Thanks to Kenn D. M&#248;ller and Claus Sternberg (DTU) for technical assistance and to Tue S. J&#248;rgensen for quantitative PCR analysis.

NOTA: Una panoramica della purificazione DNA circolare e metodo di sequenziamento (Circle-Seq) è illustrato in Figura 1. 1. La coltivazione, Cell Raccolta e membrana plasmatica Turbativa <ol><li> Seminare cellule di lievito (ad esempio Saccharomyces cerevisiae) da un / cultura O N in 50 ml di mezzo nutriente completa di lievito peptone destrosio (YPD). Inoculare a bassa densità cellulare iniziale di 1-3 x 10 5 cellule / ml o una densità ottica di circa 0,01 OD 600. <ol><li> Incubare le cellule a 30 ° C con agitazione a 150 giri al minuto (rpm) fino cellule raggiungono la massima densità cellulare di circa 1 x 10 10 cellule, dopo circa 24 a 48 ore o una densità ottica a OD 600&gt; 10.0. NOTA: Il tempo di coltivazione non è fondamentale in quanto le concentrazioni di cellule inferiore può essere utilizzata. </li></ol></li><li> Trasferire la cultura superato di un tubo conico da 50 ml, agglomerare le cellule per centrifugazione a800 xg per 3 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Lavare il pellet con 25 ml di soluzione tampone di 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0, ri-agglomerare le cellule per centrifugazione a 800 xg per 3 min e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 1,2 ml di tampone risospensione fornita da un kit plasmide colonna di purificazione. </li><li> Passaggio facoltativo: Aggiungere plasmidi altamente diluite come controlli per la purificazione degli elementi di DNA circolare 20. NOTA: il set di dati corrente, una miscela plasmide 7,7 microlitri è stato applicato per ciascun campione contenente 10 10 cellule. La miscela plasmide magazzino consisteva di tre plasmidi in diverse concentrazioni; pBR322 a 38 ng / campione, pUC19 a 0,5 ng / campione, e pUG72 a 0.01 ng / campione. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in due provette micro-centrifuga 2 ml, ciascuna completato con perle di vetro 0,5 mm ad un rapporto 1: 3 del volume totale della sospensione. </li><li> Vortex ogni tubo alla massima velocità per 10 minuti per interrompere cellule del plasmamembrane. Pellet le sferette per centrifugazione a 268 xg per 30 sec e trasferire 1,2 ml surnatante combinato da due provette da microcentrifuga in una nuova provetta. NOTA: Alternative al passo 1,6-1,7, usare zymolyase per distruggere le cellule in soluzione tampone 0,6 ml risospensione. Dieci unità di zymolyase possono interferire con 5 x 10 7 cellule entro 1,5 ore a 35 ° C. </li></ol> 2. EccDNA arricchimento mediante cromatografia su colonna <ol><li> Seguire il protocollo da un kit per la colonna di purificazione di plasmidi. In breve, il trattamento di ogni campione con 1,2 ml di soluzione alcalina, mescolare delicatamente e incubare 3 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 1,2 ml di tampone di neutralizzazione, mescolare delicatamente e centrifugare a 9650 xg per 5 min. </li><li> Caricare la soluzione su una colonna equilibrata con soluzione 1 ml equilibrazione e consentire al liquido di fluire attraverso la colonna per gravità. </li><li> Lavare la colonna con una soluzione di lavaggio 4 ml. Quando la soluzione è passata attraverso la resina, aggiungere accuratamente 0,3 ml eluizione cosìluzione per sostituire la maggior parte del volume vuoto 0,35 ml colonna. </li><li> Eluire il DNA in un nuovo tubo di raccolta con la soluzione 1 ml di eluizione e precipitare il DNA con l&#39;aggiunta di 0,8 ml di miscela di precipitazione. Centrifugare a 9650 xg per 10 min. </li><li> Lavare il pellet di DNA con 0,5 ml di etanolo al 70%, centrifugare a 9650 xg per 5 min, aria secca per 5 a 15 min e sciogliere il DNA purificato in 25 microlitri di acqua sterile. NOTA: Solo conservazione a breve termine del DNA in acqua è raccomandato. Preferibilmente, passare direttamente al punto 3. </li></ol> 3. La digestione del rimanente lineare DNA cromosomico <ol><li> Passaggio facoltativo: per facilitare la digestione specifica di DNA lineare esonucleasi, trattare il DNA purificato con una endonucleasi rara taglio come Noti. Per 5 mg DNA, usare 1 unità NotI, 5 microlitri 10x tampone di digestione e acqua sterile fino ad un volume totale di 50 microlitri. Incubare la reazione a 37 ° C per 16 ore e calore inattivare l&#39;endonucleasi a 80 ° C per 5 min. </li><li> Aggiungere 20unità esonucleasi (2 ml), 4 microlitri ATP (25 mM), 34 microlitri di acqua sterile e 10 microlitri 10x tampone di reazione direttamente al DNA endonucleasi-spaccati 50 microlitri di raggiungere un volume di reazione 1x di 100 microlitri, usando l&#39;esonucleasi ATP-dipendente kit. </li><li> Eseguire idrolisi di DNA a singolo filamento e doppio filamento lineare a 37 ° C per 5 giorni o più. Aggiungere un ulteriore ATP 4 microlitri (25 mM), 0,6 microlitri tampone di reazione 10x e 20 unità esonucleasi ogni 24 ore per continuare la digestione DNA enzimatica a un volume di reazione 1x. </li><li> Dopo la rimozione di DNA lineare, campione 2 microlitri dalla soluzione esonucleasi trattata per confermare l&#39;eliminazione di DNA lineare cromosomico mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), utilizzando un marcatore cromosomico come l&#39;actina gene ACT1 20. <ol><li> Ogni volume di reazione qPCR 20 ml contiene 2 ml campione esonucleasi-trattati, 150 Nm ACT1 primer 5&#39;-TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3 &#39;e 5&#39;-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3 &#39;, 2% (volume / volume) dimetilsolfossido, e master mix fluorescente 10 ml verde. </li><li> Utilizzare la condizione di reazione; 3 min a 95 ° C, seguita da 45 cicli di 15 secondi a 95 ° C e 30 secondi a 60 ° C. NOTA: ACT1 è un indicatore particolarmente adatto per DNA lineare in quanto le variazioni del numero di copie di questo gene sono deleteri 21-23 così eccDNA non dovrebbe portare ACT1. </li><li> Alternative alla analisi della digestione del DNA di qPCR sono standard PCR (4.3) o ioduro di propidio colorazione (4.4). <ol><li> Utilizzare campione esonucleasi trattati con 2 ml come modello PCR con primer ACT1 5&#39;-TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3 &#39;e 5&#39;-GAACGACGTGAGTAACACC-3&#39;. Poiché il controllo ACT1 positivo, usare 50-100 ng genomica S. DNA cerevisiae come modello. Condizioni di reazione della PCR; 3 min a 95 ° C, seguita da 35 cicli di 30 secondi a 95 ° C, 30 sec a 56 ° C e 1 min a 72 ° C. </li><li> Le reazioni di PCR Run di gel electrophoresis on 1% agarosio con 0,5 ug / ml di bromuro di etidio. Cercare un 0,8 kb ACT1 band. </li></ol></li><li> L&#39;assenza o la presenza di DNA lineare possono essere esaminati anche dal propidio ioduro colorazione prima e dopo l&#39;amplificazione del DNA. <ol><li> Mescolare ciascun campione di DNA in un 1: Volume 1 con 1: 1,000 H 2 O-soluzione diluita di 20 mM propidio ioduro di magazzino. Lasciare soluzione al buio per 10-20 min a temperatura ambiente e analizzare colorazione del DNA mediante microscopia a fluorescenza ad ingrandimento 100x utilizzando un filtro di eccitazione di fluorescenza rossa a 663-738 nm ed un tempo di esposizione di 5 a 30 sec. Come il controllo del DNA-colorazione, uso Ø29-amplificato DNA genomico da lieviti e / o plasmide Ø29-amplificato. </li></ol></li></ol></li><li> Calore inattivare la soluzione esonucleasi a 70 ° C per 30 min. </li></ol> 4. DNA Amplificazione <ol><li> Amplifica il purificata e arricchita eccDNA dal punto 3.5) con Ø29 DNA polimerasi 24-26 accordozione al protocollo del produttore polimerasi. <ol><li> In breve, mescolare 5 ml arricchiti eccDNA con tampone di denaturazione 5 ml. </li><li> Dopo 3 minuti a temperatura ambiente, aggiungere tampone di neutralizzazione 10 ml. Mescolare delicatamente e aggiungere 30 ml master mix contenente tampone di reazione 29 ml e 1 ml Ø29 DNA polimerasi. Incubare la reazione a 30 ° C per 16 ore o più (fino a 72 ore). Calore inattivare la polimerasi Ø29 DNA a 65 ° C per 3 min. </li></ol></li></ol> 5. Sequencing e analisi dei dati <ol><li> Tosare il eccDNA amplificato con un ultrasonicatore mirato per una dimensione media di destinazione massima di 300 bp. Utilizzare le seguenti impostazioni per un campione di DNA microlitri 130: potenza 450W di picco di intensità, 60 trattamento sec, fattore lavoro del 30%, a 200 cicli al raffica, temperatura di 7 ° C. </li><li> Aggiungere etichette indice di codici a barre e adattatori per la frammentazione legge per la sintesi di librerie per il sequenziamento, utilizzando un metodo appropriato per la preparazione biblioteca. </li><li>Eseguire sequenziamento profondo, per esempio come 141-nucleotide singolo-end legge su una piattaforma di sequenziamento high throughput. </li><li> Mappa legge al genoma del lievito di riferimento sotto inchiesta e consentire legge per mappare a più regioni. Ad esempio, utilizzare un sistema di workflow liberamente disponibile 27,28 e di breve lettura software di mappatura allineatore 29. </li><li> Identificare legge da regioni del eccDNAs putativi utilizzando contigui si legge, ad esempio, più di sette contigui legge (&gt; 1 kb) senza lacune 20. NOTA: Il software è disponibile 27,28 per esplorare mappato legge in regioni genomiche di interesse. </li></ol>

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G., Dai, A., Davidson, K. K., Forseth, B. J., Wahl, G. M., Von Hoff, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+differentiation+in+HL60+cells+by+the+reduction+of+extrachromosomally+amplified+c-myc.">Induction of differentiation in HL60 cells by the reduction of extrachromosomally amplified c-myc.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6674-6678 (1994).</li><li>Vogt, N., Lef&#232;vre, S. -. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+increases+in+both+common+and+rare+copy+number+load+associated+with+autism.">Global increases in both common and rare copy number load associated with autism.</a> Human molecular genetics. 22 (14), 2870-2880 (2013).</li><li>Vogt, N., Gibaud, A., Lemoine, F., de la Grange, P., Debatisse, M., Malfoy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplicon+rearrangements+during+the+extrachromosomal+and+intrachromosomal+amplification+process+in+a+glioma.">Amplicon rearrangements during the extrachromosomal and intrachromosomal amplification process in a glioma.</a> Nucleic Acids Research. , (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Il metodo Circle-Seq permette la rilevazione del genoma scala di eccDNA da cellule di lievito con risoluzione a livello di sequenza. Il metodo è una purificazione eccDNA lieve che non richiede vortex intensive o pipettaggio e utilizza separazione colonna per gravità per limitare eccDNA rotture che porterebbe ad esonucleasi digestione nel passaggio successivo. Queste caratteristiche del metodo può essere cruciale per il rilevamento di grandi eccDNAs che contengono sequenze geniche. Circle-Seq rilevato numerose eccDNAs tra geni completi (set di dati 1). Ha inoltre rilevato il 86-kb lievito DNA mitocondriale. Così, questo protocollo facilita la purificazione di grandi elementi di DNA circolari. Mantenere il numero di passi di estrazione del DNA al minimo riduce il rischio di perdita eccDNA e massimizza il rendimento. In base ai risultati per il controllo, a spillo-in plasmidi, Cerchio-Seq è molto sensibile, rilevando un unico DNA circolare da 2.500 cellule. Inoltre, la rimozione di abbondanti plasmidi endogeni quali 2μ; plasmide o DNA mitocondriale potrebbe migliorare in modo significativo la sensibilità. Polimerizzazione di 2μ da colture di lievito è stato descritto 30. In alternativa, 2μ e la rimozione del DNA mitocondriale potrebbero essere ottenuti con una endonucleasi rare taglio, ad esempio Swai. Tuttavia, la fase di enzima di restrizione potrebbe colpire altri eccDNAs di interesse e limitare il rendimento totale eccDNA. Passaggi critici per il rilevamento eccDNA erano rimozione di DNA lineare (fase 3) e sequenziamento del DNA (fase 5) ad una profondità adeguata. Per registrare la maggior parte dei eccDNAs da una popolazione di cellule, sequenziamento potrebbe essere necessaria 20. sequenziamento associati-end dovrebbe fornire anche una maggiore fiducia di rilevazione eccDNA, come giunzioni DNA circolare sono tenuti a produrre abbinato-end legge che mappa discordante. Queste discrepanze supportano la scoperta di strutture di DNA circolare e possono potenzialmente essere utilizzati come filtro eccDNA-rivelazione aggiuntivo. Il Cerchio-SeMetodo q è stato convalidato utilizzando tre S. indipendenti popolazioni cerevisiae CEN.PK. Sequenze rilevate inclusi precedentemente riportato eccDNAs, plasmidi endogeni ed è stata aggiunta in plasmidi e centinaia di eccDNAs putativi (set di dati 1). Questi risultati sostengono precedenti serie di dati Circle-Seq da S. cerevisiae S288c 20. La scoperta di diversi eccDNAs comuni alle popolazioni CEN.PK e S288c indica che questi loci hanno una propensione a esistere come elementi circolari (Figura 4). Abbiamo precedentemente dimostrato che la [cerchio GAP1] è arricchito sotto azoto condizioni limitate sullo sfondo CEN.PK 8, anche se non è stato trovato prove di [cerchio GAP1] in altri ambiti di deformazione. Ritrovamento eccDNA dal CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111, e HXT6 HXT7 loci sia S288c e CEN.PK suggerisce che una predisposizione per circularization DNA è conservito tra i ceppi di lievito. Resta da dimostrare se [HXT6 / 7 cerchio], [cerchio ASP3-1], [cerchio COS111], e [cerchio CUP1-1 RSC30] conferiscono vantaggi selettivi per le cellule, o se la loro esistenza è soltanto un effetto di alti tassi di circularization DNA. Nel loro insieme, i risultati indicano che Circle-Seq è adatto per la rilevazione eccDNAs kilobase dimensioni e presenta vantaggi per l&#39;identificazione eccDNAs con i geni completi. Circle-Seq è un metodo altamente sensibile che consente schermi interi genoma scala di eccDNAs dal lievito. Il metodo Circle-Seq potrebbe aprire un nuovo campo di ricerca volta a chiarire il ruolo di eccDNA nel generare delezioni geniche e amplificazioni. Dato che l&#39;architettura e la struttura del DNA sono in gran parte conservati dal lievito eucariotica a eucarioti superiori, il metodo Circle-Seq dovrebbe, in linea di principio, essere applicablE per tutte le cellule eucariotiche, con lievi modifiche. Allo stato attuale, il metodo non sembra avere alcuna limitazione, anche se la sua capacità di purificare eccDNAs Megabase dimensioni deve ancora essere dimostrato. Inoltre, l&#39;uso di Ø29 DNA polimerasi, che utilizza un metodo di amplificazione rolling-cerchio 31, crea una polarizzazione verso eccDNAs piccole rendendo eccDNA quantificazione più difficile. Circle-Seq rileva eccDNAs grande abbastanza per portare i geni pieno, che lo rende adatto per gli studi sulle doppie minuti-circolari di DNA da cellule somatiche umane. Doppia minuti possono contribuire al cancro quando proto-oncogeni sono amplificati su questi elementi 32-37. Studi di eccDNAs nelle cellule germinali potrebbero essere utilizzati per misurare i tassi di mutazione germinale e valutare la qualità dello sperma, per esempio nel bestiame. Così, Circle-Seq ha il potenziale per produrre intuizioni il tasso al quale variazione genetica pone in forma di variazione del numero di copie, e portare a una nuova comprensione di malattie che coinvolgono gene copiaturanumero di variazione 38-40.

Rilevare l&#39;amplificazione presto o transitoria cromosomica è difficile perché richiede l&#39;individuazione alterazioni singole molecole di DNA in grandi popolazioni di cellule. Cromosomiche variazioni copia-numerici (CNV) sono generalmente rilevate ben dopo la loro istituzione, lasciando solo la struttura finale CNV come prova del meccanismo che ha generato la variazione 1,2. Rilevamento e recupero del DNA extracromosomici circolare (eccDNA) nelle precedenti fasi di formazione CNV potrebbe spiegare i processi in corso in riarrangiamenti genomici. In precedenza, de novo scoperta di eccDNA era di microscopio elettronico 3, Giemsa colorazione dei cromosomi in metafase 4 o bidimensionale elettroforesi su gel 5. Questi metodi forniscono poche o nessuna informazione sulla sequenza del DNA circolare. Tecniche mirate quali la Southern assorbente 6,7, inversa PCR 8, o in situ fluorescente hybridization 9 fornire la prova solo su elementi eccDNA specifici. Nessuno di questi metodi fornisce la sequenza di tutti i tipi eccDNA esistenti in una popolazione di cellule. Divergenza genomica in un pool di cellule può essere caratterizzata da sequenziamento del genoma e / o array piastrelle 10,11. Rilevare una delezione o amplificazione mediante metodi di purificazione del DNA convenzionali di solito richiede che un allele mutato rappresentino almeno 0,1-1% della popolazione cellulare 12,13. Acentrico eccDNAs dovrebbero essere ancora più transitoria in una coltura cellulare a causa della loro mancanza di centromeri e potenziale assenza di sintesi del DNA in replicazione. Così, poiché la maggior parte eccDNAs sono presumibilmente in quantità basse e le loro sequenze assomigliano genoma, sono necessari metodi di estrazione del DNA alternativi per rilevare eccDNAs. Diverse tecniche di purificazione del DNA circolari sfruttano le differenze strutturali tra cromosomi e DNA circolare. Per esempio, ultracentrifug ad alta velocitàzione in gradienti di cesio-cloruro viene utilizzato per isolare 350-3000 paia di basi (bp) grandi eccDNAs dalla linea di cellule di cancro umano HeLa 14. Tuttavia, ad alta velocità in grado di rompere o nick la spina dorsale delle strutture del DNA circolare supercoiled, alterando la velocità di sedimentazione 15 e il rendimento eccDNA. Dutta e colleghi hanno sviluppato un metodo per de novo, identificazione genoma scala di DNA circolare da tessuti di topo e da colture di pollo e cellule umane 16,17. Il loro metodo è l&#39;estrazione di nuclei dal tessuto omogeneizzato da ultracentrifugazione saccarosio seguita da purificazione plasmide e diversi cicli di reazioni enzimatiche ed estrazioni di DNA. Il loro protocollo individua principalmente 200-400 eccDNAs bp, chiamati microDNAs. Dutta e colleghi anche tentato di purificazione di microDNAs da Saccharomyces cerevisiae, ma non erano in grado di registrare microDNA da questa specie di lievito 16. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo perde novo rilevazione di eccDNA da lievito chiamato Circle-Seq. Questo metodo consente sondaggi genoma scala per le molecole di DNA circolare abbastanza grande per trasportare geni interi e grande come il 86 kilobase (kb) DNA mitocondriale (mtDNA). Il metodo Circle-Seq è stato sviluppato da un procariote plasmide metodo di purificazione consolidata 18,19, ottimizzato per le cellule di lievito eucariotiche e combinato con sequenziamento profondo. Utilizzando l&#39;approccio Circle-Seq, 1756 diversi eccDNAs, tutti più grandi di 1 kb, sono stati rilevati da dieci S. cerevisiae S288c popolazioni 20. Una dimensione di cut-off è stato scelto di concentrarsi su eccDNA che erano abbastanza grande per trasportare geni interi. Circle-Seq era molto sensibile; ha rilevato un unico eccDNA all&#39;interno migliaia di cellule 20. Nel corso di studio, Cerchio-Seq è stato utilizzato per isolare ed identificare 294 eccDNAs da tre repliche biologiche di un altro S. cerevisiae ceppo di lievito, CEN.PK. I dati rivelano che eccDNA è un eleme genetica comunent a S. ceppi di cerevisiae.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>211677</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600882</td>
			<td>For qPCR analysis. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN06.4</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disruptor Beads, 0.5 mm</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.2</td>
			<td>Agarose gel stain for detecting DNA/RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet plasmid miniprep kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>K0502</td>
			<td>Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI, FastDigest</td>
			<td>Life Technologies -&#160; Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>FD0594</td>
			<td>Endonuclease. Alternative product can be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini AX kit&#160;</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology, Poland</td>
			<td>010-50</td>
			<td>Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>E3105K</td>
			<td>ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>81845</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUG6 plasmid</td>
			<td>EUROSCARF, Germany</td>
			<td>P30114</td>
			<td>Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. Plasmid requests: Please contact Dr. Peter Philippsen@unibas.ch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN genomic-tip 100/G&#160;</td>
			<td>Qiagen, USA</td>
			<td>13343</td>
			<td>Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REPLI-g Mini Kit protocol&#160;</td>
			<td>Qiagen, USA</td>
			<td>150023</td>
			<td>Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>210929</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme)</td>
			<td>Nordic BioSite, Sweden</td>
			<td>Z1004-3</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data access to sequence files</td>
			<td>European Nucleotide Archive&#160;</td>
			<td></td>
			<td>EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D</td>
			<td></td>
			<td>Genotype MATa MAL2-8c SUC2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool</td>
			<td>EUROSCARF, Germany</td>
			<td></td>
			<td>S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3&#8710;1 leu2&#8710;0 met15&#8710;0 ura3&#8710;0 genexxx::KanMX.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Spectrophotometer&#160;</td>
			<td colspan="2">NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher</td>
			<td>Measuring DNA concentration. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscopy</td>
			<td>Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm.</td>
			<td></td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic library-build system</td>
			<td>Apollo 324, IntegenX Inc.</td>
			<td></td>
			<td>DNA library preparation. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing platform</td>
			<td colspan="2">Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc.</td>
			<td>DNA sequencing. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td colspan="2">Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methods</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% YPD media&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circle-Seq test on genomic DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 &#181;g genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 &#181;l) in wells on an 0.5 &#181;g/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mapping software</td>
			<td>Bowtie2 aligner, John Hopkins University</td>
			<td></td>
			<td>Ultrafast short read alignment. Reference: Langmead B, Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012, 9:357-359.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workflow bioinformatic system</td>
			<td>Galaxy, Open source.</td>
			<td></td>
			<td>A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: Goecks, J, Nekrutenko, A, Taylor, J and The Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 2010 Aug 25;11(8):R86. Blankenberg D, Von Kuster G, Coraor N, Ananda G, Lazarus R, Mangan M, Nekrutenko A, Taylor J. &#34;Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists&#34;. Current Protocols in Molecular Biology. 2010 Jan; Chapter 19:Unit 19.10.1-21. Giardine B, Riemer C, Hardison RC, Burhans R, Elnitski L, Shah P, Zhang Y, Blankenberg D, Albert I, Taylor J, Miller W, Kent WJ, Nekrutenko A. &#34;Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis.&#34; Genome Research. 2005 Oct; 15(10):1451-5.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide purification of extrachromosomal circular dna from eukaryotic cells

<html> DNA circolare extrachromosomal (eccDNAs) sono elementi genetici comuni in Saccharomyces cerevisiae e sono riportati in altri eucarioti pure. EccDNAs contribuiscono alla variazione genetica tra le cellule somatiche negli organismi multicellulari e all&#39;evoluzione degli eucarioti unicellulari. metodi sensibili per la rilevazione eccDNA sono necessari per chiarire come questi elementi influenzano la stabilità del genoma e come i fattori ambientali e biologici inducono la loro formazione nelle cellule eucariotiche. Questo video presenta un metodo eccDNA-purificazione sensibile chiamato Circle-Seq. Il metodo comprende colonna di purificazione del DNA circolare, eliminazione delle ultime DNA cromosomico lineare, l&#39;amplificazione rolling-cerchio di eccDNA, sequenziamento profondo, e la mappatura. trattamento esonucleasi Ampio è stato richiesto per la degradazione del DNA cromosomico lineare sufficiente. Il passo di laminazione cerchio amplificazioneine-height:. normal; &quot;&gt; φ 29 polimerasi arricchito per il DNA circolare su DNA lineare convalida del metodo Circle-Seq su tre popolazioni di S. cerevisiae CEN.PK di 10 10 cellule rilevato centinaia di profili eccDNA in dimensioni più grandi di 1 kilobase . scoperte ripetute di ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7 geni sul DNA circolare sia in S288c e CEN.PK suggerisce che circularization DNA è conservata tra i ceppi in questi loci. in sintesi, il metodo Circle-Seq dispone di un ampio applicabilità per lo screening del genoma scala per eccDNA negli eucarioti, nonché per la rilevazione di tipi eccDNA specifici.

Per validare il metodo Circle-Seq, tre S. popolazioni cerevisiae CEN.PK di 1 x 10 10 cellule sono stati esaminati dopo che le cellule sono state coltivate separatamente in YPD per dieci generazioni. Cromosomica eliminazione DNA lineare è stato confermato dall&#39;assenza di un segnale qPCR ACT1 come descritto in precedenza 20 (dati non mostrati). Purificata e arricchita eccDNA è stato sequenziato fino a 68 milioni di letture (141-nucleotide singolo-end legge) e mappato il genoma di riferimento CEN.PK113-7D (versione da 19 giugno 2012). Registrazioni di eccDNAs putativi dei tre campioni denominate C1, C2 e C4 sono stati assegnati a regioni genomiche mappati dal contigue legge più di 1 kb. Sulla base di 10.000 simulazioni Monte Carlo, il significato di ogni regione mappata contigue legge più di 1 kb è stato stimato. Da questo 79, 159 e 56 regioni sono state annotate come probabili sequenze eccDNA (p &lt;0.1, Dataset 1). Il numero di contiguo registratoci legge&gt; 1 kb aumentata in funzione della profondità di sequenza suggerendo che anche più elementi eccDNA sarebbero stati rilevati se campioni erano stati sequenziati maggiori (Figura 2). Come previsto, il metodo Circle-Seq estratto numerosi legge da un certo numero di elementi conosciuti circolari di DNA, tra cui il plasmide 2μ, il DNA mitocondriale, geni RNA ribosomiale sul cromosoma XII, e le tre plasmidi di controllo interno pBR322, pUC19 e pUG72 che sono stati addizionati in campioni appena prima purificazione colonna (Figura 3). Il video mostra un esempio di contigui legge che mappato il locus HXT7 _ARS432_ HXT6 sul cromosoma IV. In precedenza, il [HXT6 / 7 cerchio] è stato rilevato dal Circle-Seq in dieci popolazioni S288c (ognuna con 1 x 10 10 cellule) e la struttura del DNA circolare è stata confermata da inversa PCR 20. Il [HXT6 / 7 CIicona circolare] è stato registrato anche in ciascuno dei tre popolazioni CEN.PK (Figura 4A). Inoltre, la maggior parte dei comuni geni eccDNA tra campioni ripetitivi CEN.PK sovrapposte eccDNA geni dai set di dati S288c (Figura 4B). Per verificare la specificità del protocollo Circle-Seq per la purificazione di DNA circolare, due campioni, ciascuno con 30 ug di DNA genomico, sono stati testati. Un campione è stato integrato con 100 ng del plasmide DNA e eccDNA da entrambi i campioni sono stati purificati dal protocollo Circle-Seq. Dopo separazione della colonna, la resa DNA era di 1,27% (380 ng) per il campione senza plasmide (GD) e 1,60% (480 ng) per il campione con il plasmide (GD + P). L&#39;efficacia del trattamento esonucleasi è stato testato per il contenuto di DNA lineare dopo 29 ore e 72 ore mediante PCR contro ACT1. Non ci sono campioni contenuti amplificato ACT1 (dati non riportati). Una frazione di ciascun campione esonucleasi trattato era inoltre unmplified dal Ø29 polimerasi e prodotti di reazioni enzimatiche sono stati analizzati mediante colorazione ioduro di propidio (Figura 5A-F) ed elettroforesi su gel di agarosio (Figura 5G). I campioni dopo il trattamento esonucleasi hanno mostrato il minimo ioduro di propidio-macchia (Figura 5A-B). Il Ø29 - campione amplificato con solo il DNA genomico rivelato strutture filiformi (Figura 5C) simili al campione di controllo (Figura 5E). Il Ø29 - campione amplificato che ha avuto plasmide aggiunto rivelato focolai (Figura 5D) che assomiglia al controllo plasmide (Figura 5F). Le immagini hanno indicato che Ø29 polimerasi arricchito per il DNA circolare su DNA lineare. Più DNA cromosomico lineare è stato rimosso da campioni dopo il trattamento 29 hr esonucleasi (Figura 5A-B, G). Tuttavia, esteso trattamento esonucleasi per più di 100 ore e con più di 100 unità era<html> necessario per rimuovere tutto il DNA cromosomico lineare, come O29 - campioni amplificati ancora mostrato uno sfondo di strutture filiformi, dopo 72 ore di trattamento esonucleasi (Figura 5C-D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig1.jpg" /> . Figura 1. Schema del metodo Circle-Seq Il protocollo ha 5 fasi: 1) coltura cellulare, 2) la purificazione e l&#39;arricchimento di eccDNA mediante cromatografia su colonna, 3) digestione del restante DNA cromosomico lineare nella frazione di eluato, 4) amplificazione DNA da Ø29 DNA polimerasi, e 5) sequenziamento altamente arricchito eccDNA e mappatura di legge al S. genoma di riferimento cerevisiae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Attiguo legge&gt; 1 kb come funzione della profondità di sequenza. EccDNA da 1 x 10 10 cellule aumentano in funzione della profondità di sequenza (in milioni di letture mappata). Indicato: triplicato biologiche provenienti dalla aploidi CEN.PK S. popolazioni cerevisiae (C1, C2, C4) separati da 10 10 divisioni cellulari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig3.jpg" /> Figura 3. Rilevamento di noti elementi di DNA circolare. (AB) Scatter trame di copertura lettura (leggi densità) in percentuale per i plasmidi in CEN.PK biologico repliche C1, C2 e C4. (A) mappato legge ai plasmidi di lievito endogeni sono stati: 2μ; [RDNA cerchio] (geni RNA ribosomiale dal cromosoma XII); e mtDNA (DNA mitocondriale). (B) si legge unico mappato per controllare plasmidi. plasmidi di controllo sono stati addizionati in campioni prima di purificazione colonna. rapporti di plasmidi per cellula erano: pBR322 (segni più) 1: 1, pUC19 (cerchi) 1:50 e pUG72 (triangoli) 1: 2.500. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig4.jpg" /> Figura 4. elementi comuni eccDNA in CEN.PK e S288c. (A) diagramma di Venn visualizzazione sovrapposizione tra i 476 geni 294 elementi eccDNA nei tre campioni CEN.PK (C1, C2, C4). I 16 comuni che si sovrappongono geni eccDNA / plasmidi sono annotati (tutti i nomi del gene sono nel set di dati 1). (B) diagramma di Venn di tutti i geni registrati su eccDNAs putativi dei tre campioni CEN.PK (C1, C2, C4), rispetto a tutti i geni registrati su eccDNAs putativi da 10 S288c campioni: S1-S2, R1-R4, Z1-Z4 (vedi riferimento 20). Indicato sono 13 repliche biologiche (S1-S2, R1-R4, Z1-Z4, C1-C3) con i geni / plasmidi e regioni eccDNA putativi che si sovrapponevano un minimo di 2 ambiti di deformazione e 3 o più sperimentali messe a punto. campioni C, CEN.PK; campioni R e Z, S288c BY4741; Campioni S, S288c M3750. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig5.jpg" /> Figura 5. Visualizzazione di campioni di DNA dopo esonucleasi e Ø 2 9 trattamento. (AF) propidio ioduro colorazione del DNA. barra della scala, 10 micron. (A, C ed E) I campioni con DNA genomico (GD); (B e D) i campioni con GD più plasmide (GD + P). ( <str<html> ong&gt; AB) Dopo il trattamento esonucleasi 29 ore (Es 29 h); (CD) dopo il trattamento esonucleasi 72 ore seguita da Ø29 amplificazione della polimerasi (EXO 72 h + O29). (E) controllo DNA genomico dopo e: l&#39;amplificazione della polimerasi Ø29; (F) Controllo plasmide (5.5 kb) dopo amplificazione 29 polimerasi; (Ø G) agarosio gel eletrophoresis. Da sinistra: L, 1 kb marcatori; P, il controllo plasmide (5.5 kb) dopo EXO 29 ore; GD, dopo EXO 29 hr (campione in A); GD + P, dopo EXO 29 ore (campione B); GD e GD + P, dopo EXO 29 ore + Ø29; GD e GD + P, dopo EXO 72 ore + Ø29 (campione in CD). Vedi Tabella S1 extra per i dettagli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Aset 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg &quot;/&gt; Set di dati 1. I potenziali regioni di circolari del DNA in CEN.PK. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/DATASET1-CENPK.xlsx">Cliccate qui per scaricare questo file.</a> vengono riportati i dati di sequenza e analisi per 348 regioni. Le colonne sono dC, la mappatura eccDNA. A (prima colonna da sinistra), campione da cui è stato identificato putativo eccDNA; B, cromosoma; CD, avviare e coordina fine eccDNAs putativi. EH, contenuti eccDNA. E, autonomamente replicare sequenza (ARS) nella regione; F, completa gene nella regione; G, parte del gene incluse nella regione; H, gene BLASTN-identificato. IO, la copertura EccDNA e p-value. I, nella regione più lunga con una sequenza annotato unicamente in bp; J, numero di tutti mappato legge; K, la copertura di tutti mappati legge da frammenti per ogni kb da un milione mappato legge (FPKM); L, p-value per putativo eccDNA rispetto a verificarsi per caso da simulazioni Monte Carlo; M, il numero di uniquely mappato legge; NO; come K e L utilizzando solo mappata univocamente legge (UFPKM). I parametri per la mappatura di legge e simulazioni Monte Carlo sono stati descritti 20.

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Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

Purificazione genoma a livello di extrachromosomal circolare DNA dalle cellule eucariotiche

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

genome-wide-purification-extrachromosomal-circular-dna-from

Research

JoVE Journal

Biology

25.0K Views.  University of Copenhagen. This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation. 

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

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Biologia

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purificazione dei mitocondri da cellule di lievito

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

Genoma Analisi dei Aminoacylation (carica) I livelli di tRNA usando i microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Genoma Analisi mediante ChIP per identificare Isoform obiettivi specifici per Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high purity DNA. Based on multi-well filtration for bacterial lysate clearance and DNA purification, this method creates a streamlined process for plasmid preparation. Filter plates containing silica-based media can easily be processed by vacuum filtration or centrifuge to yield appreciable quantities of plasmid DNA. Quantitative analyses determine the purified plasmid DNA is consistently of high quality with average OD260/280 ratios of 1.97. Overall, plasmid yields offer more pure DNA for downstream applications, such as sequencing and cloning. This streamlined method of using AcroPrep Advance Filter Plates allows for manual, semi-automated or fully-automated processing.

This protocol is a cost effective alternative for efficient parallel clarification and plasmid DNA purification from E. coli cultures. The AcroPrep Advance process starts with an optimized lysate clarification filter plate followed by purification on a high binding capacity DNA binding filter plate.

Purificazione semplificata del DNA plasmidi da culture procariotiche

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

Genome-Wide Screen per le destinazioni miRNA utilizzo di target Biblioteca MISSION ID

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Quantitative e automatica High-throughput Genome-wide Schermi RNAi in C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

A Novel bayesiano Cambia punto di Algoritmo per Genome-wide analisi di diversi tipi di dati ChIPseq

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genome-wide gene delezioni in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Da Throughput PCR ad alta

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.