細胞の割合を決定した。CBTau-28.1抗体は、フローサイトメトリーによって示されるように用量依存的な方法でBV-2細胞におけるタウの取り込みを促進する。高親和性の二重変異型CBTau-28.1抗体は、野生型抗体よりも高い程度にBV-2細胞におけるタウ取り込みと媒介した。
CBTau-28.1 Fab断片は、FC受容体媒介性内在化機構を示す基底タウ取り込みを増加しなかった。共焦点顕微鏡は、タウの取り込みの抗体媒介性増加を確認した。タウ凝集体に標識された緑色のpH色素は、しばしばリソトラッカーレッド染料染色された酸性小器官と共局化し、したがって内皮コンパートメントにおけるタウ凝集体の存在を示唆する。
CBTau-28.1 Fabフラグメントは、取り込みが実際にFC仲介されたことを示すタウの取り込みを再び増加させなかった。我々が今述べたアッセイは、我々が特異的に一貫してミクログリアによるタウの取り込みを媒介した抗体を定量化することを可能にする。このアッセイで生成されたデータは、抗タウ抗体の作用機序を解明するのに役立つため、抗タウ抗体を前進させ、潜在的なAD治療として開発をさらに進める有用なツールを表すことができます。
