このプロトコルは、金属表面に治療用ペプチドを付加する新しい化学的戦略を含み、幅広い金属生体材料の生体適合性を改善する可能性を秘めています。これは、バイオインプラントのベアメタル表面にペプチドや治療タンパク質を付加するための普遍的かつ堅牢な技術です。この技術を用いて、ステントで引き起こされる炎症反応を防ぐために、CD47ペプチドを付加して金属ステントの生体適合性を向上させた。
2-イソプロパノールを用いたステンレス箔クーポンまたはメッシュディスクをシェーカーで5分間洗浄します。この洗浄を2回行い、その後、1回の洗浄につき10分間クロロホルムでサンプルを2回洗浄します。クレンジングしたステンレス鋼のサンプルをオーブンに220°Cで30分間置きます。
焼いたホイルやメッシュディスクをPABTの0.5%水溶液に浸し、シェーカーに1時間インキュベートします。脱イオン蒸留水でPABT修飾サンプルを5回洗浄します。標本を新しいバイアルに移し、その後の繰り返しを行います。
シェーカーで室温で15分間、TCEPでサンプルを処理します。脱気した蒸留水を、凍結乾燥機などの真空発生装置を用いた丸底フラスコで脱気し、脱気水でホイルやメッシュディスクを5回洗浄します。サンプルを新しいバイアルに移し、その後の繰り返しを行います。
212.5マイクロリットルのストックPEI-PDTと125マイクロリットルの0.4モル酢酸ナトリウムを脱気水に希釈して、1%PEI-PDT溶液の5ミリリットルを調製します。洗浄したステンレス鋼の標本を1%PEI-PDTでインキュベートします。空気をアルゴンガスに置き換え、バイアルを気密に密封し、シェーカーに1時間混ぜます。
ペプチドの結合をすぐに進めるか、最大1週間摂氏4度でサンプルを保存します。ヒトペプチドCD47粉末を脱気50%酢酸に溶解させて、1ミリリットルのヒトペプチドCD47ストック溶液につき1ミリグラムを調製し、4.5ミリリットルの脱ガスPBSで500マイクロリットルのストックを溶解して作業溶液を調製する。洗浄されたPEI-PDT被覆試料を、室温でペプチドCD47の働く溶液で1時間振盪してインキュベートする。
終了したら、テキスト原稿に記載されているように、ペプチドCD47コーティングサンプルを洗浄します。ペプチドCD47またはスクランブルペプチドで金属箔をコーティングした後、4分の1インチのPVCチューブを38センチメートルの長さの部分にカットし、最大8つの未改変、スクランブルペプチド、またはペプチドCD47改変金属箔を3つの異なるチューブに挿入します。健康なヒトドナーから30ミリリットルの血液を収集し、抗血小板薬を含まない、採取した血液の凝固を防ぐために4%クエン酸ナトリウムの1ミリリットルで注射器を事前にロードする。
10ミリリットルの注射器を使用して各チューブに10ミリリットルの血液を入れ、金属アダプターで端を接続します。チャンドラーループ装置の車輪に血液で満たされたチューブを置き、4時間摂氏37度で車輪の回転によって金属箔に沿って血液を渡します。チューブから血液を排出し、IRB要件に従ってそれを処分し、その後、ホイルを取り出すためにメスでチューブを切断します。
0.1モル塩化ナトリウムでカコチル酸ナトリウムバッファーに70%溶液を希釈することにより、2%グルタルアルデヒド溶液を調製します。2%グルタルアルデヒド溶液中のホイルを15分間インキュベートし、一晩摂氏4度で貯蔵します。金属箔を分析する前に、PBSで3回洗浄してください。
37°Cの水浴でPBSの8ミリリットルを温めます。1つのCFDAバイアルに90マイクロリットルのDMSOを加えて10ミリモルCFDA染料ストック溶液を調製し、その後、75マイクロリットルのストックCFDAを暖かいPBSに加えて作業溶液を調製する。チューブを数回反転して、アルミニウム箔で混ぜて覆います。
各ホイルを24ウェルプレートに入れるCFDA染料を1ミリリットルに入れる。プレートをアルミホイルで覆い、37°Cでプレートを15分間インキュベートし、ホイルをPBSで3回洗浄し、蛍光顕微鏡で画像化します。共有結合したTAMRAコンジュゲートペプチドCD47の濃度を定量し、金属表面上のペプチドの最大固定化密度を決定した。
最大ペプチド保持量は約180ナノグラム/センチメートル平方メートルで、1ミリリットル当たり100マイクログラムの入力濃度で達成された。改変金属表面上のTAMRA共役ペプチドCD47の固定化は、蛍光顕微鏡法によってさらに裏付けられた、TAMRA共役ペプチドCD47処理メッシュディスクの表面から放出される均一な蛍光を示した。この修飾を欠いた対照メッシュの表面で最小蛍光のみが検出され、それによって非特異的に結合したTAMRA結合ペプチドCD47を蛍光の主な供給源として除外した。
また、ペプチドCD47被覆表面は、スクランブル修飾および未改変ペプチド制御と比較して、血液媒介性細胞の付着物が大幅に減少することを確認した。ラットバフィーコート細胞から単球を培養し、ペプチドCD47修飾ステンレス箔を用いて培養した。急性単球付着の58%の減衰、マクロファージへのそれらの変換、およびマクロファージの増殖が機能的な表面に観察された。
このプロトコルを試みている間、できるだけ速く行われる脱ガス水または試薬を含むステップを実行し、酸素への暴露を最小限に抑えることが非常に重要です。当社の技術は、金属表面との細胞相互作用を選択的に調節し、RT-PCR、フローサイトメトリー、免疫蛍光などの典型的な細胞型同定アッセイは、この技術と互換性があります。この技術は、様々な生理活性ペプチドのために開発された場合、組織材料界面での生体適合性を高めるのに役立ちます。
