The authors would like to acknowledge the help of Walter Scholdei (Max-Planck-Institute for Polymer Research, Mainz, Germany.

1.ナトリウムナフタレニ活性化溶液の調製と表面活性化注：よく換気ドラフト内で反応を行います。金属ナトリウムなどの引火性の高い溶剤や腐食性の金属を処理するための一般的なルールに従ってください。ナフタリンは、非常に少量で、非常に不快な臭い（防虫剤）を持っています！特記しない場合の反応は室温で行われます。アジ化ナトリウムは非常に有毒です！ THF分子ふるい（体積）に対して約20％を保存した（99.9％は、マテリアルのリストを参照してください）​​。ナトリウムを超える顕著な含水量でTHFを蒸留。微量の水が存在する場合、ナトリウムナフタレニドの形成は起こりません。 <ol><li> （3オングストロームのモレキュラーシーブ上で乾燥THF）テトラヒドロフラン20ml中のナフタレンを1.4g（10.9ミリモル）の溶液に、PTFE-を備えたスクリューキャップ100mlのガラスボトル0.25グラム（10.9ミリモル）のナトリウム金属を加えますコー​​ティングされた磁気撹拌棒。 注：Dissolu（ - 40°C 35）化が大幅に小片と適度な加熱にナトリウムを切断することによって向上させることができます。最終溶液は暗い、わずかに緑がかった色を有しており、厳密な乾燥条件下で保存してもよいです。 </li><li>厚さ0.5mmの箔材料から直径12mmのPTFEディスクを打ち抜きます。マーク1の側（ 例えば 、文字スタンプパンチを使用）し、イソプロパノールできれいに。 </li><li>鉗子を使用して2分 - 1のための活性化溶液（ステップ1.1）で個別にPTFE-サンプルをインキュベートします。注：ダークブラウンに白から色の変化は、治療の成功を示しています。 </li><li>続いてイソプロパノールで二回THFで、次いですすぎます。 注：ナフタレニ溶液が排出されるときに淡い光の茶色の色が変化します。 （おそらく金属ナトリウムを含む）、未使用ナフタレニドの溶液をゆっくりと前処理にイソプロパノールを添加することにより分解されなければなりません。 </li><li> 3時間トリクロロ酢酸（w / v）の20％を含む過酸化水素水（30％）で処理した試料を酸化します。ウォッシュ水とドライで。表面は現在、わずか茶色がかった外観を有します。注意：表面の大幅増加濡れ性の活性化と酸化の結果を。この発見は、以前は14について詳細に検討しました。 </li><li> 、2時間の乾燥THF中の50％（v / v）のヘキサメチレンジイソシアネート（HMDI）で酸化したディスクを扱うTHFで洗浄し、乾燥するために残します。 </li><li> 3時間とドライ - 2水にイソシアネートベアリングサンプルを加水分解する。注：最終的なアミノ官能化PTFE表面は、はるかに安定したイソシアネート含有サンプルよりも、さらにカップリングのための多くの標準的な架橋剤と互換性があります。 </li></ol> 2.ペプチド固定化<ol><li>炭酸塩緩衝液、pH 9を50mMで20％（v / v）のジエチレングリコールジグリシジルエーテル（ジエポキシド）の溶液を調製します。 </li><li>個別に24ウェルプレートにマークされた側を上にしてアミノ化ディスクを置き、エポキシド溶液1.5mlを追加します。サンプルの完全なカバレッジを確認してください。 2時間インキュベートし、2を洗います回水で一度炭酸緩衝液と。 </li><li>新鮮な24ウェルプレートの個々のウェルの底には、NaN 3 0.01％を含む50mM中の0.5mg / mlのペプチド（ 例えば 、REDV）炭酸緩衝液、pH 9の50μlを添加して、慎重にエポキシ官能ディスクの利点を置きます-downペプチド溶液の液滴上に（ すなわち 、ダウンサイドマークされています）。井戸の底とPTFEディスクとの間のスペースが完全に毛細管現象に濡らされていることを確認します。 </li><li>少なくとも3時間または一晩（底にウエットティッシュペーパーを配置することによって）加湿雰囲気で湿った室（ 例えば、タイトな閉鎖蓋を持つ任意の密封可能なプラスチックの箱）でインキュベートします。 注：REDVモチーフが同様に特徴付けみなすことができるものの、スクランブル又は逆転アミノ酸配列は、追加の陰性対照として含まれてもよいです。 </li><li>水で3回洗浄し、少なくとも30分間、50％イソプロパノール/水中で滅菌します。細胞播種、rinsに先立ち滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に試料を電子。 </li></ol> 3.細胞播種<ol><li>標準的な細胞培養手順17,18を使用したHUVECを成長させます。 </li><li> 24ウェルプレートで修正された面を上にして、ペプチドコンジュゲートのサンプルを置きます。コントロールとして、未処理のPTFEディスクを使用してください。 </li><li>シード5×10ウェルあたり2 mlの培地中で4 HUVECを、37℃で4時間、インキュベーター中、5％CO 2インキュベートします。 </li><li>ディスクを取り出し、付着していない細胞を除去し、新鮮な24ウェルプレートに転送するために慎重にすすいでください。新鮮な培地の2ミリリットルを加え、所望の期間インキュベート（ 例えば、24時間、1ワット、 など ）。 2日毎に培地に変更します。 </li><li>ジメチルスルホキシド（DMSO）に1mg / mlのカルセインAMのストック溶液を準備します。 </li><li>培地を除去し、細胞を成長させた後、PBSで洗浄し、1μL/ mlのカルセインAM染色（ 例えば、mlのPBSあたり原液の1μl）を含むPBSを追加します。静かに攪拌し、incubat暗所で45分間、37℃での電子。 </li><li>標準FITCフィルターを備えた蛍光顕微鏡で顕微鏡写真を取る（例：488 nmの、エム515 nm）をすぐにPBSで洗浄し。 100倍の倍率を使用してください。変更されていないだけでなく、処理された試料からの三連を実行します。 </li><li> ImageJソフトウェアを使用すると、細胞が定着領域を決定します。あるいは、手動で細胞数をカウントしたり、ImageJのを使用しています。どちらの方法でも、それぞれの表面上の細胞の付着と成長についての同様の情報を提供します。 </li></ol>

<ol>
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V., Zentner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+LL-37-grafted+titanium+surfaces+with+bactericidal+activity.">Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity.</a> Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).</li><li>Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., F&#246;rch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivatization+of+Plasma+Polymerized+Thin+Films+and+Attachment+of+Biomolecules+to+Influence+HUVEC-Cell+Adhesion.">Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion.</a> Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

PTFEの表面改質のプロトコルの詳細な説明は、図6に示されるようにポリマー主鎖からのフッ素の除去から始まる連続したステップで構成され、その結果、層は、共役炭素-炭素二重結合の豊富な量が含まれて形成されています。ナフタレニの処理時に開発濃い茶色がかった色に応じて。酸性の過酸化水素による標準的な酸化が淡褐色に明るくすることにより伴うヒドロキシル表面が、これは二重結合の損失を反映して得られます。このプロセスは、明らかに、IR分光法によって証明されます。 より一般的に適用可能な機能性を達成するために、ペンダントOH基は、第一級アミンへのNCO成分のジイソシアネートおよびその後の加水分解との単純な処理により、アミノ官能性に変換しました。アミン含有物質は、HIG一方、長期間保存することができるので、これは、有利ですHLY反応性イソシアネートは、空気湿度の非常に存在に対して感受性です。 ケアは、ナトリウムナフタレニとイソシアネートの両方が加水分解を非常に受けやすいためであっても、初期活性化ステップとHMDI処理中の水の微量の回避に注意しなければなりません。試料が完全に溶液中に浸漬されている標準的な手順とは対照的に、本プロトコルは、試薬の少量のみを必要とします。したがって、この方法は、高価なペプチドの多くを保存します。 アミン軸受面は、多くの生体分子の結合のための理想的な出発点です。この作業に用いられるジエポキシドは、いくつかの点で興味深いものです：「生理的に不活性」のジオールに水性環境中で加水分解され、親水性、比較的安価アミンおよび未反応のエポキシドに対して高度に反応性です。ただ1つの反応基が存在oがあるホモ二官能性架橋剤は、適切な試薬でありますNペプチドが固定化されます。これは、（これは頻繁に使用されるシーケンスRGDSについても同様である）のN末端にただ1つの一級アミノ基を含むREDVに適用されます。 （側鎖アミンとの）リジン残基を含むペプチドを結合の結果は、適切なカップリングが定義された方法では起こらないことを意味し、曖昧です。この場合、ヘテロ架橋剤（ 例えば 、アミンおよびチオール反応性）およびシステイン（N末端 ​​またはC末端）を含むペプチドを用いる戦略が役に立つ18です。 細胞接着性の観点から、ペプチドの固定化の結果は、（ 図3及び4）明白です。ほとんどの細胞は裸のPTFEに付着しないのに対し、REDV-変更は、材料に優れた細胞接着性基材をレンダリングします。この技術はまた、同様の結果を有する多孔性（拡大）PTFE（ 図5に適用可能であることは前述したプロトコルの準備作業のショーに相補的な</stroNG&gt;）。これは、材料の血管移植片は、で作られているので、これは特に重要です。主にプラズマ処理（プラズマ活性化13、プラズマ重合19）を利用する技術を表面とは対照的に、このプロトコルは、容易に入手可能な化学物質および実験室手順を使用することによって、高度に洗練された設備を回避することによってPTFEの共有結合的修飾のための指針を提供します。反応種（ 例えば 、ラジカル）が材料と接触した際に不活性化のために、これらの構造に浸透することができませんので、このような反応性プラズマ（ など 、O 2、NH 3、）およびプラズマ重合などのプラズマ方法は、多孔性構築物またはチューブの中には適用されません表面。例えば、小口径​​人工血管（直径&lt;5ミリメートル）は、この方法で処理することはできません。これとは対照的に、湿式化学によって、装置の形状に関する制限はありません。このように、endothの形成を可能にすることにより、ePTFEの血管移植片、血栓形成および長期開存の腔側にelial層を向上させることができます。また、外科ヘルニアメッシュの細胞接着面は、より良好な組織統合をもたらすと考えられます。

いくつかを言及するためにいくつかの時間のために承認されている医学で使用される様々なポリマー強化された生体適合性を示さない、 すなわち 、細胞接着性の欠如、線維性カプセル化および血栓形成の誘導、。生体材料および生物学的システムとの間の相互作用は、主にインプラントの表面で起こります。その結果、研究は影響を受けない材料のバルク特性を残したまま、所望の用途に適切な特性を作成するために、表面改質に焦点を当てています。ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、生理学的に不活性なポリマーは、例えば、ヘルニア手術用メッシュ1、医療用ポート2のような多くの医療分野で使用されているように、最も重要なのは、血管移植片3。 特に血液に接触状況でPTFEの疎水性は、多くの場合、thrombotiその結果、非特異的血漿成分の吸着と結果の血小板接着としての原因となりますCイベントや移植片4の閉塞。さらに、PTFEは、ほとんどのポリマーのように、望ましい特徴は、血管移植片5の内側（管腔）表面上の内皮細胞（EC）の有益な層の形成を誘導することであろう細胞接着とカバレッジをサポートしていません。バイオミメティック内皮は、特にその抗血栓特性6、その自然同等の機能の多くを果たすことが期待されます。一般的なバイオミメティック修正戦略はバルク特性が影響を受けない材料を残しながら、もっぱら細胞接着性を有する材料を持たせるという概念に基づいています。また、血小板粘着、抗接着剤（防汚）7属性を組み込むことによって減少させることができます。種々のペプチド-主に細胞外マトリックスのタンパク質に由来する-は強くインテグリン8のクラスに属し、細胞受容体に結合することによって細胞接着を増強することが記載されています。ありますこの点の例をST知らほとんどの細胞型と相互作用するペプチドするArg-Gly-Asp（RGD）です。他のアミノ酸配列は、排他的に特定の細胞に発現インテグリンによって認識されます。例えば、Argの-のGlu-ASP-ヴァル（REDV）およびTyr-Ileの-Glyを-のSer-Argの（YIGSR）は、特定の方法9でのECに結 ​​合することが見出されてきました。このようなペプチドの共有結合固定化は、金属およびポリマー10,11を含む、本質的に非接着性材料の過剰に行われています。 多孔質PTFE、より正確には延伸PTFE（ePTFEの） -ポリエチレンテレフタレート（PET）と一緒に-血管移植片12を製造するための最も重要な材料です。このようなプラズマ改質13として、または光化学的方法14による適切な治療のために確立された物理的な技術は、多孔性および/ ​​または管状の構造は、それぞれの孔または管腔内容易に治療可能ではないという事実によって妨げられています。湿式化学PTFEであるため、ほとんどの化学的攻撃15に抵抗する含フッ素重合体の高度に不活性な性質のために困難な作業です。 本稿では、共有結合修飾戦略の​​比較的容易な方法を説明します。結合可能なPTFEをレンダリングする手順から適応、官能基は、生物学的に活性な分子のさらなる結合のためのアンカーポイントとして機能する材料の表面上に作成されました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="700">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">PTFE foil 0.5 mm</td>
			<td style="width:119px;">Cadillac Plastic&#160;</td>
			<td style="width:145px;">n/a</td>
			<td style="width:115px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">REDV peptide</td>
			<td>Genecust</td>
			<td>n/a</td>
			<td>custom synthesis &#62;95 % purity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iso-propanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tetrahydrofurane (THF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dimethylsulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">molecular sieve 3&#197;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>208574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sodium metal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>483745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">naphthalene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>147141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hydrogen peroxide 30 %</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>95321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6399&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">diethylene glycol diglycidyl ether</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hexamethylene diisocyanate (HMDI)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>52650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcein-AM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24 well plates</td>
			<td>Greiner-Bio-One</td>
			<td>662 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850</td>
			<td>&#160;Nicolet</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fluorescence microscope Olympus X-70</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">humbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ePTFE vascular graft</td>
			<td>Gore</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wet chemistry and peptide immobilization on polytetrafluoroethylene for improved cell-adhesion

細胞接着性を有する材料表面を持たせることは生体材料研究と組織工学における一般的な戦略です。これは、これらの材料が新たに合成されたポリマーの導入に関連した十分に特徴づけおよび法的問題を回避することができるされているので、医療に長年の使用を持っている既に承認されたポリマーのために特に興味深いです。ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）は、血管移植片の製造のために最も頻繁に用いられる材料の一つであるが、ポリマーの機能を促進、細胞接着を欠いています。内皮化、 すなわち、内皮細胞の融合層と移植片内面の完全なカバレッジは、主に人工的なインターフェイスの血栓形成を低減することにより、最適なパフォーマンスにキーをみなされています。 この研究は、ペプチド修飾PTFE上の内皮細胞の成長を調査し、未修飾基材上に得られたものと、これらの結果を比較します。とのカップリング内皮細胞接着ペプチドのArg-Gluの-ASP-ヴァル（REDV）は、後続の結合工程に続いて、試薬ナトリウムナフタレニドを使用して、含フッ素重合体の活性化を介して行われます。細胞培養は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を用いて達成され、ペプチド固定化材料の優れた細胞増殖は、2週間の期間にわたって示されています。

重要な化学反応工程の結果は、IR分光法（ 図1）によりモニターしました。マイナー程度まで - - OH-機能ナトリウムナフタレニドとの最初の活性化は、二重結合を生成します。信号を示すC = C結合は、ほぼ独占的にヒドロキシル基を有する表面が得られる、酸化により消滅します。さらに、標準的なコンジュゲーション工程の分析はここでは示されていません。活性化および酸化による色の変化が使用されると予想化学と一致する。共役二重結合系は、（ 図2）を明るくに、その損失をもたらす茶色がかったことが期待されます。また、表面形態の活性化及び酸化の可能な結果は、走査型電子顕微鏡を用いて調べました。事実上、治療の有害な影響は（ 図2）は観察されませんでした。 3及び図 4は、内皮細胞増殖に対するREDV、固定化の結果を示します。実質的には、細胞接着および増殖が未処理材に発生していないのに対し、修正が強く2週間にわたってコロニー形成をサポートしています。臨床応用（ すなわち、血管移植片）について例示し、修正は同じ一週間（ 図5）の期間にわたって、同様の結果を有する延伸PTFE製の市販のグラフトから元の材料で行いました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig1.jpg" /> 自然のままのPTFE（A）の二重結合の形成およびヒドロキシ機能（B）のある程度の結果のPTFE。治療の 図1. IR分光法 。続いてC = C結合が酸化による（Cに還元されます</stroNG&gt;）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54272/54272fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig2.jpg" /> 裸の表面活性化したPTFEの 図2. 光学外観。（A）未処理のPTFEは（左）白色に見えるのに対し、ナトリウムナフタレニを使用して、活性化は、わずか（右）酸化時に明るくなる濃い茶色がかった色（真ん中）が得られます。未処理の（B）およびPTFE（C）サンプルをさらに走査型電子顕微鏡（倍率2,000X）を用いて検討した酸化。ディスクは直径12mmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54272/54272fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 自然のままのペプチドで修飾されたPTFE上 図3. 内皮細胞培養。ペプチド修飾材料上の接着と成長が大幅に強化されているのに対し、未処理の試料は電気部品（A、C、24時間後E、1ワットと2それぞれワット）によって植民地化されていません（それぞれW 24時間W 1及び2後のB、D及びF）。スケールバー：100μmであり、倍率100X <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54272/54272fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig4.jpg" /> ImageJの解析によるセルカバレッジの 図4. 定量。裸PTFE（A、C上の細胞の成長、E）およびREDV共役系高分子の表面に（B、D、F）は総面積の割合のカバレッジとして表現。固定化ペプチドは明らかに初期接着（B）を可能にし、2週間の期間（D、F）上でコロニー形成をサポートしています。 ）平均±標準偏差、決定をトリプリケート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54272/54272fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig5.jpg" /> 図5. 内皮細胞は、延伸PTFEで1週間増殖させた。ePTFEの構造は、走査型電子顕微鏡（A）を用いて示されています。多孔質材料で得られた結果は、平らなPTFEの試料について得られたものと一致しています。見つかったいくつかの細胞とは対照的に裸の材料（B）に修正された表面（C）は 、細胞増殖のための優れた基板を提供します。スケールバーはそれぞれA、BとCのために100μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54272/54272fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig6.jpg" /> ナトリウム-ナフタレニ処理によって生成された図6 の湿式化学を使用してPTFEの化学修飾の模式図。二重結合は、OH、官能基を生じる酸化されます。ヒドロキシル反応ジイソシアネートは、その後、固定化し、アミンに加水分解されます。最後に、二官能性ジエポキシドは、N末端 ​​アミノ基を使用して、REDVペプチドを結合するために適用されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54272/54272fig6large.jpg" target="_blank">Vにはこちらをクリックしてください</a>この図の拡大版をIEW。

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Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

改善された細胞接着のためのポリテトラフルオロエチレンにウェットケミストリーおよびペプチドの固定化

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

wet-chemistry-peptide-immobilization-on-polytetrafluoroethylene-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.6K ビュー.  Sidra Cardiovascular Research. Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

ビデオ: Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

生物工学

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel cells.1-3 In most bioelectrochemical applications, enzymes or organelles are immobilized onto an electrode surface with the use of some type of polymer matrix. This polymer scaffold should keep the enzymes stable and allow for the facile diffusion of molecules and ions in and out of the matrix. Most polymers used for this type of immobilization are based on polyamines or polyalcohols - polymers that mimic the natural environment of the enzymes that they encapsulate and stabilize the enzyme through hydrogen or ionic bonding. Another method for stabilizing enzymes involves the use of micelles, which contain hydrophobic regions that can encapsulate and stabilize enzymes.4,5 In particular, the Minteer group has developed a micellar polymer based on commercially available Nafion.6,7 Nafion itself is a micellar polymer that allows for the channel-assisted diffusion of protons and other small cations, but the micelles and channels are extremely small and the polymer is very acidic due to sulfonic acid side chains, which is unfavorable for enzyme immobilization. However, when Nafion is mixed with an excess of hydrophobic alkyl ammonium salts such as tetrabutylammonium bromide (TBAB), the quaternary ammonium cations replace the protons and become the counter ions to the sulfonate groups on the polymer side chains (Figure 1). This results in larger micelles and channels within the polymer that allow for the diffusion of large substrates and ions that are necessary for enzymatic function such as nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). This modified Nafion polymer has been used to immobilize many different types of enzymes as well as mitochondria for use in biosensors and biofuel cells.8-12 This paper describes a novel procedure for making this micellar polymer enzyme immobilization membrane that can stabilize enzymes. The synthesis of the micellar enzyme immobilization membrane, the procedure for immobilizing enzymes within the membrane, and the assays for studying enzymatic specific activity of the immobilized enzyme are detailed below.

This article will describe the procedure for synthesizing a hydrophobically modified Nafion enzyme immobilization membrane and how to immobilize proteins and/or enzymes within the membrane and test their specific activity.

酵素の固定化と安定化のための疎水性の塩で修飾ナフィオン

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

皮膚からのI型コラーゲンの調製のための改良された方法

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

推定細胞接着分子のキャラクタリゼーションのためのビーズ凝集アッセイ

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

DNA結合色素化学と液滴デジタルPCRを使用したマイクロRNA定量循環

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

ゼブラフィッシュ幼虫の改良実験操作のための長期のライブ イメージング デバイス

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

プライマリのグリア細胞の in Vitro Neuroinflammation のモデリングのための三次元ハイドロゲル文化を改善

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present several limitations that have led to the use of biomaterials in combination with osteogenic growth factors, such as bone morphogenetic proteins (BMPs). Commonly used absorption or encapsulation methods require supra-physiological amounts of BMP2, typically resulting in a so-called initial burst release effect that provokes several severe adverse side effects. A possible strategy to overcome these problems would be to covalently couple the protein to the scaffold. Moreover, coupling should be performed in a site-specific manner in order to guarantee a reproducible product outcome. Therefore, we created a BMP2 variant, in which an artificial amino acid (propargyl-L-lysine) was introduced into the mature part of the BMP2 protein by codon usage expansion (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk was coupled to functionalized beads through copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). The biological activity of the coupled BMP2-K3Plk was proven in vitro and the osteogenic activity of the BMP2-K3Plk-functionalized beads was proven in cell based assays. The functionalized beads in contact with C2C12 cells were able to induce alkaline phosphatase (ALP) expression in locally restricted proximity of the bead. Thus, by this technique, functionalized scaffolds can be produced that can trigger cell differentiation towards an osteogenic lineage. Additionally, lower BMP2 doses are sufficient due to the controlled orientation of site-directed coupled BMP2. With this method, BMPs are always exposed to their receptors on the cell surface in the appropriate orientation, which is not the case if the factors are coupled via non-site-directed coupling techniques. The product outcome is highly controllable and, thus, results in materials with homogeneous properties, improving their applicability for the repair of critical size bone defects.

Biomaterials doped with Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) have been used as a new therapeutic strategy to heal non-union bone fractures. To overcome side effects resulting from an uncontrollable release of the factor, we propose a new strategy to site-directly immobilize the factor, thus creating materials with improved osteogenic capabilities.

骨形成タンパク質 2 固体表面にクリックケミストリーによるサイト向け固定

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the wet spinning method, gelatin fibers are produced by smooth extrusion in a suitable coagulation medium. To increase the functional surface of these gelatin fibers and their ability to mimic the features of tissues, gelatin can be molded into a tube form by referring to this concept. Examined by in vitro and in vivo tests, the gelatin tubes demonstrate a great potential for application in tissue engineering. Acting as a suitable filling gap material, gelatin tubes can be used to substitute the tissue in the damaged area (e.g., in the nervous or cardiovascular system), as well as to promote regeneration by providing a direct replacement of stem cells and neural circuitry. This protocol provides a detailed procedure for creating a biomaterial based on a natural polymer, and its implementation is expected to greatly benefit the development of correlative natural polymers, which help to realize tissue regeneration strategies.

We developed and describe a protocol based on the wet spinning concept, for the construction of gelatin-based biomaterials used for the application of tissue engineering.

組織再生用ゼラチンのウェット ベース回転成形プロセス

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the ...

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

極薄ポリジメチルシロキサン マイクロ流体チップを用いた保水ライブ線虫個人の固定化

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

改善された細胞接着のためのポリテトラフルオロエチレンにウェットケミストリーおよびペプチドの固定化

要約

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原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

酵素の固定化と安定化のための疎水性の塩で修飾ナフィオン

皮膚からのI型コラーゲンの調製のための改良された方法

推定細胞接着分子のキャラクタリゼーションのためのビーズ凝集アッセイ

DNA結合色素化学と液滴デジタルPCRを使用したマイクロRNA定量循環

ゼブラフィッシュ幼虫の改良実験操作のための長期のライブイメージングデバイス

プライマリのグリア細胞の in Vitro Neuroinflammation のモデリングのための三次元ハイドロゲル文化を改善

骨形成タンパク質 2 固体表面にクリックケミストリーによるサイト向け固定

組織再生用ゼラチンのウェットベース回転成形プロセス

極薄ポリジメチルシロキサンマイクロ流体チップを用いた保水ライブ線虫個人の固定化

改善された細胞接着のためのポリテトラフルオロエチレンにウェットケミストリーおよびペプチドの固定化

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DNA結合色素化学と液滴デジタルPCRを使用したマイクロRNA定量循環

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プライマリのグリア細胞の in Vitro Neuroinflammation のモデリングのための三次元ハイドロゲル文化を改善

骨形成タンパク質 2 固体表面にクリックケミストリーによるサイト向け固定

組織再生用ゼラチンのウェット ベース回転成形プロセス

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