Name: sample preparation for mass cytometry analysis
Uploaded: 2017-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
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Work in the Barton lab was supported by a grant from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). This research was supported in part, by a training grant fellowship for Ryan L. McCarthy from the National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. The core facility that maintains and runs the mass cytometry machine is supported by CPRIT grant (RP121010) and NIH core grant (CA016672).

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	<li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> J Vis Exp. , e4398 (2012).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+step+on+the+path+to+mass+cytometry+standardization.">Another step on the path to mass cytometry standardization.</a> Cytometry A. 87, 380-382 (2015).</li><li>Newell, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+tetramer+staining+and+mass+cytometry+analysis+facilitate+T-cell+epitope+mapping+and+characterization.">Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization.</a> Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).</li><li>Leong, M. L., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Peptide-MHC+Tetramer+Staining+with+Mass+Cytometry.">Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).</li><li>Zunder, E. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry.">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).</li><li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry.">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry A. 81, 467-475 (2012).</li><li>Krutzik, P. O., Nolan, G. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hypoxic+cells+using+an+organotellurium+tag+compatible+with+mass+cytometry.">Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Horowitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+environmental+determinants+of+human+NK+cell+diversity+revealed+by+mass+cytometry.">Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry.</a> Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).</li><li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+trajectory+detection+uncovers+progression+and+regulatory+coordination+in+human+B+cell+development.">Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development.</a> Cell. 157, 714-725 (2014).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).</li><li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+partial+permeabilization+with+saponin+enables+cellular+barcoding+prior+to+surface+marker+staining.">Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining.</a> Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).</li><li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83, 483-494 (2013).</li><li>Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algorithmic+Tools+for+Mining+High-Dimensional+Cytometry+Data.">Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data.</a> J Immunol. 195, 773-779 (2015).</li><li>Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+discovery+and+characterization+of+cell+subsets+in+high+dimensional+mass+cytometry+data.">Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data.</a> Methods. 82, 55-63 (2015).</li><li>Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Phenotypes+and+Signaling+Networks+of+Single+Human+Cells+by+Mass+Cytometry.">Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).</li><li>van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizaing+Data+using+t-SNE.">Visualizaing Data using t-SNE.</a> J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).</li><li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry:+Measure+for+measure.">Cytometry: Measure for measure.</a> Nature. 518, 439-443 (2015).</li><li>Gregori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+cytometry.">Hyperspectral cytometry.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).</li><li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brilliant+violet+fluorophores:+a+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments.">Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry A. 81, 456-466 (2012).</li><li>Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-FISH:+Analysis+of+cellular+RNA+expression+patterns+using+flow+cytometry.">X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).</li><li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells.">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここで提示されたプロトコルが正常に様々な培養細胞株（H1及びH9 hESCを、たmESC、MCF7、HEK 293、KBM5、HMEC、MCF10A）および原発組織サンプル（マウス骨髄、マウス胎児肝臓、マウス成体の処理のために使用されています肝臓、マウス腫瘍）。関わらず、ソースの、細胞の状態を維持しながら、単一の細胞に解離させることができる任意の組織は、質量サイトメトリーにより解析に従順であるべき?...

フローサイトメトリーは、細胞の大集団を横切る単一細胞レベルでの複数の標的抗体の同時測定を可能にします。従来の蛍光ベースのフローサイトメトリーでは、定量化可能なパラメータの数は、パラメータの数が増加するにつれてますます複雑補償計算を必要とする複数のフルオロフォアの発光スペクトルとの間のスペクトルの重なりによって制限されます。これらの制限は、重金属標識抗体が検出され、大幅に同時に収集するパラメータの数を拡張し、個々のセルのために高次元のタンパク質存在量プロファイルを生成するフライト（TOF）質量分析の時間によって定量化されているマスサイトメトリーによって対処されます。 器具サイトメトリー質量の仕組みの基本的な理解は、ユーザーにとって有益であり、トラブルシューティングのために不可欠であり得ます。より徹底したチューニングの説明とマスサイトメトリーのマシンを実行するために、関連の原稿1を参照してください。簡潔には、細胞試料は、細胞表面マーカー、細胞質タンパク質、核タンパク質、クロマチン結合タンパク質または目的の他のエピトープ（ 図1I）を標的と金属結合した抗体のパネルで標識されます。標識された細胞は、手動注射によって一度に一つまたはその96ウェルプレートからサンプルをオートサンプラーを使用してのいずれかで、機械にロードされています。ロードされた細胞は、細胞（ 図1II）を封入液滴のスプレーを生成する噴霧器を介して注入されます。細胞は、アルゴンプラズマトーチによってイオン化されるように、このスプレーは配置されています。このイオン化は、各セルを構成する全原子からなる粒子雲（ 図1iii）を生成します。この粒子雲が検出器に移動するように、低原子質量の原子は四重極質量フィルタによって高質量のイオンから分離されます。残りの高質量イオンは検出器、abundに進み各同位体のANCEは（ 図1iv）定量化されます。検出器によって収集された生データは、細胞イベントを識別するために、マスサイトメトリー機器ソフトウェアによって分析されます。識別された各セルのイベントのために、各チャネルで検出された信号を定量化して出力.fcsファイルに保存します。重金属結合した抗体を検出するための質量チャネルは1％以下、最も貢献して0から4パーセントの範囲で最小のスペクトルオーバーラップを示します。そのため、チャネル間のこの低クロストークのために、それは分析2の前に補償行列にデータを変換するために、一般的に不要です。しかし、注意は、この可能性があるため、高存在量のエピトープを有する抗体は、低存在量の抗体に割り当てられたチャネルに信号を寄与質量チャネルに割り当てられていないことを保証するために、抗体の実験パネルの設計時に注意すべきです信号寄与を受信チャンネルに人為的に高い人口を作成します。 <p cl尻=「jove_content」&gt;サイトメトリー分析、質量のためのサンプルの正確な製造は、収集されるサンプルの種類に大きく依存する、実験仮説が試験されます。私たちは、異なる種類の細胞（ヒト胚性幹細胞）および初代細胞（マウス乳腺腫瘍上皮細胞の単離）を採取するための2つのプロトコルの例を提供しています。質量サイトメトリーの研究を始めたとき、最初に利用されるすべてのプロトコルおよび抗体は、研究者の手の中にうまく機能していることを確認するために、小さなパイロット実験を実施することをお勧めします。カスタム結合した抗体を使用するようにしているとき、これは抗体結合時の部分還元反応として抗体の親和性を破壊する可能性があり、特に不可欠です。そのため、各カスタム抗体は、データの正確性を保証するために、実験的に検証する必要があります。アッセイに使用する細胞表面の抗体が固定した後、または、彼らはNE場合はそれらのエピトープを認識する場合、他の考慮事項が決定することを含みますedは、細胞を生きて適用されます。ペプチドMHC染色3,4で発生することが知られているように、いくつかの固定は、細胞表面抗体と適切な染色を防止することができます。生細胞上の細胞表面抗体染色を実行するいくつかの抗体のために必要であるが、これは抗体ベースのバーコード6、7は例外であるが、ほとんどのバーコード法は固定5の後に実行される抗体標識の前にバーコード化のオプションを排除することができます。 分析のために調製される細胞の数を決定するとき、マシンにロードされた細胞の画分のみが検出され、データを生成することを知ることが重要です。ネブライザーは、トーチでサンプルを噴霧するとき、この損失は、非効率性が主な要因です。正確なパーセント損失は50から85パーセントの範囲であることができる機械のセットアップおよび細胞型が、フローサイトメトリー質量に依存しなければなりません実験を設計する際に考慮しました。このプロトコルは、サンプルあたり2×10 6個の細胞のために最適化されているが、より小さいまたはより大きいサンプルサイズを処理するために適合させることができます。このプロトコルは、しかし、サンプルサイズが実験内一貫性が保たれることが重要であり、4×10 6、1×10 6からのサンプルサイズに対して最小の変更を加えて使用することができます。細胞数の変化は、バーコードおよび抗体染色の強度に影響を与えることができると直接比較されるべきサンプルを横切って概ね一貫性が保たれるべきです。 すべての実験デザインされていない場合、このような死んだ細胞標識およびDNA標識のようないくつかの手順は、、大多数で行われるべきです。唯一の表面マーカーを分析する実験における死細胞の標識はRh103を用いて達成することができるが、Rh103は、それは染色損失をもたらすよう透過が必要とされる実験のために避けるべきです。透過性を含む実験のために、シスプラチンを利用することをお勧めします<sクラスアップ=「外部参照」&gt; 8と、可能性、アポトーシスおよび死細胞を検出するために、切断されたPARPまたは切断されたカスパーゼを認識する抗体。 バーコードのサンプルは、サンプル間の変動性を、抗体の消費を減らす取得時間を減少させ、除去することができる9。バーコードのプロセスは、その起源のサンプルに各セルを割り当てるために使用されている全ての細胞に固有のサンプル固有のコードを適用することを含みます。サンプルをバーコード化した後、抗体染色、すべてのサンプルを均等に染色されることを保証する工程の前にプールされてもよいです。実験誤差を最小にするために、それはバーコードに慎重であり、互いに直接比較される任意の試料をプールします。現在（下記参照）、ここで提示されているそのうちの2つ質量サイトメトリー分析5、6、7、のためのバーコードサンプルのいくつかの方法が存在します。 現在入手可能なreagen付きTSは、38個の抗体の標的の存在量を定量S期10で細胞を同定、生細胞と死細胞8を区別し、複数のサンプルの多重化実験における低酸素11の細胞レベルを測定することが可能です。大きな細胞集団のための高パラメーター単一細胞データを収集するこの能力は、非常に不均一な細胞集団の改善されたプロファイリングを可能にし、既に新規な生物学的洞察12、13、14、15、16の数を生産しています。解釈情報に得られた複素データを蒸留すると、スパニングツリー密度正規化イベントの進行（SPADE）17とviSNE 18を含む計算アルゴリズムの使用を必要としています。 この記事では、アクセスを提供します設計・マスサイトメトリー実験を実施する方法の概要とマスサイトメトリーデータの基本的な分析を紹介します。

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 medium kit</td><td>Stem Cell technologies</td><td>05850</td><td>Warm at room temperature before use</td></tr><tr><td>DMEM F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td>Warm at 37&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell technologies</td><td>07920</td><td>Warm at 37&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Equitech</td><td>BAH62</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Cell ID Pt194</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cell ID Pt195</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cell ID Pt196</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-400-040-M250</td><td>Soluble to 25&amp;nbsp;mg/mL in DMSO</td></tr><tr><td>Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td></td></tr><tr><td>5-Iodo-2&#039;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7125</td><td>Soluble to 74&amp;nbsp;mg/mL in 0.2&amp;nbsp;N NaOH</td></tr><tr><td>Rhodium 103 intercelating agent</td><td>Fluidigm</td><td>201103A</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>BP1105-4</td><td>Chill at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>5 mL round bottom tubes</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 35 &amp;#956;m filter cap tubes</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>EQ four element calibration beads</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Type I-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpel #10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z69239</td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation for mass cytometry analysis

質量サイトメトリーは、重金属標識とコンジュゲートした抗体、大幅に良く従来の蛍光ベースのフローサイトメトリーを用いて可能であるものを超えて深い分析のためのパラメータと機会の数を増加させたアプローチを利用します。すべての新しい技術と同様に、高品質、信頼性の高いデータの生成を確保するための重要なステップがあります。ここに提示質量サイトメトリー分析のための細胞試料を処理するための複数の技術を組み込んで最適化されたプロトコルです。ここで説明する方法は、ユーザーが一般的な落とし穴を回避し、不正確なデータにつながる可能性の変動を、最小限に抑えることにより、一貫性のある結果を達成するのに役立ちます。実験計画を通知するために、プロトコルと調査されているシステムの生物学に新たな知見を暴くにおけるそれらの効果でオプションまたは代替の手順の理論的根拠が覆われています。最後に、代表的なデータは、技術のpresenteから予想される結果を説明するために提示されていますここでdは。

ここで提示されたプロトコルは、広くわずかな修正を加えて培養し、一次細胞サンプルの広範囲に適用することができます。このようなバーコード又は細胞表面染色などの特定の要素は、必要でない場合、実験の要件に応じて、それはモジュール方式で行うことができます。その全体で利用このプロトコルは、死細胞の排除、S期集団同定のために標識し、最大38個の?...

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Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

質量サイトメトリー分析のための試料調製

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.0K ビュー.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center. This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

ビデオ: Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

ミササイトメトリー：CyTOFマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

生物工学

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

発生生物学

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

人間頸管サンプルの採取、単離、およびフローサイトメトリー分析

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

医学

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming &#34;units&#34; known as BFU-e and CFU-e. Until recently, methods for the direct prospective and complete isolation of pure BFU-e and CFU-e progenitors from freshly isolated adult mouse bone marrow were not available. To address this gap, a single-cell RNA-seq (scRNAseq) dataset of mouse bone marrow was analyzed for the expression of genes coding for cell surface markers. This analysis was combined with cell fate assays, allowing the development of a novel flow cytometric approach that identifies and allows the isolation of complete and pure subsets of BFU-e and CFU-e progenitors in mouse bone marrow or spleen. This approach also identifies other progenitor subsets, including subsets enriched for basophil/mast cell and megakaryocytic potentials. The method consists of labeling fresh bone marrow or spleen cells with antibodies directed at Kit and CD55. Progenitors that express both these markers are then subdivided into five principal populations. Population 1 (P1 or CFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71med/high) contains all of the CFU-e progenitors and may be further subdivided into P1-low (CD71med CD150high) and P1-hi (CD71high CD150low), corresponding to early and late CFU-e, respectively; Population 2 (P2 or BFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71low CD150high) contains all of the BFU-e progenitors; Population P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150low CD41low) is enriched for basophil/mast cell progenitors; Population 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41+) is enriched for megakaryocytic progenitors; and Population 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41-) contains progenitors with erythroid, basophil/mast cell, and megakaryocytic potential (EBMP) and erythroid/ megakaryocytic/ basophil-biased multipotential progenitors (MPPs). This novel approach allows greater precision when analyzing erythroid and other hematopoietic progenitors and also allows for reference to transcriptome information for each flow cytometrically defined population.

Here, we describe a novel flow cytometric method for prospective isolation of early burst-forming unit erythroid (BFU-e) and colony-forming unit erythroid (CFU-e) progenitors directly from fresh mouse bone marrow and spleen. This protocol, developed based on single-cell transcriptomic data, is the first to isolate all the tissue's erythroid progenitors with high purity.

フローサイトメトリーによるマウス組織からのバースト形成ユニットおよびコロニー形成ユニット赤血球前駆細胞の同定と単離(英語)

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies in an attempt to understand the precise mechanisms that lead to the breakdown of self-tolerance and subsequent autoimmunity. Approaches thus far have been based on the study of one specific aspect of the immune system (a single or few cell types or cytokines), and do not offer a global assessment of complex autoimmune disease. While patient sera-based studies have afforded important insights into autoimmunity, they do not provide the specific cellular source of the dysregulated cytokines detected. A comprehensive single-cell approach to evaluate cytokine production in multiple immune cell subsets, within the context of &#34;intrinsic&#34; patient-specific plasma circulating factors, is described here. This approach enables monitoring of the patient-specific immune phenotype (surface markers) and function (cytokines), either in its native &#34;intrinsic pathogenic&#34; disease state, or in the presence of therapeutic agents (in vivo or ex vivo).

Here we describe a single-cell proteomic approach to evaluate immune phenotypic and functional (intracellular cytokine induction) alterations in peripheral whole blood samples, analyzed via mass cytometry.

イムノフェノ タイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

免疫・感染学

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

マウス細胞型における低インプット代謝研究

Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells

Cellular function critically depends on metabolism, and the function of the underlying metabolic networks can be studied by measuring small molecule intermediates. However, obtaining accurate and reliable measurements of cellular metabolism, particularly in rare cell types like hematopoietic stem cells, has traditionally required pooling cells from multiple animals. A protocol now enables researchers to measure metabolites in rare cell types using only one mouse per sample while generating multiple replicates for more abundant cell types. This reduces the number of animals that are required for a given project. The protocol presented here involves several key differences over traditional metabolomics protocols, such as using 5 g/L NaCl as a sheath fluid, sorting directly into acetonitrile, and utilizing targeted quantification with rigorous use of internal standards, allowing for more accurate and comprehensive measurements of cellular metabolism. Despite the time required for the isolation of single cells, fluorescent staining, and sorting, the protocol can preserve differences among cell types and drug treatments to a large extent.

著者スポットライト:希少造血幹細胞のメタボロミクス解析の進歩 

Here, we present a protocol to accurately and reliably measure metabolites in rare cell types. Technical improvements, including a modified sheath fluid for cell sorting and the generation of relevant blank samples, enable a comprehensive quantification of metabolites with an input of only 5000 cells per sample.

希少初代細胞のターゲットメタボロミクス

Cellular function critically depends on metabolism, and the function of the underlying metabolic networks can be studied by measuring small molecule ...

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and extremely large cell (40-60 &#181;m). As opposed to the fast-increasing knowledge in megakaryopoiesis at the cell biology and molecular level, the characterization of megakaryopoiesis by flow cytometry is limited to the identification of mature MKs using lineage-specific surface markers, while earlier MK differentiation stages remain unexplored. Here, we present an immunophenotyping strategy that allows the identification of successive MK differentiation stages, with increasing ploidy status, in human primary sources or in vitro cultures with a panel integrating MK specific and non-specific surface markers. Despite its size and fragility, MKs can be immunophenotyped using the above-mentioned panel and enriched by fluorescence-activated cell sorting under specific conditions of pressure and nozzle diameter. This approach facilitates multi-Omics studies, with the aim to better understand the complexity of megakaryopoiesis and platelet production in humans. A better characterization of megakaryopoiesis may pose fundamental in the diagnosis or prognosis of lineage-related pathologies and malignancy.

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Here, we present an immunophenotyping strategy for the characterization of megakaryocyte differentiation, and show how that strategy allows the sorting of megakaryocytes at different stages with a fluorescence-activated cell sorter. The methodology can be applied to human primary tissues, but also to megakaryocytes generated in culture in vitro.

質量サイトメトリー分析のための試料調製

要約

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ミササイトメトリー：CyTOFマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル

質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

人間頸管サンプルの採取、単離、およびフローサイトメトリー分析

フローサイトメトリーによるマウス組織からのバースト形成ユニットおよびコロニー形成ユニット赤血球前駆細胞の同定と単離(英語)

イムノフェノタイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

希少初代細胞のターゲットメタボロミクス

希少初代細胞のターゲットメタボロミクス

希少初代細胞のターゲットメタボロミクス

ヒトの一次源または造血前駆体からの分化インビトロからのヒトMKの免疫フェノタイピングと細胞選別

質量サイトメトリー分析のための試料調製

要約

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ミササイトメトリー：CyTOFマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル

質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

人間頸管サンプルの採取、単離、およびフローサイトメトリー分析

フローサイトメトリーによるマウス組織からのバースト形成ユニットおよびコロニー形成ユニット赤血球前駆細胞の同定と単離(英語)

イムノフェノ タイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

希少初代細胞のターゲットメタボロミクス

希少初代細胞のターゲットメタボロミクス

希少初代細胞のターゲットメタボロミクス

ヒトの一次源または造血前駆体からの分化 インビトロ からのヒトMKの免疫フェノタイピングと細胞選別

イムノフェノタイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析

ヒトの一次源または造血前駆体からの分化インビトロからのヒトMKの免疫フェノタイピングと細胞選別