Thanks to Kenn D. M&#248;ller and Claus Sternberg (DTU) for technical assistance and to Tue S. J&#248;rgensen for quantitative PCR analysis.

NOTA: Uma visão geral da purificação DNA circular e método de sequenciação (Circle-Seq) é ilustrada na Figura 1. 1. A cultura, celular e de colheita de plasma de membrana Perturbação <ol><li> Inoculação das células de levedura (por exemplo Saccharomyces cerevisiae) a partir de uma cultura D / N em 50 ml de meio nutriente completa de dextrose peptona de levedura (YPD). Inocular a uma densidade celular inicial baixo de 1-3 x 10 5 células / ml ou uma densidade óptica de aproximadamente 0,01 OD 600. <ol><li> Incubar as células a 30 ° C com agitação a 150 voltas por minuto (rpm) até que as células atingir a densidade máxima de células de cerca de 1 x 10 10 células, aproximadamente após 24 a 48 horas ou uma densidade óptica a 600 OD&gt; 10.0. NOTA: O tempo de cultura não é crucial como concentrações mais baixas de células pode ser utilizado. </li></ol></li><li> Transferir a cultura superada para um tubo cónico de 50 ml, sedimentar as células por centrifugação a800 xg durante 3 minutos e descartar o sobrenadante. </li><li> Lavar o sedimento com 25 ml de solução tampão de Tris-Cl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, re-sedimentar as células por centrifugação a 800 xg durante 3 minutos e descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em 1,2 ml de tampão de ressuspensão fornecido a partir de um kit de plasmídeo coluna de purificação. </li><li> Etapa opcional: Adicionar plasmídeos altamente diluídas como controles para a purificação de elementos circulares de DNA, 20. NOTA: No conjunto de dados atual, uma mistura do plasmídeo 7.7 l foi aplicado para cada amostra contendo 10 a 10 células. A mistura da plasmídeo consistiu de três plasmídeos em diferentes concentrações; pBR322, a 38 ng / amostra, pUC19 a 0,5 ng / amostra, e pUG72 a 0,01 ng / amostra. </li><li> Transferir a suspensão celular em dois tubos de 2 ml de micro-centrífuga, cada um complementado com contas de vidro de 0,5 mm a uma razão de 1: 3 do volume total de suspensão. </li><li> Vortex cada tubo à velocidade máxima por 10 min para perturbar células plasmáticasmembranas. Sedimentar as pérolas por centrifugação a 268 xg durante 30 seg e transferir os 1,2 ml de sobrenadante combinado a partir dos dois tubos de microcentrífuga para um novo tubo. NOTA: Alternativa para o passo 1,6-1,7, usar zimoliase para romper as células em solução tampão 0,6 ml de ressuspensão. Dez unidades de zimoliase pode perturbar 5 x 10 7 células dentro de 1,5 h a 35 ° C. </li></ol> 2. EccDNA Enriquecimento por cromatografia em coluna <ol><li> Seguir o protocolo de um kit de purificação de plasmídeos coluna. Em resumo, o tratamento de cada amostra com uma solução de 1,2 ml alcalina, misture delicadamente e incubar 3 min a RT. </li><li> Adicionar 1,2 ml de tampão de neutralização, misturar suavemente e centrifugar a 9650 xg durante 5 min. </li><li> Carregar a solução numa coluna equilibrada com solução 1 ml de equilíbrio e permitir que o líquido a fluir através da coluna por gravidade. </li><li> Lava-se a coluna com uma solução de lavagem de 4 ml. Quando a solução foi passada através da resina, adicionar cuidadosamente 0,3 ml de eluição assimlução para substituir a maior parte do volume de vazio de 0,35 ml de coluna. </li><li> Elui-se o ADN para um novo tubo de recolha com uma solução de 1 ml de eluição e precipitar o ADN pela adição de 0,8 ml de mistura de precipitação. Centrifuga-se a 9650 xg durante 10 min. </li><li> Lava-se a pelete de ADN com 0,5 ml de etanol a 70%, centrifugar a 9650 xg durante 5 min, de ar seco durante 5 a 15 minutos e dissolve-se o ADN purificado em 25 uL de água estéril. NOTA: Apenas armazenamento a curto prazo de DNA em água é recomendado. Preferencialmente, seguir diretamente para a etapa 3. </li></ol> 3. A digestão do ADN cromossómico restante linear <ol><li> Passo opcional: Para facilitar a digestão específica de ADN linear pela exonuclease, tratar o ADN purificado com uma endonuclease rara de corte, tais como Notl. Para 5 ug de ADN, usar uma unidade de Notl, 5 ul de tampão de digestão de 10x e água estéril para um volume total de 50 ul. Incubar a reacção a 37 ° C durante 16 h e inactivar pelo calor a endonuclease a 80 ° C durante 5 min. </li><li> Adicionar 20unidades de exonuclease (2 ul), 4 ul de ATP (25 mM), 34 ul de água estéril e 10 ul de 10x tampão de reacção directa com o ADN clivado-endonuclease de 50 ul para chegar a um volume de reacção de 1x de 100 ul, usando a exonuclease dependente de ATP kit. </li><li> Realizar hidrólise de ADN de cadeia simples e de cadeia dupla linear, a 37 ° C durante 5 dias ou mais. Adicionar um ATP adicional de 4 mL (25 mM), 0,6 ul de 10x tampão de reacção e 20 unidades de exonuclease cada 24 horas para prosseguir a digestão enzimática do ADN a um volume de reacção 1x. </li><li> Após a remoção do DNA linear, amostra de 2 ul da solução tratada com exonuclease para confirmar a eliminação do ADN cromossómico linear por reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), usando um marcador cromossómico, tais como o gene da actina ACT1 20. <ol><li> Cada 20 ul qPCR volume reaccional contém 2 mL de amostra tratados com exonuclease, a 150 nm, os iniciadores 5&#39;-ACT1 TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3 &#39;e 5&#39;-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3 &#39;, 2% (volume / volume) de dimetil sulfóxido, e fluorescente mistura principal 10 ul verde. </li><li> Utilizar a condição de reacção; 3 min a 95 ° C, seguido de 45 ciclos de 15 seg a 95 ° C e 30 segundos a 60 ° C. NOTA: ACT1 é um marcador particularmente adequado para DNA linear desde variações no número de cópias deste gene são deletérios 21-23 tão eccDNA não deve levar ACT1. </li><li> Alternativas a análise da digestão de DNA por qPCR são PCR padrão (4.3) ou coloração com iodeto de propídio (4.4). <ol><li> Use 2 jil de amostra tratada com exonuclease como molde de PCR com os iniciadores 5&#39;-ACT1 TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3 &#39;e 5&#39;-GAACGACGTGAGTAACACC-3&#39;. Como controlo positivo ACT1, usar 50-100 ng S. genómico ADN cerevisiae como molde. condições de reacção de PCR; 3 min a 95 ° C, seguido de 35 ciclos de 30 seg a 95 ° C, 30 seg a 56 ° C e 1 min a 72 ° C. </li><li> Executar reacções de PCR por gel electrophoreSIS em 1% de agarose com 0,5 ug / ml de brometo de etídio. Olhe para uma banda ACT1 0,8 kb. </li></ol></li><li> A ausência ou a presença de DNA linear também pode ser examinado por coloração com iodeto de propidio antes e depois de amplificação de DNA. <ol><li> Misturar cada amostra de ADN numa mistura 1: 1 de volume com uma mistura 1: H 2 O 1,000 solução diluída de estoque 20 mM de iodeto de propídio. Deixar solução no escuro durante 10-20 min à temperatura ambiente e analisar a coloração de ADN por microscopia de fluorescência de uma ampliação de 100X, utilizando um filtro de excitação de fluorescência vermelha em 663-738 nm e um tempo de exposição de 5 a 30 seg. Como controlo ADN-coloração, uso O29-ADN genómico amplificado a partir de levedura e / ou plasmídeo amplificado-O29. </li></ol></li></ol></li><li> Inactivar pelo calor a solução da exonuclease a 70 ° C durante 30 min. </li></ol> 4. DNA Amplification <ol><li> Amplificar o purificado e enriquecido eccDNA a partir do passo 3.5) com DNA polimerase de O29 24-26 acordoção com o protocolo do fabricante polimerase. <ol><li> Em resumo, misture 5 ul enriquecidos eccDNA com tampão de desnaturação 5 mL. </li><li> Depois de 3 minutos à temperatura ambiente, adicionar 10 ul de tampão de neutralização. Misturar suavemente e adicionar 30 ul de mistura mestre contendo tampão de reacção de 29 ul e 1 ul de polimerase de ADN O29. Incubar a reacção a 30 ° C durante 16 horas ou mais (até 72 h). Calor inactivar a polimerase de ADN de O29 a 65 ° C durante 3 min. </li></ol></li></ol> 5. Seqüenciamento e Análise de Dados <ol><li> Tosquiarás o eccDNA amplificado com um ultrasonicator focada para um tamanho médio de pico alvo de 300 pb. Utilize as seguintes definições para uma amostra de DNA ul 130: poder 450W pico de intensidade, 60 seg tratamento, factor de utilização de 30%, a 200 ciclos por explosão, temperatura de 7 ° C. </li><li> Adicione etiquetas de índice de código de barras e adaptadores para o fragmentado lê para a síntese de bibliotecas para sequenciação, utilizando um método adequado para a preparação da biblioteca. </li><li>São profundas sequenciação, por exemplo, como 141-single nucleotide-fim lê numa plataforma de sequenciação de alto rendimento. </li><li> Mapa lê o genoma de referência de levedura sob investigação e permitir que lê para mapear para várias regiões. Por exemplo, usar um sistema de fluxo de trabalho disponíveis gratuitamente 27,28 e curto leitura software de mapeamento alinhador 29. </li><li> Identificar lê a partir de regiões de putativas eccDNAs contígua utilizando leituras, por exemplo, mais do que sete contígua lê (&gt; 1 kb), sem lacunas 20. NOTA: O software está disponível 27,28 para explorar mapeados lê em regiões genômicas de interesse. </li></ol>

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G., Dai, A., Davidson, K. K., Forseth, B. J., Wahl, G. M., Von Hoff, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+differentiation+in+HL60+cells+by+the+reduction+of+extrachromosomally+amplified+c-myc.">Induction of differentiation in HL60 cells by the reduction of extrachromosomally amplified c-myc.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6674-6678 (1994).</li><li>Vogt, N., Lef&#232;vre, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+double-minute+chromosomes+bearing+amplified+copies+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+gene+in+gliomas.">Molecular structure of double-minute chromosomes bearing amplified copies of the epidermal growth factor receptor gene in gliomas.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11368-11373 (2004).</li><li>Ahn, K., Gotay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+rate+of+disease-related+copy+number+variations+in+childhood+onset+schizophrenia.">High rate of disease-related copy number variations in childhood onset schizophrenia.</a> Molecular psychiatry. 19 (5), 568-572 (2013).</li><li>Girirajan, S., Johnson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+increases+in+both+common+and+rare+copy+number+load+associated+with+autism.">Global increases in both common and rare copy number load associated with autism.</a> Human molecular genetics. 22 (14), 2870-2880 (2013).</li><li>Vogt, N., Gibaud, A., Lemoine, F., de la Grange, P., Debatisse, M., Malfoy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplicon+rearrangements+during+the+extrachromosomal+and+intrachromosomal+amplification+process+in+a+glioma.">Amplicon rearrangements during the extrachromosomal and intrachromosomal amplification process in a glioma.</a> Nucleic Acids Research. , (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

O método Circle-Seq permite a detecção escala genoma de eccDNA a partir de células de levedura com resolução de nível sequência. O método é uma purificação eccDNA leve que não requer vórtice intensiva ou pipetagem e usa a separação da coluna pela força da gravidade para limitar eccDNA ruptura que levaria a digestão de exonuclease no passo subsequente. Estas características do método pode ser crucial para a detecção de grandes eccDNAs que contêm sequências de genes. Circle-Seq detectado numerosas eccDNAs incluindo genes completos (Conjunto de Dados 1). Ele também detectou a 86 kb levedura DNA mitocondrial. Assim, esse protocolo facilita a purificação de grandes elementos circulares de DNA. Mantendo o número de passos de extracção de ADN para um mínimo reduz o risco de perda eccDNA e maximiza o rendimento. Com base nos resultados de controlo, cravado-em plasmídeos, Círculo-Seq é altamente sensível, a detecção de um único ADN circular de 2.500 células. Além disso, a remoção de plasmídeos endógenos abundantes tais como 2μ; plasmídeo ou ADN mitocondrial pode melhorar significativamente a sensibilidade. Cura de 2μ a partir de culturas de levedura foi descrito 30. Alternativamente, 2μ e remoção do DNA mitocondrial pode ser alcançada com uma endonuclease rara de corte, tais como SwaI. No entanto, o passo enzima de restrição poderia ter como alvo outras eccDNAs de interesse e limitar o rendimento total eccDNA. As etapas críticas para a detecção eccDNA foram remoção de ADN linear (passo 3) e sequenciação de DNA (passo 5) a uma profundidade adequada. Para gravar a maioria dos eccDNAs a partir de uma população de células, sequenciamento de profundidade pode ser necessária 20. sequenciamento-end emparelhado deve fornecer uma confiança ainda maior de detecção eccDNA, como se espera junções circulares de DNA para produzir emparelhado-end lê esse mapa discordantemente. Estas discrepâncias suporta a descoberta de estruturas de ADN circular e pode, potencialmente, ser utilizado como um filtro de detecção de eccDNA adicional. O Círculo-Semétodo q foi validado utilizando três S. independente populações cerevisiae CEN.PK. Sequências detectadas incluído anteriormente relatado eccDNAs, plasmídeos endógenos e cravado-in plasmídeos e centenas de eccDNAs putativos (Conjunto de Dados 1). Estes resultados suportam conjuntos de dados Círculo-Seq anteriores de S. cerevisiae S288c 20. A descoberta de vários eccDNAs comuns para as populações CEN.PK S288C e indica que estes loci têm uma propensão para existir como elementos circulares (Figura 4). Temos anteriormente demonstrado que o [círculo GAP1] é enriquecido em condições limitadas de nitrogênio no fundo CEN.PK 8, embora não tenha sido encontrada evidência de [círculo GAP1] em outra estirpe fundos. Encontrar de eccDNA do CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111 e HXT6 HXT7 loci tanto S288c e CEN.PK sugere que uma predisposição para a circularização do DNA é conservido entre as estirpes de levedura. Ele continua a ser mostrado se [HXT6 / 7 círculo], [círculo ASP3-1], [círculo COS111] e [círculo CUP1-1 RSC30] conferem vantagens selectivas para células ou se a sua existência é meramente um efeito de altas taxas de circularização do ADN. Tomados em conjunto, os resultados indicam que o círculo-Seq é bem adequado para detectar eccDNAs quilobases de tamanho e tem vantagens para a identificação de genes completos com eccDNAs. Circle-Seq é um método altamente sensível que permite telas inteiras escala genoma de eccDNAs de levedura. O método Circle-Seq poderia abrir um novo campo de investigação destinada a elucidar o papel de eccDNA na geração de deleções de genes e amplificações. Dado que a arquitetura e estrutura do DNA são em grande parte conservada desde levedura eucariótica para eucariotas superiores, o método Circle-Seq deve, em princípio, ser applicablE para todas as células eucarióticas, com ligeiras modificações. Actualmente, o método não parece ter quaisquer limitações, embora a sua capacidade de purificar eccDNAs tamanho Megabase-se ainda a ser mostrado. Além disso, a utilização de O29 ADN-polimerase, que utiliza um método de amplificação de rolamento-círculo 31, cria uma tendência para as pequenas eccDNAs eccDNA tornando mais difícil a quantificação. Circle-Seq detecta eccDNAs grandes o suficiente para transportar genes completos, tornando-o adequado para estudos de DNA minutos circular dupla a partir de células somáticas humanas. Minutos duplas podem contribuir para o câncer quando proto-oncogenes são amplificados sobre esses elementos 32-37. Estudos de eccDNAs em células germinativas poderia ser usado para medir as taxas de mutação germinativa e avaliar a qualidade do esperma, por exemplo, na pecuária. Assim, Círculo-Seq tem o potencial para produzir insights sobre a taxa a que a variação genética surge sob a forma de variação do número de cópias, e levam a uma nova compreensão das doenças que envolvem contra cópia do genevariação do número 38-40.

Detecção de amplificação cromossómico cedo ou transiente é difícil porque requer a identificação de alterações nas moléculas de ADN em grandes populações de células. Cromossómicas variações no número de cópias (CNVs) são geralmente bem detectado após o seu estabelecimento, deixando apenas a estrutura final CNV como prova de que o mecanismo de variação gerado a 1,2. Detecção e recuperação DNA extrachromosomal circular (eccDNA) nos estágios iniciais de formação de CNV poderia elucidar os processos em curso no rearranjos genômicos. Anteriormente, de novo descoberta de eccDNA foi de micrografias eletrônicas 3, Giemsa de cromossomos em metáfase 4 ou eletroforese bidimensional 5. Estes métodos oferecem pouca ou nenhuma informação sobre a sequência do DNA circular. Técnicas visados ​​como o Southern blotting 6,7, inverse PCR 8, ou de fluorescência em hybridizatio situn 9 fornecer provas apenas cerca elementos eccDNA específicos. Nenhum destes métodos proporcionam a sequência de todos os tipos eccDNA existentes numa população de células. Divergência genómico em uma associação de células pode ser caracterizado por sequenciação do genoma e / ou matrizes ladrilhos 10,11. Detecção de uma deleção ou amplificação por métodos de purificação de ADN convencionais geralmente requer que um alelo mutado representam, pelo menos, 0,1-1% da população de células 12,13. Acentric eccDNAs se espera que sejam ainda mais transiente em uma cultura de células, devido à sua falta de centrómeros e potencial ausência da síntese de ADN em replicação. Assim, desde que a maioria eccDNAs presumivelmente estão em quantidades baixas e as suas sequências de se parecer com o genoma, métodos de extracção de ADN alternativos são necessários para detectar eccDNAs. Várias técnicas de purificação de ADN circular explorar as diferenças estruturais entre os cromossomas e ADN circular. Por exemplo, ultracentrifug de alta velocidadeção em gradientes de césio-cloreto é usado para isolar 350-3000 pares de bases (pb) a partir de grandes eccDNAs a linha celular de cancro humano HeLa 14. No entanto, a alta velocidade pode quebrar ou entalhe da espinha dorsal das estruturas circulares de DNA super-enrolados, alterando a velocidade de sedimentação 15 e no rendimento eccDNA. Dutta e colaboradores desenvolveram um método para de novo, a identificação escala genoma de ADN circular a partir de tecidos de ratinho, bem como a partir de culturas de células humanas e de galinha 16,17. Seu método é a extração de núcleos de tecido homogeneizado por ultracentrifugação sacarose seguida de purificação de plasmídeos e várias rodadas de reações enzimáticas e extrações de DNA. Seu protocolo identifica principalmente 200-400 eccDNAs pb, chamados microDNAs. Dutta e colegas de trabalho também tentou a purificação de microDNAs de Saccharomyces cerevisiae, mas não foram capazes de gravar microDNA desta espécie de levedura 16. Desenvolvemos um novo método para adetecção de novo de eccDNA de fungo chamado Círculo-Seq. Este método permite pesquisas escala genoma para moléculas circulares de DNA, grandes o suficiente para transportar genes inteiros e tão grande como o DNA 86 quilobases (kb) mitocondrial (mtDNA). O método de círculo-Seq foi desenvolvido a partir de um método de purificação de plasmídeo procarióticos bem estabelecida 18,19, optimizado para as células de levedura e eucariotas combinado com sequenciação profunda. Utilizando a abordagem Círculo-Seq, 1756 eccDNAs diferentes, todo maior do que 1 kb, foram detectados a partir de dez S. cerevisiae S288c populações 20. Um tamanho de corte foi escolhido para se concentrar em eccDNA que eram grandes o suficiente para transportar genes inteiros. Circle-Seq foi altamente sensível; ele detectou um único eccDNA dentro de milhares de células 20. No estudo atual, Circle-Seq foi usado para isolar e identificar 294 eccDNAs de três repetições biológicas de outro S. cerevisiae cepa de levedura, CEN.PK. Os dados revelam que eccDNA é um eleme genética comumnt em S. cerevisiae.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>211677</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600882</td>
			<td>For qPCR analysis. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN06.4</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disruptor Beads, 0.5 mm</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.2</td>
			<td>Agarose gel stain for detecting DNA/RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet plasmid miniprep kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>K0502</td>
			<td>Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI, FastDigest</td>
			<td>Life Technologies -&#160; Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>FD0594</td>
			<td>Endonuclease. Alternative product can be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini AX kit&#160;</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology, Poland</td>
			<td>010-50</td>
			<td>Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>E3105K</td>
			<td>ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>81845</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUG6 plasmid</td>
			<td>EUROSCARF, Germany</td>
			<td>P30114</td>
			<td>Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. Plasmid requests: Please contact Dr. Peter Philippsen@unibas.ch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN genomic-tip 100/G&#160;</td>
			<td>Qiagen, USA</td>
			<td>13343</td>
			<td>Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REPLI-g Mini Kit protocol&#160;</td>
			<td>Qiagen, USA</td>
			<td>150023</td>
			<td>Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>210929</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme)</td>
			<td>Nordic BioSite, Sweden</td>
			<td>Z1004-3</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data access to sequence files</td>
			<td>European Nucleotide Archive&#160;</td>
			<td></td>
			<td>EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D</td>
			<td></td>
			<td>Genotype MATa MAL2-8c SUC2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool</td>
			<td>EUROSCARF, Germany</td>
			<td></td>
			<td>S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3&#8710;1 leu2&#8710;0 met15&#8710;0 ura3&#8710;0 genexxx::KanMX.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Spectrophotometer&#160;</td>
			<td colspan="2">NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher</td>
			<td>Measuring DNA concentration. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscopy</td>
			<td>Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm.</td>
			<td></td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic library-build system</td>
			<td>Apollo 324, IntegenX Inc.</td>
			<td></td>
			<td>DNA library preparation. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing platform</td>
			<td colspan="2">Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc.</td>
			<td>DNA sequencing. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td colspan="2">Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methods</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% YPD media&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circle-Seq test on genomic DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 &#181;g genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 &#181;l) in wells on an 0.5 &#181;g/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mapping software</td>
			<td>Bowtie2 aligner, John Hopkins University</td>
			<td></td>
			<td>Ultrafast short read alignment. Reference: Langmead B, Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012, 9:357-359.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workflow bioinformatic system</td>
			<td>Galaxy, Open source.</td>
			<td></td>
			<td>A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: Goecks, J, Nekrutenko, A, Taylor, J and The Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 2010 Aug 25;11(8):R86. Blankenberg D, Von Kuster G, Coraor N, Ananda G, Lazarus R, Mangan M, Nekrutenko A, Taylor J. &#34;Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists&#34;. Current Protocols in Molecular Biology. 2010 Jan; Chapter 19:Unit 19.10.1-21. Giardine B, Riemer C, Hardison RC, Burhans R, Elnitski L, Shah P, Zhang Y, Blankenberg D, Albert I, Taylor J, Miller W, Kent WJ, Nekrutenko A. &#34;Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis.&#34; Genome Research. 2005 Oct; 15(10):1451-5.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide purification of extrachromosomal circular dna from eukaryotic cells

<html> DNAs circulares extracromossômicos (eccDNAs) são elementos genéticos comuns em Saccharomyces cerevisiae e são relatados em outros eucariotas também. EccDNAs contribuir para a variação genética entre células somáticas em organismos multicelulares e evolução das eucariotas unicelulares. métodos sensíveis para detectar eccDNA são necessários para esclarecer como esses elementos afetam a estabilidade do genoma e como fatores ambientais e biológicos induzir a sua formação em células eucarióticas. Este vídeo apresenta um método eccDNA-purificação sensível, chamado Circle-Seq. O método envolve a purificação de DNA circular, a remoção do restante DNA linear cromossômica, amplificação rolling-círculo de eccDNA, sequenciamento de profundidade, e mapeamento de coluna. tratamento exonuclease extensa foi necessária para a degradação do DNA cromossômico linear suficiente. O passo de amplificação rolling-círculoine-height:. normal; &quot;&gt; φ 29 polimerase enriquecido para DNA circular sobre o DNA linear de validação do método Circle-Seq em três populações de S. cerevisiae CEN.PK de 10 a 10 células detectadas centenas de perfis eccDNA em tamanhos maiores do que 1 quilobases . resultados repetidos de ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7 genes no DNA circular em ambos S288c e CEN.PK sugere que circularização DNA é conservado entre as estirpes nestes loci. em suma, o método Circle-Seq tem ampla aplicabilidade para rastreio de escala genoma para eccDNA em eucariotas, bem como para a detecção de tipos específicos eccDNA.

Para validar o método Circle-Seq, três S. populações cerevisiae CEN.PK de 1 x 10 10 células foram testadas depois as células foram cultivadas separadamente em meio YPD durante dez gerações. Eliminação cromossómica de ADN linear foi confirmada pela ausência de um sinal de qPCR ACT1 como descrito anteriormente 20 (dados não mostrados). eccDNA purificado e enriquecido foi sequenciado até 68 milhões lê (141 single-nucleotide-end lê) e mapeado para o genoma de referência CEN.PK113-7D (versão 19 de junho de 2012). As gravações de eccDNAs putativos das três amostras chamados C1, C2 e C4 foram atribuídos a regiões genómicas mapeados por contígua lê mais do que 1 kb. Com base em 10.000 simulações de Monte Carlo, o significado de cada região contígua lê mapeado por mais do que uma kb foi estimada. A partir deste regiões 79, 159 e 56 foram anotados como sequências eccDNA prováveis ​​(p &lt;0,1, Dataset 1). O número de contiguo gravadanos lê&gt; 1 kb aumentou em função da profundidade de sequência, sugerindo que, mesmo mais elementos eccDNA teria sido registada se as amostras tinham sido sequenciados mais (Figura 2). Como esperado, o método de círculo-Seq extraída numerosos lê a partir de um número de elementos conhecidos circulares de DNA incluindo o plasmídeo 2μ, DNA mitocondrial, genes de ARN ribossomal no cromossoma XII, e os três plasmídeos de controlo interno pBR322, pUC19 e pUG72 que foram misturados em amostras apenas antes da purificação em coluna (Figura 3). O vídeo mostra um exemplo de contígua lê que mapeada para o locus de HXT7 _ARS432_ HXT6 no cromossoma IV. Anteriormente, o [HXT6 / 7 círculo] foi detectada por Círculo-Seq em dez populações S288C (cada um com 1 x 10 10 células) e a estrutura de ADN circular foi confirmada por análise de PCR inverso 20. A ci [HXT6 / 7rcle] também foi registada em cada uma das três populações CEN.PK (Figura 4A). Além disso, a maioria dos genes comuns eccDNA entre as amostras replicadas de CEN.PK sobreposto eccDNA genes a partir de conjuntos de dados S288C (Figura 4B). Para testar a especificidade do protocolo Círculo-Seq para a purificação de ADN circular, de duas amostras, cada uma com o ADN genómico de 30 ug, foram testados. Uma amostra foi suplementado com 100 ng de DNA plasmídeo e eccDNA de ambas as amostras foram purificadas pelo protocolo Círculo-Seq. Após separação em coluna, o rendimento de ADN foi de 1,27% (380 ng) para a amostra sem plasmídeo (GD) e 1,60% (480 ng) para a amostra com o plasmídeo (GD + P). A eficiência do tratamento de exonuclease foi testado para o teor de ADN linear após 29 h e 72 h utilizando PCR contra ACT1. Sem amostras continham amplificado ACT1 (dados não mostrados). Uma fracção de cada amostra tratada com exonuclease foi ainda umamplified pelo O29 polimerase e os produtos de reacções enzimáticas foram analisadas por coloração com iodeto de propídio (Figura 5A-F) e electroforese em gel de agarose (Figura 5G). As amostras após o tratamento de exonuclease mostrou mínima de propídio iodo-mancha (Figura 5A-B). O O29 - amostra amplificada com apenas ADN genómico revelou estruturas fio (Figura 5C) semelhantes à amostra controle (Figura 5E). O O29 - amostra amplificada que tinha plasmídeo acrescentou revelou focos (Figura 5D) assemelham-se o controle de plasmídeo (Figura 5F). As imagens indicou que O29 polimerase de ADN enriquecido para circular sobre o ADN linear. A maioria do ADN cromossómico linear foi removido a partir de amostras após o tratamento 29 horas exonuclease (Figura 5A-B, G). No entanto, a extensa tratamento exonuclease por mais de 100 horas e usando mais de 100 unidades foi<html> necessária para remover todo o ADN cromossómico linear, como O29 - amostras amplificadas ainda mostrou um fundo de estruturas em forma de fio após 72 horas de tratamento com exonuclease (Figura 5C-D). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig1.jpg" /> . Figura 1. Esquema do método de círculo-Seq O protocolo possui 5 etapas: 1) cultura das células, 2) purificação e do enriquecimento de eccDNA por cromatografia em coluna, 3) digestão de ADN cromossómico restante linear da fracção de eluato, 4) de amplificação ADN por O29 a polimerase de ADN, e 5) a sequenciação de eccDNA altamente enriquecido e mapeamento das leituras para a S. genoma de referência cerevisiae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Adjacente lê&gt; 1 kb como função da profundidade sequência. EccDNA a partir de 1 x 10 10 células aumentam em função da profundidade de sequência (em milhões de mapeado lê). Mostrado: triplicados biológicos de haplóides CEN.PK S. cerevisiae populações (C1, C2, C4) separados por 10 a 10 divisões celulares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig3.jpg" /> Figura 3. Detecção de elementos de DNA circular conhecidos. (AB) Espalhe parcelas de cobertura de leitura (ler densidade) em por cento para plasmídeos em CEN.PK biológica replica C1, C2 e C4. (A) lê mapeada para os plasmídeos de levedura endógenos foram: 2μ; [Círculo rDNA] (genes de ARN ribossómico de cromossoma XII); e mtDNA (o ADN mitocondrial). (B) original lê mapeado para controlar plasmídeos. plasmídeos de controlo foram doseadas em amostras antes da purificação em coluna. rácios de plasmídeo por célula foram: pBR322 (mais sinais) 1: 1, pUC19 (círculos) 1:50, e pUG72 (triângulos) 1: 2500. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig4.jpg" /> Figura 4. Elementos eccDNA comum em CEN.PK e S288c. (A) diagrama de Venn exibindo sobreposição entre os 476 genes em 294 eccDNA elementos nas três amostras CEN.PK (C1, C2, C4). Os 16 sobrepostas genes eccDNA / plasmídeos comuns são anotados (todos os nomes de genes estão em Dataset 1). (B) diagrama de Venn de todos os genes registados em eccDNAs putativos das três amostras CEN.PK (C1, C2, C4), em comparação com todos os genes registados em eccDNAs putativas a partir de 10 amostras de S288C: S1-S2, R1-R4, Z1-Z4 (ver referência 20). São mostrados 13 repetições biológicas (S1-S2, R1-R4, Z1-Z4, C1-C3) com genes / plasmídeos e regiões eccDNA putativos que se sobrepunham um mínimo de 2 estirpe origens e 3 ou mais experimentais configurações. As amostras C, CEN.PK; amostras R e Z, S288c BY4741; Amostras S, S288c M3750. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig5.jpg" /> Figura 5. A visualização das amostras de ADN depois de exonuclease e O 2 9 de tratamento. (AF) de iodeto de propídio a coloração do ADN. Barra de escala, 10 | im. (A, C e E) com amostras de ADN genómico (GD); (B e D) GD amostras com mais de plasmídeo (GD + P). ( <str<html> ong&gt; AB) Após o tratamento exonuclease 29 hr (EXO 29 h); (CD) após o tratamento com exonuclease 72 h seguido por O29 a amplificação com polimerase (exo 72 H +) O29. (E) o controle DNA genômico depois e: a amplificação da polimerase O29; (F) Controlo de plasmídeo (5,5 kb) depois amplificação 29 polimerase; (Ø G) agarose gel-eletroforese. A partir da esquerda: L, 1 marcadores kb; P, o controlo de plasmídeo (5,5 kb) depois EXO 29 h; GD, após EXO 29 h (amostra, tal como em A); GD + P, depois de EXO 29 hr (amostra como B); GD e GD + P, depois de EXO 29 hr + O29; GD e GD + P, depois de EXO 72 hr + O29 (amostra como no CD). Veja a Tabela S1 para fornecer mais detalhes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Aset 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg &quot;/&gt; Conjunto de Dados 1. regiões DNA circularização potenciais em CEN.PK. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/DATASET1-CENPK.xlsx">Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.</a> São mostrados os dados de sequências e análises para 348 regiões. As colunas são AD, mapeamento eccDNA. A (primeira coluna a partir da esquerda), a amostra a partir do qual foi identificado eccDNA putativo; B, cromossoma; CD, início e fim coordenadas eccDNAs putativos. EH, o conteúdo eccDNA. E, sequência de replicação autónoma (ARS) na região; F, gene completo da região; L, parte do gene incluído na região; H, BLASTN do gene identificado. IO, a cobertura EccDNA e valores de p. I, região mais longo com uma sequência anotada exclusivamente no pb; J, número de todos mapeados lê; K, a cobertura de todos mapeados lê por fragmentos por kb a partir de um milhão mapeado lê (FPKM); L, p-valor para o putativo eccDNA comparado a ocorrência por acaso a partir de simulações de Monte Carlo; M, número de uniquely mapeados lê; NÃO; como K e L utilizando apenas mapeados exclusivamente lê (UFPKM). Parâmetros para mapeamento de leituras e simulações de Monte Carlo foram descrito 20.

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Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

A purificação de todo o genoma de DNA circular Extracromossômica de células eucarióticas

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

genome-wide-purification-extrachromosomal-circular-dna-from

Research

JoVE Journal

Biology

25.0K visualizações.  University of Copenhagen. This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation. 

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purificação de mitocôndrias de células de levedura

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

Análise do genoma de Aminoacylation (carregamento) Níveis de tRNA Usando Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Análise do genoma usando chip para identificar alvos isoforma específica Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high purity DNA. Based on multi-well filtration for bacterial lysate clearance and DNA purification, this method creates a streamlined process for plasmid preparation. Filter plates containing silica-based media can easily be processed by vacuum filtration or centrifuge to yield appreciable quantities of plasmid DNA. Quantitative analyses determine the purified plasmid DNA is consistently of high quality with average OD260/280 ratios of 1.97. Overall, plasmid yields offer more pure DNA for downstream applications, such as sequencing and cloning. This streamlined method of using AcroPrep Advance Filter Plates allows for manual, semi-automated or fully-automated processing.

This protocol is a cost effective alternative for efficient parallel clarification and plasmid DNA purification from E. coli cultures. The AcroPrep Advance process starts with an optimized lysate clarification filter plate followed by purification on a high binding capacity DNA binding filter plate.

Purificação simplificada do DNA plasmidial das culturas Procarióticas

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

Genome-wide tela de Metas de miRNA Usando a missão Biblioteca ID Alvo

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Quantitativos e automatizada de alto rendimento de todo o genoma Telas de RNAi em C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

A Novel Bayesiana Algoritmo de Mudança-ponto para Genome-wide Análise de tipos de dados ChIPseq Diversos

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.