この手順の全体的な目標は、2D牽引力顕微鏡試験用のマイクロパターンヒドロゲルを製造することです。これは、最初にメタクリル化ガラスカバースリップを作り、その上にポリアクリルアミドヒドロゲルの第1層を形成することによって達成される。第2のステップは、牽引力顕微鏡用蛍光ビーズを含む別のヒドロゲル層を作成することです。
ヒドロゲルは、その上にマイクロパターンカバースリップで挟み込み、ヒドロゲル表面上のマイクロパターンマトリックスタンパク質の転写をもたらす。次に、ポリアクリルアミドヒドロゲルを室温で45分間重合する。上部カバースリップは慎重に取り外されます。
蛍光顕微鏡イメージングは、ビーズの存在とマイクロパターンの細胞外マトリックスタンパク質の正常な移動を示すために使用されます。この方法は、光を使用して、細胞の放出を使用して、効率的かつ正確にいくつかの牽引力を測定するのに役立ちます。同一試料からより多くの実験観察を得ることを可能にする。
だから、手順を実証することはジョエルクリスチャン、私の研究室の大学院生になります。ビーカーに10ミリリットルの二重蒸留水を加えます。その後、18.75ミリリットルの酢酸、3-プロピルメタクリレート18.75ミリリットル、エタノール252.5ミリリットルを溶液に加えます。
溶液が完成したら、結晶化皿に移します。24ミリメートルの丸いカバースリップを取り、精密なワイプでそれらをきれいにし、カスタムメイドのテフロンラックに入れます。その後、溶液に浸し、15分間インキュベートします。
ラックを取り、エタノールですすります。カバースリップを気流下で乾かします。メタクリレートカバースリップは、室温で1ヶ月まで保存することができます。
15ミリメートルの丸いカバースリップを取り、ペトリ皿に置きます。ダイヤモンドペンを使用して、カバースリップの上側に印を付けます。その後、酸素プラズマ処理を介して洗浄に進みます。
カバースリップは0.4ミリバールできれいで、200ワットで2分間きれいです。ポリL-リジン溶液のピペット100マイクロリットルをカバースリップの表面に、室温で30分間インキュベートします。その後、カバースリップを10ミリモルで8.5のpHで洗います。
余分な液体を取り出しますが、表面を濡らしてください。ピペット100マイクロリットルのmPEG-SVAのミリリットル当たり50ミリグラムのカバースリップの表面に10ミリモルpH 8.5溶液を、室温で1時間インキュベートします。その後、カバースリップを10ミリモルpH 8.5ですすります。
その後、PLPPゲルを2マイクロリットル加え、その後40マイクロリットルのエタノールを表面に加えます。ペトリ皿を軽く傾けて溶液を均質化します。溶液が偏光するまで5分待ちます。
35ミリメートルの底穴ペトリ皿の中にカバースリップを置きます。カバースリップを含むペトリ皿を顕微鏡のステージに置きます。ガラスの表面に焦点を合わせます。
描画済みパターンをロードしてロックします。1ミリメートルあたり30ミリジュールの紫外線量でパターニングを開始します。パターニングステップが完了したら、パターンカバースリップを取り出し、PBSで表面をすすきます。
サンプルを100マイクロリットルのフィブロネクチンあたり25マイクログラム、室温で1時間PBSに溶解したAlexa 488と共役した1ミリリットルフィブリノーゲンあたり25マイクログラムの混合物でインキュベートします。ヒドロゲル基板を準備するには、メタクリレートされたカバースリップをペトリ皿に入れることから始めます。開始するには、15ミリリットルのファルコンチューブに9.55ミリリットルの二重蒸留水を加えて、新鮮な酸化AgA溶液を調製します。
その後、AgAの0.5ミリリットルを追加します。その後、溶液に42ミリグラムのメタピルビン酸ナトリウムを加える。シェーカーに溶液を4時間セットします。
次に、表1に記載のアクリルアミド、ビスアクリルアミド、及び二重蒸留水を混合してストック液を調製する。ストックソリューションは摂氏4度で最長1年間保つことができます。99.3マイクロリットルのストック溶液を0.5マイクロリットルの過硫酸アンモニウム1%と0.2マイクロリットルのTEMEDと混合して、底層に対する作業溶液を調製します。
溶液から10マイクロリットルを取り、ピペットはメタクリレートカバースリップにドロップします。15ミリメートルの丸いカバースリップを液滴に慎重に置き、重合するまで45分待ちます。次に、上部カバースリップをメスで取り外します。
次に、93.3マイクロリットルのストック溶液を1マイクロリットル酸化HEA、5マイクロリットル蛍光ビーズ、0.5マイクロリットルの過硫酸アンモニウム1%および0.2マイクロリットルのTEMEDと混合して、最上層の作業溶液を調製します。溶液から5マイクロリットルを取り、ピペットは底層ヒドロゲルに滴下します。慎重に液滴にマイクロパターンカバースリップを置きます。
重合するまで45分待ちます。カバースリップをメスでそっと取り外します。そして、カスタムドリル6ウェルプレートの底にカバースリップを接着します。
井戸にPBSを追加します。細胞を見るために、6ウェルプレートからPBSを吸引する。線維芽細胞の場合, L-グルタミンを含む高グルコース DMEM を追加し、それを補う 10%FPS と 1%ペニシリンとストレプトマイシン.
摂氏37度と5%CO2で一晩細胞をインキュベートします。微視段階のCO2と暖房をオンにします。その後、顕微鏡をオンにし、ステージ上のウェルプレートを配置します。
照明パターンを設定し、対象のセルをマークします。ヒドロゲルの表面に再び焦点を合わせます。明視野チャネルのセルの画像を取得します。
変形状態のビーズの画像を撮るためには、チャンネルに切り替えます。その後、レーザーチャンネルに切り替え、3分間パターンに従ってセルを照らします。これは、1ミリメートルあたり6,000ミリジュールの用量に相当します。
その後、チャネルを切り替えて、未変形状態のビーズの画像を取得します。牽引力を計算するには、横ドリフトを補正した蛍光ビーズ画像を開きます。牽引力の完全な分析は、添付のスクリプトで詳述されています。
ヒドロゲル表面のマイクロパターン領域に対する細胞の選択的接着性を検証するために、サンプルを、事前標識されたマトリックスタンパク質を用いた蛍光顕微鏡法と、明視野顕微鏡で細胞を可視化して画像化した。ポリアクリルアミドヒドロゲルの機械的特性は、異なる量のアクリルアミドとビスアクリルアミドを混合することによって変化した。ヒドロゲルの剛性を原子間力顕微鏡によるナノインデンテーション実験で評価した。
トラクションフォース測定は、ポリアクリルアミドヒドロゲルのミクロンサイズの領域を選択的に照射するために、空間的、時間的に制御された、紫外線レーザービーム照明を適用した後に行った。トラクションフォースは、一般化されたクロス検証によって選択された正規化パラメータを使用して、正規化されたFTTCを使用して再構築されました。光とマイクロパターン細胞の使用放出と組み合わせた引力顕微鏡に基づくモデルモジュラーアプローチは汎用性が高く、他の顕微鏡およびイメージング設定でさらに利用され、その解像度と感度を向上させる可能性があります。
