Thanks to Kenn D. M&#248;ller and Claus Sternberg (DTU) for technical assistance and to Tue S. J&#248;rgensen for quantitative PCR analysis.

注：環状DNAの精製および配列決定法（サークルSEQ）の概要を図1に示されています。 1.栽培、細胞の収穫とプラズマ膜破壊<ol><li>酵母ペプトンデキストロースの50ミリリットル完全な栄養培地（YPD）にO / N培養物から（例えば、 サッカロマイセス・セレビシエのための）酵母細胞を接種します。 1-3×10 5細胞/ mlまたは約0.01 OD 600の光学密度の低い初期細胞密度で接種します。 <ol><li>細胞が約24〜48時間またはOD 600&gt; 10.0での光学密度の後、約1×10 10細胞の最大細胞密度に達するまで分（RPM）あたり150ラウンドで攪拌しながら30℃で細胞をインキュベートします。 注：より低い細胞濃度を使用することができるような培養時間は重要ではありません。 </li></ol></li><li>で遠心分離して細胞をペレット、50mlコニカルチューブに手狭文化を転送800×gで3分間、上清を捨てます。 </li><li> 3分間800×gでの遠心分離によって細胞を再ペレット化し、上清を捨て、10 mMのトリス-Cl、1 mMのEDTA、pH8.0の25mlの緩衝液でペレットを洗浄します。 </li><li>プラスミドカラム精製キットから供給された1.2ミリリットル再懸濁緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>オプションの手順：環状DNAエレメント20の精製の ​​ための対照として、高度に希釈されたプラスミドを追加します。 注：現在のデータセットにおいて、7.7μlのプラスミド混合物は、10 10個の細胞を含む各試料に適用しました。プラスミドストック混合物は、異なる濃度で3つのプラスミドから構成され; 0.01 ngの/サンプルの38 ngの/サンプルでのpBR322、pUC19の0.5 ngの/サンプルで、とpUG72。 </li><li>総懸濁液体積の3比はそれぞれ1での0.5mmガラスビーズを補充二つ2 mlのマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液を移します。 </li><li>形質細胞を破壊する10分間ボルテックス最大スピードで各チューブを膜。 30秒間268×gの遠心分離によってビーズをペレット化し、新しいチューブに2マイクロ遠心チューブから1.2ミリリットルを組み合わせた上清を移します。 注：代替0.6ミリリットルの再懸濁緩衝液中で細胞を破壊するためにザイモリアーゼを使用して、1.6から1.7に進みます。ザイモリエイスの十単位は35℃で1.5時間以内に5×10 7細胞を破壊することができます。 </li></ol> 2. EccDNA濃縮カラムクロマトグラフィーにより、 <ol><li>プラスミドのカラム精製のためのキットからのプロトコルに従ってください。簡単に言えば、穏やかに混合し、室温で3分間インキュベートする、1.2ミリリットルのアルカリ性溶液を用いて、各サンプルを処理します。 </li><li> 、1.2ミリリットル中和緩衝液を追加し、5分間9650×gで穏やかに遠心混ぜます。 </li><li> 1ミリリットルの平衡溶液で平衡化したカラムに溶液をロードし、液体が重力によってカラムを通って流れることを可能にします。 </li><li> 4ミリリットル洗浄液でカラムを洗浄。解決策は、樹脂を通過した場合には、慎重にそのように0.3ミリリットルの溶出を追加リューションは、0.35ミリリットルのカラム空隙容量のほとんどを交換します。 </li><li> 1ミリリットルの溶出液で新しいコレクションチューブにDNAを溶出し、0.8ミリリットル沈殿混合物を加えることによって、DNAを沈殿させます。 10分間、9650×gで遠心分離します。 </li><li> 5〜15分間、0.5ミリリットルの70％エタノール、5分間、9650×gで遠心分離、空気乾燥してDNAペレットを洗浄し、25μlの滅菌水で精製したDNAを溶解します。 注：水だけでDNAの短期間の保存が推奨されます。優先的には、ステップ3に直接進みます。 </li></ol>残りの線状染色体DNAの3消化<ol><li>オプションの手順：などのNotIなどのレア切断エンドヌクレアーゼで精製したDNAを扱う、エキソヌクレアーゼにより線状DNAの特定の消化を促進するために。 5μgのDNAについて、総容量50μlに1単位のNotI、5μlの10×消化緩衝液および滅菌水を使用しています。 16時間熱を5分間80℃で酵素を不活化し、37℃で反応をインキュベートします。 </li><li> 20を追加します。単位のエキソヌクレアーゼ（2μl）を、4μlのATP（25 mM）の、34μlの滅菌水および50μlの酵素で切断されたDNAに直接10μlの10×反応緩衝液は、ATP依存性エキソヌクレアーゼを使用して、100μlのの1×反応容量に到達しますキット。 </li><li> 5日以上、37℃における線一本鎖および二本鎖DNAの加水分解を行います。さらに4μlのATP（25 mM）の、0.6μlの10×反応緩衝液および1×反応容積で酵素DNA消化を続けるために24時間毎に、エキソヌクレアーゼ20単位を追加します。 </li><li>直鎖状DNAを除去した後、エキソヌクレアーゼ処理された溶液からの試料2μlを、アクチン遺伝子ACT1 20として染色体マーカーを用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）によって染色体線状DNAの除去を確認しました。 <ol><li>各20μlの定量PCR反応容量は2μlのエキソヌクレアーゼ処理サンプルが含まれ、150 nmのACT1プライマー 5&#39;-TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3 &#39;および5&#39;-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3 &#39;、2％（体積/体積）のジメチルスルホキシド、及び10μlの緑色蛍光マスターミックス。 </li><li>反応条件を使用します。 95℃で15秒間の45サイクル、60℃で30秒間、続いて95℃で3分。 注：この遺伝子におけるコピー数の変動が21-23有害であるのでeccDNAがACT1を運ぶべきではありませんので、ACT1は、直鎖状DNAに特に適しマーカーです。 </li><li>定量PCRによるDNAの消化の分析に代わるものは、標準的なPCR（4.3）またはヨウ化プロピジウム染色（4.4）です。 <ol><li> 2μlのエキソヌクレアーゼ処理したサンプルは、ACT1プライマー 5&#39;-TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3 &#39;および5&#39;-GAACGACGTGAGTAACACC-3&#39;を用いて、PCRテンプレートとして使用します。ポジティブACT1制御としては、50から100 ngのゲノムS.を使用テンプレートとしてセレビシエ DNA。 PCR反応条件。 95℃で30秒間の35サイクル、56℃で30秒、72℃で1分間、続いて95℃で3分。 </li><li>ゲルelectrophoreによりPCR反応を実行します。0.5μgの1％アガロース上でSIS / mlの臭化エチジウム。 0.8キロバイトACT1バンドを探してください。 </li></ol></li><li>直鎖状DNAの有無は、DNA増幅の前後のヨウ化プロピジウム染色により調べることができます。 <ol><li> 20 mMのヨウ化プロピジウム株式の千H 2 O-希釈液：1と1の体積：1で各DNAサンプルを混ぜます。 RTで10-20分間、暗闇の中で解決策を残し、663から738 nmおよび5〜30秒の露光時間で赤励起蛍光フィルターを使用して、100倍の倍率で蛍光顕微鏡でDNA染色を分析します。 DNA染色対照として、使用酵母および/またはO29増幅プラスミドからのゲノムDNAをO29に増幅します。 </li></ol></li></ol></li><li>熱は、30分間70℃でエキソヌクレアーゼ溶液を不活性化します。 </li></ol> 4. DNA増幅<ol><li>精製した増幅およびO29のDNAポリメラーゼ24-26アコードとステップ3.5）からeccDNAを豊かにポリメラーゼメーカーのプロトコルにる。 <ol><li>簡単に言えば、5μlの変性緩衝液でeccDNA富んだ5μLを混合します。 </li><li> RTで3分後、10μlの中和緩衝液を追加します。穏やかに混合し、29μlの反応バッファー及び1μlのO29のDNAポリメラーゼを含む30μlのマスターミックスを追加します。 （72時間まで）16時間以上30℃で反応をインキュベートします。熱は、3分間65℃でO29 DNAポリメラーゼを不活性化します。 </li></ol></li></ol> 5.配列決定およびデータ解析<ol><li> 300塩基対の平均目標ピークの大きさに集束超音波装置を用いて増幅eccDNAせん断。 450Wピーク強度パワー、60秒の処理、30％のデューティ・ファクタ、バーストあたり200サイクル、温度7°C：130μlのDNAサンプルに対して次の設定を使用します。 </li><li>断片化にバーコードのインデックスラベルおよびアダプタを追加ライブラリーを調製するための適切な方法を用いて、配列決定のためのライブラリーの合成のために読み込みます。 </li><li>141ヌクレオチドのシングルエンドはハイスループットシークエンシング・プラットフォーム上で読み込むように、たとえば、深いシーケンシングを実行します。 </li><li>地図は、調査中の酵母参照ゲノムに読み込み、許可する複数の領域にマッピングするために読み取ります。例えば、自由に利用できるワークフローシステム27,28とショート読み取りアライナーマッピングソフトウェア29を使用します 。 </li><li>連続した読み込みを使用して、推定eccDNAsの地域から読み取る識別し、例えば、7つ以上の連続は、隙間20なし（&gt; 1キロバイト）を読み出します。 注：ソフトウェアが対象のゲノム領域にマッピングされた探索には27,28利用可能な読み取ります。 </li></ol>

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	<li>Kugelberg, E., Kofoid, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Inversion+Duplication+in+Salmonella+enterica.:+Selection+Drives+Unstable+Precursors+to+Final+Mutation+Types.">The Tandem Inversion Duplication in Salmonella enterica.: Selection Drives Unstable Precursors to Final Mutation Types.</a> Genetics. 185 (1), 65-80 (2010).</li><li>Reams, A. B., Kofoid, E., Savageau, M., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplication+Frequency+in+a+Population+of+Salmonella+enterica.+Rapidly+Approaches+Steady+State+With+or+Without+Recombination.">Duplication Frequency in a Population of Salmonella enterica. Rapidly Approaches Steady State With or Without Recombination.</a> Genetics. 184 (4), 1077-1094 (2010).</li><li>Smith, C. A., Vinograd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+polydisperse+circular+DNA+of+HeLa+cells.">Small polydisperse circular DNA of HeLa cells.</a> Journal of Molecular Biology. 69 (2), 163-178 (1972).</li><li>Carroll, S. M., DeRose, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+Minute+Chromosomes+Can+Be+Produced+from+Precursors+Derived+from+a+Chromosomal+Deletion.">Double Minute Chromosomes Can Be Produced from Precursors Derived from a Chromosomal Deletion.</a> Molecular and cellular biology. 8 (4), 1525-1533 (1988).</li><li>Cohen, S., Yacobi, K., Segal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+Circular+DNA+of+Tandemly+Repeated+Genomic+Sequences+in+Drosophila.">Extrachromosomal Circular DNA of Tandemly Repeated Genomic Sequences in Drosophila.</a> Genome research. 13 (6A), 1133-1145 (2003).</li><li>Horowitz, H., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Autonomously+Replicating+Circular+Subtelomeric+Y'+Elements+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Identification of Autonomously Replicating Circular Subtelomeric Y' Elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and cellular biology. 5 (9), 2369-2380 (1985).</li><li>Moore, I. K., Martin, M. P., Dorsey, M. J., Paquin, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Circular+Amplifications+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+a+Breakage-Fusion-Bridge+Mechanism.">Formation of Circular Amplifications in Saccharomyces cerevisiae by a Breakage-Fusion-Bridge Mechanism.</a> Environmental and molecular mutagenesis. 36 (2), 113-120 (2000).</li><li>Gresham, D., Usaite, R., Germann, S. M., Lisby, M., Botstein, D., Regenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+diverse+nitrogen-limited+environments+by+deletion+or+extrachromosomal+element+formation+of+the+GAP1+locus.">Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18551-18556 (2010).</li><li>Windle, B., Draper, B. W., Yin, Y. X., O'Gorman, S., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+role+for+chromosome+breakage+in+gene+amplification,+deletion+formation,+and+amplicon+integration.">A central role for chromosome breakage in gene amplification, deletion formation, and amplicon integration.</a> Genes &amp; development. 5 (2), 160-174 (1991).</li><li>Gresham, D., Ruderfer, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Detection+of+Polymorphisms+at+Nucleotide+Resolution+with+a+Single+DNA+Microarray.">Genome-Wide Detection of Polymorphisms at Nucleotide Resolution with a Single DNA Microarray.</a> Science. 311 (5769), 1932-1936 (2006).</li><li>Kidd, J. M., Cooper, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+sequencing+of+structural+variation+from+eight+human+genomes.">Mapping and sequencing of structural variation from eight human genomes.</a> Nature. 453 (7191), 56-64 (2008).</li><li>Gresham, D., Desai, M. M., Botstein, D., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+and+Dynamics+of+Evolutionary+Adaptations+to+Controlled+Nutrient-Limited+Environments+in+Yeast.">The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1-19 (2008).</li><li>Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Variation+and+the+Fate+of+Beneficial+Mutations+in+Asexual+Populations.">Genetic Variation and the Fate of Beneficial Mutations in Asexual Populations.</a> Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).</li><li>van Loon, N., Miller, D., Murnane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+extrachromosomal+circular+DNA+in+HeLa+cells+by+nonhomologous+recombination.">Formation of extrachromosomal circular DNA in HeLa cells by nonhomologous recombination.</a> Nucleic Acids Research. 22 (13), 2447-2452 (1994).</li><li>Vinograd, J., Lebowitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+Topological+Properties+of+Circular+Dna.">Physical and Topological Properties of Circular Dna.</a> Journal of General Physiology. 49 (6P2), 103 (1966).</li><li>Shibata, Y., Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+MicroDNAs+and+Chromosomal+Microdeletions+in+Normal+Tissues.">Extrachromosomal MicroDNAs and Chromosomal Microdeletions in Normal Tissues.</a> Science. 336 (6077), 82-86 (2012).</li><li>Dillon, L. W., Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Extrachromosomal+MicroDNAs+Is+Linked+to+Mismatch+Repair+Pathways+and+Transcriptional+Activity.">Production of Extrachromosomal MicroDNAs Is Linked to Mismatch Repair Pathways and Transcriptional Activity.</a> Cell Reports. 11 (11), 1749-1759 (2015).</li><li>Li, L. L., Norman, A., Hansen, L. H., S&#248;rensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metamobilomics+-+our+knowledge+on+the+pool+of+plasmid+encoded+traits+in+natural+environments+using+high-throughput+sequencing.">Metamobilomics - our knowledge on the pool of plasmid encoded traits in natural environments using high-throughput sequencing.</a> Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 18, 5-7 (2012).</li><li>Brown Kav, A., Sasson, G., Jami, E., Doron-Faigenboim, A., Benhar, I., Mizrahi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+bovine+rumen+plasmidome.">Insights into the bovine rumen plasmidome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (14), 5452-5457 (2012).</li><li>M&#248;ller, H. D., Parsons, L., J&#248;rgensen, T. S., Botstein, D., Regenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+circular+DNA+is+common+in+yeast.">Extrachromosomal circular DNA is common in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 201508825 (2015).</li><li>Drubin, D. G., Miller, K. G., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Actin-Binding+Proteins+-+Evidence+for+a+Role+in+Morphogenesis.">Yeast Actin-Binding Proteins - Evidence for a Role in Morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 107 (6), 2551-2561 (1988).</li><li>Magdolen, V., Drubin, D. G., Mages, G., Bandlow, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+profilin+suppress+the+lethality+caused+by+overproduction+of+actin+in+yeast+cells.">High levels of profilin suppress the lethality caused by overproduction of actin in yeast cells.</a> FEBS letters. 316 (1), 41-47 (1993).</li><li>Sandrock, T. M., Brower, S. M., Toenjes, K. A., Adams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressor+analysis+of+fimbrin+(Sac6p)+overexpression+in+yeast.">Suppressor analysis of fimbrin (Sac6p) overexpression in yeast.</a> Genetics. 151 (4), 1287-1297 (1999).</li><li>Blanco, L., Bernad, A., L&#225;zaro, J. M., Mart&#236;n, G., Garmendia, C., Salas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+DNA+Synthesis+by+the+Phage+&#248;29+DNA+Polymerase.">Highly Efficient DNA Synthesis by the Phage &#248;29 DNA Polymerase.</a> The Journal of biological chemistry. 264 (15), 8935-8940 (1989).</li><li>Dean, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Amplification+of+Plasmid+and+Phage+DNA+Using+Phi29+DNA+Polymerase+and+Multiply-Primed+Rolling+Circle+Amplification.">Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification.</a> Genome research. 11 (6), 1095-1099 (2001).</li><li>Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+cloning+using+&#248;29+DNA+polymerase.">Cell-free cloning using &#248;29 DNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17332-17336 (2005).</li><li>Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy Team, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galaxy:+a+comprehensive+approach+for+supporting+accessible,+reproducible,+and+transparent+computational+research+in+the+life+sciences.">Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences.</a> Genome Biology. 11 (8), 86 (2010).</li><li>Giardine, B., Riemer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galaxy:+A+platform+for+interactive+large-scale+genome+analysis.">Galaxy: A platform for interactive large-scale genome analysis.</a> Genome research. 15 (10), 1451-1455 (2005).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357 (2012).</li><li>Tsalik, E. L., Gartenberg, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curing+Saccharomyces+cerevisiae+of+the+2+micron+plasmid+by+targeted+DNA+damage.">Curing Saccharomyces cerevisiae of the 2 micron plasmid by targeted DNA damage.</a> Yeast. 14 (9), 847-852 (1998).</li><li>Norman, A., Riber, L., Luo, W., Li, L. L., Hansen, L. H., S&#248;rensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Method+for+Including+Upper+Size+Range+Plasmids+in+Metamobilomes.">An Improved Method for Including Upper Size Range Plasmids in Metamobilomes.</a> PLoS ONE. 9 (8), e104405 (2014).</li><li>Storlazzi, C. T., Lonoce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+amplification+as+double+minutes+or+homogeneously+staining+regions+in+solid+tumors:+Origin+and+structure.">Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: Origin and structure.</a> Genome research. 20 (9), 1198-1206 (2010).</li><li>Von Hoff, D. D., Needham-VanDevanter, D. R., Yucel, J., Windle, B. E., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+human+MYC+localized+to+replicating+submicroscopic+circular+DNA+molecules.">Amplified human MYC localized to replicating submicroscopic circular DNA molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (13), 4804-4808 (1988).</li><li>Raymond, E., Faivre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hydroxyurea+on+extrachromosomal+DNA+in+patients+with+advanced+ovarian+carcinomas.">Effects of hydroxyurea on extrachromosomal DNA in patients with advanced ovarian carcinomas.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 7 (5), 1171-1180 (2001).</li><li>Shimizu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+Double+Minutes+and+Chromosomal+Homogeneously+Staining+Regions+as+Probes+for+Chromosome+Research.">Extrachromosomal Double Minutes and Chromosomal Homogeneously Staining Regions as Probes for Chromosome Research.</a> Cytogenetic and genome research. 124 (3-4), 3-4 (2009).</li><li>Eckhardt, S. G., Dai, A., Davidson, K. K., Forseth, B. J., Wahl, G. M., Von Hoff, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+differentiation+in+HL60+cells+by+the+reduction+of+extrachromosomally+amplified+c-myc.">Induction of differentiation in HL60 cells by the reduction of extrachromosomally amplified c-myc.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6674-6678 (1994).</li><li>Vogt, N., Lef&#232;vre, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+double-minute+chromosomes+bearing+amplified+copies+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+gene+in+gliomas.">Molecular structure of double-minute chromosomes bearing amplified copies of the epidermal growth factor receptor gene in gliomas.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11368-11373 (2004).</li><li>Ahn, K., Gotay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+rate+of+disease-related+copy+number+variations+in+childhood+onset+schizophrenia.">High rate of disease-related copy number variations in childhood onset schizophrenia.</a> Molecular psychiatry. 19 (5), 568-572 (2013).</li><li>Girirajan, S., Johnson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+increases+in+both+common+and+rare+copy+number+load+associated+with+autism.">Global increases in both common and rare copy number load associated with autism.</a> Human molecular genetics. 22 (14), 2870-2880 (2013).</li><li>Vogt, N., Gibaud, A., Lemoine, F., de la Grange, P., Debatisse, M., Malfoy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplicon+rearrangements+during+the+extrachromosomal+and+intrachromosomal+amplification+process+in+a+glioma.">Amplicon rearrangements during the extrachromosomal and intrachromosomal amplification process in a glioma.</a> Nucleic Acids Research. , (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

サークルのSeq法は、配列レベルの分解能を持つ酵母細胞からeccDNAのゲノムスケールの検出を可能にします。この方法は、集中的な渦やピペット操作を必要とし、次のステップでエキソヌクレアーゼ消化につながるeccDNAの破損を制限するために、重力によってカラム分離を使用していない軽度のeccDNAの精製です。この方法のこれらの機能は、遺伝子配列を含む大きなeccDNAsを検出するために重要であり得ます。サークルのSeqは、完全な遺伝子（ データセット1）を含む多数のeccDNAsを検出しました。また、86-kbの酵母ミトコンドリアDNAを検出しました。したがって、このプロトコルは、大環状DNAエレメントの精製を容易にします。最小限にDNA抽出工程の数を維持するeccDNA損失のリスクを低減し、歩留まりを最大にします。制御の結果に基づいて、スパイク-にプラスミド、サークルのSeqは2,500細胞から単一の環状DNAを検出し、高感度です。さらに、このような2μなど豊富な内因性​​のプラスミドを除去します;プラスミドまたはミトコンドリアDNAを大幅に感度を向上させる可能性があります。酵母培養物からの2μの硬化は、30に記載されています。また、2μとミトコンドリアDNAの除去は、そのようなのSwaIとして、レア切断エンドヌクレアーゼを用いて達成されることがあります。しかし、制限酵素ステップは、関心のある他のeccDNAsを標的とし、総eccDNA収量を制限することができます。 eccDNA検出のための重要なステップは、適切な深さに線形DNA（ステップ3）、DNA配列決定（ステップ5）を除去しました。細胞集団からeccDNAsの大部分を記録するには、深いシーケンシングは、20を必要になる場合があります。環状DNA接合がペアエンドがdiscordantlyそのマップを読み込みもたらすことが期待されているようペアエンド配列決定は、eccDNA検出の一層の信頼を提供する必要があります。これらの不一致は、環状DNA構造の発見を支援し、潜在的にさらなるeccDNA検出フィルタとして使用することができます。 サークルのa-SeQ法は、3つの独立したSを使用して検証しました。 セレビシエ CEN.PK集団。検出されたシーケンスは、以前eccDNAs、内在性プラスミドを報告し、スパイク-にプラスミドおよび推定eccDNAs（ データセット1）の何百も含まれています。これらの知見は、Sから前のサークルのSeqデータセットをサポートセレビシエ S288C 20。 CEN.PKとS288C集団に共通するいくつかのeccDNAsの発見は、これらの遺伝子座は、として円形の要素（ 図4）が存在する傾向があることを示しています。我々は以前、他の歪みの背景にある[GAP1 円 ]の証拠が発見されていないものの、CEN.PK背景8中の窒素限られた条件の下で濃縮されている[GAP1 円 ]ことが示されています。 CUP1-1 RSC30、ASP3-1、COS111、およびHXT6 HXT7からeccDNAの発見S288CとCEN.PKの両方での遺伝子座はDNAの環状化のための素因が詐欺であることを示唆しています酵母株の間でお召し上がりいただけます。 [HXT6 / 7 円 ]、[ASP3-1 円 ]、[COS111 円 ]、および[CUP1-1 RSC30 円 ]が細胞に選択的利点を付与する場合は、表示されるために残っているか、彼らの存在は、単にの高レートの影響である場合DNAの環状化。 まとめると、結果は、サークル-seqがキロベースのサイズeccDNAsを検出するのに適している、完全な遺伝子とeccDNAsを識別するための利点を有していることを示しています。サークルのSeqは、酵母からeccDNAsの全ゲノムスケールの画面を有効に高感度な方法です。サークルのSeq法は、遺伝子欠失および増幅を生成する際にeccDNAの役割を解明することを目的とした研究の新しいフィールドを開くことができます。 DNAアーキテクチャと構造が大きく、高等真核生物への真核生物、酵母から保存されていることを考えると、サークルのSeq法は、原理的には、applicablすべきです若干の修正を加えて、すべての真核細胞に電子。メガベースサイズeccDNAsを精製する能力を示すことがまだあるが、現時点では、この方法は、任意の制限があるとは思われません。また、ローリングサークル増幅法31を使用O29 DNAポリメラーゼの使用は、eccDNA定量がより困難に小さいeccDNAsに向かってバイアスを生成します。サークルのSeqはヒト体細胞からの二分の環状DNAの研究に適して、完全な遺伝子を運ぶのに十分な大きeccDNAsを検出します。癌原遺伝子がこれらの要素32-37上で増幅されたときにダブル分は、癌に貢献することができます。生殖系列細胞におけるeccDNAsの研究は、家畜、例えば、生殖細胞系突然変異率を測定し、精子の品質を評価するために使用することができます。このように、サークルのSeqは、遺伝的変異は、コピー数多型の形で発生する速度への洞察を得て、遺伝子が関与する疾患の新規理解につながる可能性を秘めている著作数の変動38-40。

それは、細胞の大集団中の単一DNA分子の変化を同定する必要があるため、早期にまたは一過染色体の増幅を検出することは困難です。染色体コピー数変動（CNVを）は、一般的に変化1,2を生成メカニズムの証拠としてのみ、最終的なCNV構造を残して、彼らの確立された後も検出されています。 CNV形成の初期段階で体外の環状DNA（eccDNA）を検出し、回収することゲノム再編成で進行中のプロセスを解明することがあります。 以前に、eccDNAのデノボ発見は、電子顕微鏡写真を図3に示すように 、中期染色体4、または二次元ゲル電気泳動5のギムザ染色でした。これらの方法は、環状DNAの配列についてはほとんどあるいは全く情報を提供します。ターゲットを絞ったサザンが6,7ブロッティングなどの技術、逆PCR 8、またはその場での hybridizatio 蛍光nは9は 、特定の eccDNA要素についての証拠を提供します。これらの方法はいずれも、細胞集団内のすべての既存eccDNAタイプの配列を提供しません。 細胞のプールにおけるゲノムの相違は、ゲノム配列決定および/ ​​またはタイリングアレイ10,11によって特徴付けることができます。従来のDNA精製方法によって削除または増幅の検出は、通常、突然変異対立遺伝子は、細胞集団12,13の少なくとも0.1から1パーセントを表していることが必要です。非中心eccDNAsは、それらの動原体の欠如および複製におけるDNA合成の潜在的な欠如を、細胞培養物中で一層一過性であることが期待されます。最もeccDNAsは、おそらく少量であり、それらの配列がゲノムに似ているので、このように、代替のDNA抽出方法はeccDNAsを検出するために必要とされます。 いくつかの環状DNA精製技術は、染色体および環状DNAとの間の構造的な違いを利用します。例えば、高速ultracentrifug塩化セシウム勾配でationが、ヒトのHeLa癌細胞株14から350から3000塩基対（bp）の大eccDNAsを単離するために使用されます。しかし、高速度は沈降速度15とeccDNA収率を変える、スーパーコイル環状DNA構造の骨格を壊すか、ニックすることができます。 Duttaさんと共同研究者は、デノボ 、マウス組織からだけでなく、鶏の文化やヒト細胞16,17から環状DNAのゲノムスケールの同定のための方法を開発しました。彼らの方法は、プラスミド精製と酵素反応やDNA抽出のいくつかのラウンドに続いて、スクロース超遠心分離することによりホモジナイズした組織からの核の抽出です。そのプロトコルは、主に200-400 bpのeccDNAs、と呼ばれるmicroDNAsを識別します。 Duttaさんと共同研究者はまた、 サッカロマイセス・セレビシエからmicroDNAsの精製を試みたが、この酵母種16からmicroDNAを記録することができませんでした。 我々はのための新規な方法を開発しましたサークルのSeqと呼ばれる酵母からeccDNAのデノボ検出。この方法は、全遺伝子を運ぶのに十分な大きさと86キロベース（kbの）ミトコンドリアDNA（mtDNAの）と同じ大きさの環状DNA分子のためのゲノム規模の調査を可能にします。サークルのSeq法は、真核生物の酵母細胞用に最適化と深いシーケンシングと組み合わせて、十分に確立された原核生物のプラスミド精製法18,19から開発されました。サークルのSeqアプローチ、1756異なるeccDNAs、すべてのより大きな1キロバイトを使用して、10 Sから検出されましたセレビシエ S288C集団20。サイズカットオフは、全体の遺伝子を運ぶのに十分な大きさでしたeccDNAに集中することを選択しました。サークルのSeqは高感度でした。それは、セル20の数千内の単一eccDNAを検出しました。現在の研究では、サークルのSeqは、別のSの3つの生物学的複製物から294 eccDNAsを分離し、同定するために使用されましたセレビシエ酵母株、CEN.PK.データはeccDNAが共通の遺伝的elemeであることが明らかになりましたS.でNT セレビシエ株。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>211677</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600882</td>
			<td>For qPCR analysis. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN06.4</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disruptor Beads, 0.5 mm</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.2</td>
			<td>Agarose gel stain for detecting DNA/RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet plasmid miniprep kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>K0502</td>
			<td>Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI, FastDigest</td>
			<td>Life Technologies -&#160; Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>FD0594</td>
			<td>Endonuclease. Alternative product can be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini AX kit&#160;</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology, Poland</td>
			<td>010-50</td>
			<td>Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>E3105K</td>
			<td>ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>81845</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUG6 plasmid</td>
			<td>EUROSCARF, Germany</td>
			<td>P30114</td>
			<td>Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. Plasmid requests: Please contact Dr. Peter Philippsen@unibas.ch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN genomic-tip 100/G&#160;</td>
			<td>Qiagen, USA</td>
			<td>13343</td>
			<td>Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REPLI-g Mini Kit protocol&#160;</td>
			<td>Qiagen, USA</td>
			<td>150023</td>
			<td>Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>210929</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme)</td>
			<td>Nordic BioSite, Sweden</td>
			<td>Z1004-3</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data access to sequence files</td>
			<td>European Nucleotide Archive&#160;</td>
			<td></td>
			<td>EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D</td>
			<td></td>
			<td>Genotype MATa MAL2-8c SUC2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool</td>
			<td>EUROSCARF, Germany</td>
			<td></td>
			<td>S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3&#8710;1 leu2&#8710;0 met15&#8710;0 ura3&#8710;0 genexxx::KanMX.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Spectrophotometer&#160;</td>
			<td colspan="2">NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher</td>
			<td>Measuring DNA concentration. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscopy</td>
			<td>Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm.</td>
			<td></td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic library-build system</td>
			<td>Apollo 324, IntegenX Inc.</td>
			<td></td>
			<td>DNA library preparation. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing platform</td>
			<td colspan="2">Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc.</td>
			<td>DNA sequencing. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td colspan="2">Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methods</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% YPD media&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circle-Seq test on genomic DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 &#181;g genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 &#181;l) in wells on an 0.5 &#181;g/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mapping software</td>
			<td>Bowtie2 aligner, John Hopkins University</td>
			<td></td>
			<td>Ultrafast short read alignment. Reference: Langmead B, Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012, 9:357-359.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workflow bioinformatic system</td>
			<td>Galaxy, Open source.</td>
			<td></td>
			<td>A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: Goecks, J, Nekrutenko, A, Taylor, J and The Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 2010 Aug 25;11(8):R86. Blankenberg D, Von Kuster G, Coraor N, Ananda G, Lazarus R, Mangan M, Nekrutenko A, Taylor J. &#34;Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists&#34;. Current Protocols in Molecular Biology. 2010 Jan; Chapter 19:Unit 19.10.1-21. Giardine B, Riemer C, Hardison RC, Burhans R, Elnitski L, Shah P, Zhang Y, Blankenberg D, Albert I, Taylor J, Miller W, Kent WJ, Nekrutenko A. &#34;Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis.&#34; Genome Research. 2005 Oct; 15(10):1451-5.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide purification of extrachromosomal circular dna from eukaryotic cells

<html>染色体外環状DNA（eccDNAs） サッカロマイセス・セレビシエにおける共通の遺伝的要素であり、他の真核生物で報告されています。 EccDNAsは、多細胞生物における体細胞間の遺伝的変異に及び単細胞真核生物の進化に貢献しています。 eccDNAを検出するための感度の高い方法は、これらの要素は、ゲノムの安定性に影響を与え、どのように環境的および生物学的因子は、真核細胞におけるそれらの形成を誘導する方法を明確にするために必要とされます。このビデオでは、サークルのSeqと呼ばれる敏感なeccDNA-精製方法を提供します。この方法は、環状DNAのカラム精製、残りの線状染色体DNA、eccDNAのローリングサークル増幅、ディープシークエンシングおよびマッピングの除去を包含する。広範エキソヌクレアーゼ処理は、十分な線形染色体DNAの分解のために必要でした。によるローリングサークル増幅工程伊根高さ：ノーマル;直鎖状DNAを超える環状DNAについて濃縮&quot;&gt;φ29ポリメラーゼ10 10細胞の3 S.セレビシエ CEN.PK集団にサークルのSeq法の検証は1キロベースよりも大きいサイズでeccDNAプロファイルの数百を検出しました。 。S288CとCEN.PK両方に環状DNAにASP3-1、COS111、CUP1、RSC30、HXT6、HXT7遺伝子の発見をDNAの環状化は、これらの遺伝子座での株の間で保存されていることを示唆している繰り返し。要するに、サークルのSeq法は広いがあります真核生物でeccDNAためのゲノム規模スクリーニングのためだけでなく、特定のeccDNAの種類を検出するための適用性。

サークルのSeq法、3 S.を検証するために、細胞は、10代のためのYPDで別々に成長させた後、1×10 10細胞のセレビシエ CEN.PK集団をスクリーニングしました。以前に20（データは示していない）に記載のような染色体の線状DNA除去は、定量PCR ACT1信号が存在しないことによって確認されました。精製され、濃縮されたeccDNAが68百万まで配列決定された読み取り（141-ヌクレオチドシングルエンドの読み取り）とCEN.PK113-7D参照ゲノム（バージョン2012年6月19日）にマッピングされました。 C1、C2およびC4という3つのサンプルから推定されるeccDNAsの記録は、読み取る長い1キロバイト以上の連続によってマッピングされたゲノム領域に割り当てられていました。万モンテカルロシミュレーションに基づいて、隣接することによってマップされた各領域の重要性を1 Kバイト推定されたより長い読み取り。この79、159と56の領域は、おそらくeccDNA系列た（p &lt;0.1、 データセット1）と注釈されたから。記録contiguo数米国&gt; 1のキロバイトサンプルはさらに、（ 図2）が配列決定された場合、より一層eccDNA要素が記録されたであろうことを示唆している配列の深さの関数として増加読み出します。予想されたように、サークルのSeq法は、多数の抽出2μプラスミドを含む公知の環状DNA要素の数、ミトコンドリアDNA、染色体XII上のリボソームRNA遺伝子、およびサンプルにスパイクした3つの内部対照プラスミドのpBR322、pUC19のとpUG72からの読み込みちょうどカラム精製（ 図3）の前に。 ビデオは、染色体IVにHXT7 _ARS432_ HXT6座にマッピングされていることを読み取るの連続の一例を示しています。以前は、[HXT6 / 7 円は ] 10 S288C集団（1×10で各10個の細胞）にサークルのSeqによって検出され、環状DNA構造が逆PCR分析20によって確認されました。 [HXT6 / 7 CIrcle]も3 CEN.PK集団（ 図4A）のそれぞれに記録されました。また、CEN.PKの複製試料間で共通eccDNA遺伝子のほとんどは、S288Cデータセット（ 図4B）からeccDNA遺伝子を重複していました。 環状DNA精製、30μgのゲノムDNAを有する2つのサンプル毎にサークルのSeqプロトコルの特異性を試験するために、試験されました。一つのサンプルは、サークル、配列番号プロトコールにより精製した両方の試料からの100ngのプラスミドDNAおよびeccDNAを補充しました。カラム分離した後、DNAの収量は、プラスミド（GD + P）とサンプル用プラスミドなしの試料について1.27パーセント（380 ngの）（GD）および1.60パーセント（480 NG）でした。エキソヌクレアーゼ処理の効率がACT1に対してPCRを用いて29時間および72時間後の線状DNA含有量について試験した。なしの試料を増幅ACT1（データは示さず）を含んでいませんでした。各エキソヌクレアーゼ処理された試料の画分は、さらにありましたO29によってmplified ポリメラーゼおよび酵素反応の生成物は、ヨウ化プロピジウム染色（ 図5A-F）およびアガロースゲル電気泳動（ 図5G）により分析しました。エキソヌクレアーゼ処理後の試料は、最小限のヨウ化プロピジウム染色（ 図5A-B）を示しました。 O29 -唯一のゲノムDNAで増幅された試料は、対照試料（ 図5E）と同様糸状構造（ 図5C）を明らかにしました。 O29 -追加されたプラスミドを持っていた増幅された試料は、プラスミド対照（ 図5F）に似た病巣（ 図5D）を明らかにしました。画像はO29ポリメラーゼが直鎖状DNA上に環状DNAについて濃縮することを示しました。最も線形染色体DNAは、29時間のエキソヌクレアーゼ処理（ 図5A-B、G）後のサンプルから除去しました。しかし、100以上の時間のために、大規模なエキソヌクレアーゼ処理と、100以上のユニットを使用しました<html>すべての染色体直鎖DNAを除去するために必要な、O29として-増幅されたサンプルは、依然として72時間のエキソヌクレアーゼ処理（ 図5C-D）後のスレッドのような構造のバックグラウンドを示しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig1.jpg" /> サークルのSeq法の図1.概要プロトコルは5段階があります。カラムクロマトグラフィーによる1）細胞培養、2）精製およびeccDNAの濃縮、溶出画分に線形染色体DNAを、残りの3）消化、の4）増幅をO29 DNAポリメラーゼによるDNA、および5）高濃縮eccDNAのシーケンシングおよびSに読み込むのマッピングセレビシエ参照ゲノム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg &quot;/&gt; 図2.連続シーケンスの深さの関数として&gt; 1キロバイトを読み取る。1×10 10個の細胞からEccDNAは（読み取り、マッピングされた数百万で）シーケンスの深さの関数として増加します。示す：半数体CEN.PK Sからの生物学的三重10 10の細胞分裂によって分離・セレビシエ集団 （C1、C2、C4）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig3.jpg" /> CEN.PK生物学におけるプラスミドのパーセントで図知られている環状DNA要素の3検出。リード・カバレッジの（AB）散布図は、（密度を読んで）、C1、C2およびC4を複製します。したマップされた（A）は 、内因性酵母プラスミドに読み取ります2μを。 [rDNAのサークル]（染色体XIIからのリボソームRNA遺伝子）;そして、のmtDNA（ミトコンドリアDNA）。 （B）ユニークなプラスミドを制御するためにマッピングされた読み取ります。対照プラスミドは、カラム精製の前にサンプルに添加しました。セル当たりのプラスミド比は次のとおりだった：のpBR322（プラス記号）1：1、pUC19の（円）1時50分、およびpUG72（三角形）1：2500。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig4.jpg" /> CEN.PKとS288C図4.一般的なeccDNA要素。（A）ベン図476の間での重複を表示します 3 CEN.PKサンプル（C1、C2、C4）で294 eccDNA要素上の遺伝子。 16共通の重複eccDNA遺伝子/プラスミドは（すべての遺伝子名は、 データセット1である）注釈が付けられています。 （B）10 S288Cサンプルから推定eccDNAs上のすべての記録された遺伝子と比較して3 CEN.PKサンプル（C1、C2、C4）から推定eccDNAs上のすべての記録された遺伝子のベン図、：S1-S2、R1-R4、Z1-Z4は（参照20を参照します）。遺伝子/プラスミドおよび2株の背景や3またはそれ以上の実験装置の最小値をオーバーラップし、推定eccDNA領域を有する13の生物学的複製（S1-S2、R1-R4、Z1-Z4、C1-C3）が示されています。 Cサンプル、CEN.PK。 RおよびZサンプル、S288C BY4741。 Sサンプル、S288C M3750。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig5.jpg" /> 図エキソヌクレアーゼ後のDNAサンプルの5可視化と O 2 9治療。DNAの（AF）ヨウ化プロピジウム染色。スケールバーは10μm。 （A、C及びE）のゲノムDNAを有する試料（GD）。 （BとD）GDプラスプラスミド（GD + P）とサンプル。 （ <str<html>オング&gt; AB）29時間のエキソヌクレアーゼ処理（EXO 29時間）した後、 O29ポリメラーゼ増幅（EXO 72時間+ O29）に続いて72時間のエキソヌクレアーゼ処理後（CD）。 （E）E後のゲノムDNAコントロール：O29ポリメラーゼ増幅; （F）プラスミド対照（5.5キロバイト）後 29ポリメラーゼ増幅; （Gφ）アガロースゲル泳動。左から：L、1キロ​​バイトのマーカー; P、EXO 29時間後のプラスミド対照（5.5キロバイト）。 GD、EXO 29時間後（Aのようにサンプル）。 GD + P、EXO 29時間後（Bなどのサンプル）。 GDおよびGD + P、EXO後29時間+ O29。 GDおよびGD + P、EXO後72時間+ O29（CDのようなサンプル）。表S1を参照してください。 余分な詳細については。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ASET 1 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg &quot;/&gt; CEN.PK.でデータセット1.潜在的なDNAの環状領域 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/DATASET1-CENPK.xlsx">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> 示されたシーケンスデータであり、348の領域について分析します。列は、AD、eccDNAマッピングされています。推定上eccDNAが同定された、サンプル（左から最初のカラム）。 B、​​染色体。 CD、開始および推定eccDNAsの座標を終了します。 EH、eccDNAコンテンツ。 E、自律的領域（ARS）配列を複製。 F、地域の完全な遺伝子; G、領域に含まれる遺伝子の一部。 H、BLASTN-同定された遺伝子。 IO、EccDNAカバレッジとp値。私は、BPで一意に注釈付きの配列と最長の領域と、 J、すべての数は、読み込みマッピングされました。 Kは、すべてのマップされたのカバレッジは、マッピングされた百万読み出す（FPKM）からキロバイトあたりの断片によって読み取ります。モンテカルロシミュレーションから偶然発生に比べ、推定eccDNA用L、p値; M、国連の数iquely読み込み、マッピングされました。 NO; KおよびLのみが一意にマッピングされた使用など（UFPKM）を読み出します。読み取りおよび20は説明したように、モンテカルロシミュレーションであったのマッピングのためのパラメータ。

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Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

真核細胞から体外の環状DNAのゲノムワイドな精製

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

genome-wide-purification-extrachromosomal-circular-dna-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

25.0K ビュー.  University of Copenhagen. This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation. 

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

生物学

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

酵母細胞からミトコンドリアの精製

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

マイクロアレイを用いたtRNAのアミノアシル化（充電）レベルのゲノムワイド解析

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high purity DNA. Based on multi-well filtration for bacterial lysate clearance and DNA purification, this method creates a streamlined process for plasmid preparation. Filter plates containing silica-based media can easily be processed by vacuum filtration or centrifuge to yield appreciable quantities of plasmid DNA. Quantitative analyses determine the purified plasmid DNA is consistently of high quality with average OD260/280 ratios of 1.97. Overall, plasmid yields offer more pure DNA for downstream applications, such as sequencing and cloning. This streamlined method of using AcroPrep Advance Filter Plates allows for manual, semi-automated or fully-automated processing.

This protocol is a cost effective alternative for efficient parallel clarification and plasmid DNA purification from E. coli cultures. The AcroPrep Advance process starts with an optimized lysate clarification filter plate followed by purification on a high binding capacity DNA binding filter plate.

原核生物培養液からプラスミドDNAの合理化精製

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

ミッションターゲットIDのライブラリを使用してmiRNAのターゲットのゲノムワイドスクリーン

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

多様ChIPseqデータ型のゲノムワイドな解析のための新規ベイジアン変化点アルゴリズム

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.