Ministry of Science and Technology of Taiwan provided financial support of this research under contracts MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.

MNPを検出するために、1の方法注：このセクションでは、金ナノ粒子のハイブリダイゼーション媒介成長に基づいて、MNPを検出するための手順を説明します。 <ol><li>プローブDNA濃度100μMで（5&#39;-チオールGAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 &#39;）溶液を調製します。 </li><li>プローブDNA修飾されたAuNP（AuNPプローブ）粒子を準備します。21 注：ここで使用されるボリュームは、プローブDNA修飾されたAuNP（AuNPプローブ）粒子の要件に依存します。多数の実験を実施する上で、したがって依存しています。私たちは通常、スペアとして過剰AuNPプローブ粒子を準備します。このような工程で使用されるボリュームは調整可能で柔軟性のあります。 <ol><li>濃度1 OD / mlの金ナノ粒子の溶液にプローブDNA（ステップ1.1で調製した100μMの、）（13ナノメートル、17 nM）を追加します。 </li><li>ドデシル硫酸ナトリウムの最終濃度をもたらす（NAC 12 H 25 SO 4、SDS）、およびリン酸緩衝液（PBS）、0.01％および0.01 M、respectivelY。 </li><li> SDSを維持しながら、20分後、0.01％の塩化ナトリウム（2 M）及びPBS（0.01 M）の溶液を0.05 Mに塩化ナトリウム（NaCl）の濃度をもたらし、20分間インキュベートします。 </li><li> 1 M 20を超える分間隔の最終濃度になるように0.1 Mの単位でNaCl濃度を増加させます。 </li><li> 23℃でボルテックスミキサーで振とうしながら一晩インキュベートします。揺れの速度であればDNAサンプルとAuNPプローブは、ハイブリダイズになるような実験には影響を与えません。 </li><li> 30秒間7000×gで金ナノ粒子を遠心分離し、上清を除去します。 </li></ol></li><li> 25 nMの（AuNPプローブ溶液）の濃度で脱イオン水（DI水）にAuNPプローブ粒子を加えます。 </li><li>ターゲットDNA試料の準備（： &#39;; 3塩基対ミスマッチ：5&#39;-CTTGCCTAC TTT ACCAGCTC-3&#39;; 5&#39;-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3完全に相補的な6塩基対ミスマッチを：5&#39;-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 &#39;）の濃度でそれぞれ0.06、0.11、0.17、0.20、0.30、0.50μM、の。 </li><li> NaClでDNAサンプル（350μL）（14μM）にAuNPプローブ溶液（6μlを、25 nM）を追加します。 </li><li> DNAハイブリダイゼーションのために5分間23℃でボルテックスミキサーを用いてDNA試料およびAuNPプローブの混合物を振ります。 </li><li> AuNPの成長のために、溶液（DNAサンプルとAuNPプローブの混合物）にNH 2 OH（6μlを、400 mM）のとのHAuCl 4（6μL、25.4ミリモル）を追加します。 AuNPの成長が完了するのに約30秒かかります。着色の着実な変化が1時間以上を維持しています。 注意：のHAuCl 4との皮膚接触は深刻な毒性作用が生じる可能性があります。使用前に製品安全データシート（MSDS）を参照してください。手袋を着用し、のHAuCl 4を使用する場合にドラフトチャンバーを使用してください。 </li></ol>空気圧液滴操作プラットフォームの2製作注：P：PDMSベースの液滴操作プラットフォームは、二つの成分を含み、超疎水性表面と空気チャネル層（5 mm）の有するDMS膜（100ミクロン）。 MEMSプロセスなしに、一般的な機械加工プロセスは、製造のために、この微小流体コンポーネントの迅速なプロトタイピングのための金型、PDMS鋳造および複製を行うためのコンピュータ数値制御（CNC）マイクロマシニングを含むデバイス、およびレーザマイクロマシニングを作製するために利用されました超疎水性表面（ 図3参照）。 <ol><li>微細構造を有する（ 図3参照）、PMMAベースのマスター金型を製造するためにドリルビット（0.5ミリメートル）を装備したCNC工作機械を使用してください。ドリルビット7ミリメートル/秒の送り速度と回転26000回転の速度を使用してください。 PMMAのスクラップを削除するには、マスター金型の表面をきれいにするために送風機およびDI水を使用してください。 </li><li>比10にPDMSベースの混合物と硬化剤を準備する：1。 30分間、デシケータ内部、または全ての気泡が除去されるまで、混合物を脱気。 </li><li>目にPDMSを注ぎますEマスターモールドと空気室（PDMS膜）の逆ミクロ構造及び空気チャネル（PDMS層）を得たオーブン中で60℃で3時間、PDMSを焼きます。 </li><li> （手で）マスターモールドからPDMS層を取り外します。空気吸引インレット用のPDMS層の穴をパンチ。 </li><li>酸素 - プラズマ処理装置のチャンバー内にPDMS膜、PDMS層とガラス基板を置きます。酸素プラズマ処理した後、10分間ホットプレート（90℃）で一緒にPDMS膜、PDMS層とガラス基板を貼り。 </li><li>レーザー切断機（PDMS膜側を上）に、複合チップを入れてください。超疎水性領域（15ミリメートル×12ミリメートル）を定義するための.dwgファイルをインポートします。 図3を参照してください。直接PDMS膜（電力12 W、走査速度106.68ミリメートル/秒）の超疎水性の領域を作成するために、CO 2レーザマシンとPDMS膜を刻みます。 </li><li>洗浄するためにDI水で超疎水性表面を清掃してください表面上の離れた炭化残基。 </li><li>電磁弁を介して空気吸入口と真空ポンプを接続する（ 図4参照）。デジタルI / O USBモジュールとコンピュータと制御に電磁弁を接続します。 </li></ol>空気圧プラットフォーム上のMNPの検出のための3.操作注：このセクションでは、空気圧、液滴操作プラットフォーム上で比色し、急速にMNPを識別するための動作を説明する（ 図5を参照）。すべてのステップは、23℃（周囲温度）、相対湿度85％で起こります。 <ol><li>空気圧液滴操作プラットフォームの超疎水性領域にターゲットDNA試料液滴（10μL、0.5μM）を配置します。 </li><li>空気圧液滴操作プラットフォームの超疎水性領域にAuNPプローブ滴（10μL、25 nM）を配置します。 </li><li>電磁弁とSiとPDMS膜のたわみを生じさせる空気吸引を制御しますmpleプログラム（ 例えば、LabVIEWを）。液滴同士が衝突して合体するように、PDMS膜上（それぞれ標的DNAとAuNPプローブを含む）液滴の移動経路に沿って各空気室の空気の吸引を提供します。 -80キロパスカル（ゲージ圧）の真空ポンプの作動圧力を使用してください。 <ol><li>代わりに、手動限り、液滴が完全に混合されるように、エア吸引を制御します。手で、テストの初期段階で管を空気室の真空ポンプと入口を接続したり切断します。 </li></ol></li><li>電磁弁の制御システムを使用して、3分間混合効率を向上させるために前後合体小滴をロール空気吸引を制御します。標的DNAとAuNPプローブを十分に混合し、3分以内にハイブリダイズなります。それぞれ、駆動周波数と5 Hzから-80キロパスカル（ゲージ圧）の作動圧力を使用します。 </li><li> NH 2 OH（2μlを、400 mM）のとのHAuClを含む液滴を配置します空気圧液滴操作プラットフォームの超疎水性領域に4（2μL、25.4ミリモル）。 </li><li>液滴が互いに衝突し、合体させるために、エア吸引（-80キロパスカルゲージ圧）を制御します。順方向および逆方向合体小滴ロールを1分間混合効率を高めるためにできるように、空気吸引（5ヘルツと-80キロパスカルゲージ圧）を制御します。 </li><li>肉眼で合体した液滴の色を測定し、記録します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Chorley, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+verification+of+functional+single+nucleotide+polymorphisms+in+regulatory+genomic+regions:+current+and+developing+technologies.">Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies.</a> Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).</li><li>Hinds, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+patterns+of+common+DNA+variation+in+three+human+populations.">Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations.</a> Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).</li><li>Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+DNA+concentration+and+mismatches+using+hybridization-mediated+growth+of+gold+nanoparticle+probes.">Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes.</a> Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).</li><li>Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. 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S., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-driven+transports+on+superhydrophobic-patterned+surface+microfluidics.">Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics.</a> Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).</li><li>Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biocompatible+open-surface+droplet+manipulation+platform+for+detection+of+multi-nucleotide+polymorphism.">A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism.</a> Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).</li><li>Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+method+for+rationally+assembling+nanoparticles+into+macroscopic+materials.">A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials.</a> Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).</li><li>Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+motion+of+liquids+on+a+photo-responsive+surface.">Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface.</a> Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).</li><li>Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoretic+liquid+actuation+and+nanodroplet+formation.">Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation.</a> J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).</li><li>Lee, J., Kim, C. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-tension-driven+microactuation+based+on+continuous+electrowetting.">Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting.</a> J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).</li><li>Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibration-actuated+drop+motion+on+surfaces+for+batch+microfluidic+processes.">Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes.</a> Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).</li><li>Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+actuation+by+modulation+of+surface+stresses.">Microfluidic actuation by modulation of surface stresses.</a> Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

このプロトコルでは、MNPを検出するための単純な比色法は、マイクロ遠心管中で0.11から0.50μMの範囲の濃度で実施することができます。さらに、提案されたMNPの検出方法は、DNAのスクリーニングおよび他の生物医学的用途のための高い可能性を有する空気圧液滴操作プラットフォーム上で実施されます。実際には、サンプルのDNA濃度を検出可能な範囲は、オペレーティングプラットフォーム?...

DNA配列中の単一塩基対の差である一塩基多型（SNP）は、最も一般的な遺伝子変異の一つです。現在の研究では、SNPは、疾患のリスク、薬効及び遺伝子機能に影響を与えることにより、個人の副作用と関連していることを報告する。1,2最近の研究はまた、二または多点変異（多塩基多型）は、特定の疾患と個体を引き起こすことを明らかにしました病気の影響の違い。3,4塩基多型の検出は、疾患をプレスクリーニングで、したがって不可欠です。配列特異的オリゴヌクレオチドの迅速な検出のための簡単で効率的な方法が非常に過去20年間に開発された。DNAの突然変異を同定するために1,5の現在のアプローチは、典型的には6,7、 などのプローブ固定化、蛍光標識、ゲル電気泳動などの手順を含みますしかし、これらの方法は、一般的に長い分析プロセス、expenを必要としますSIVE機器、よく訓練された技術者、およびサンプルおよび試薬の大幅な消費。 体積に対する表面積の比率が大きいとユニークな物理化学的特性を持つナノ粒子は、特定のバイオマーカーのための高感度かつ安価な検出プラットフォームとして理想的な材料です。金ナノ粒子（AuNP）が広くオリゴヌクレオチドプローブを用いて変更されるので、それらの優れた能力のDNA検出のために使用される。8-10 SNP検出技法もAuNPを用いて開発された。11-13本研究において、我々は、検出するための新規な比色分析的アプローチを採用しましたAuNPプローブのDNAハイブリダイゼーションにより媒介される成長により多塩基多型（MNP）。14この単純かつ迅速なプロービング方法は、一本鎖DNA（ssDNA）または二本鎖DNA（dsDNA）の多様な長さとコンジュゲートという理論に基づいていますAuNP（ 図1参照 ）AuNPの成長の大きさと形状に影響を与える。15 DNAの検出のこの方法試薬の小さな消費、小さなアッセイ時間（数分）、および臨床診断と国内医療スクリーニングのための将来に向かって適用される熱制御することなく、簡単な手順を提供しています。 感度を向上させるために、DNAの検出限界および特異性を、それらのマイクロ流体システムは、16伝統的な実験プロトコルから進化した、大規模な設備の少ない部品を必要とし、実験プロトコルを単純化し、DNA配列を検出するためのいくつかのマイクロ流体システムが開発されていますバイオセンサー。マイクロ流体システム中のDNAの検出方法は、まだ異種のSNPを同定するための単一の読み出しのために、しかし、信号増幅及び蛍光リーダーのためのそのようなPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）のようなその後の処理の機器機械を必要とする。17,18を単純な開発します直接多塩基多型の結果を読み出すために、後続の処理を行わずプラットフォーム非常に望ましいです。よく使用される、従来、マイクロ流体システムを閉じに比べ、オープン表面マイクロ流体デバイスは有望でサンプル、直接的な環境アクセシビリティと全く容易に形成されていないキャビテーションまたは界面障害物に簡単にアクセスすることができ、このような明確な光路などのいくつかの利点を提供しますチャンネル。19私たちの前の仕事は持っている、このプラットフォーム、液滴が同時に運ばれ、吸引力を用いた駆動エネルギーから干渉されることなく操作することができる上に、オープン表面の液滴操作（ 図2参照）。20のための簡単な空気圧のプラットフォームを導入しました生物学的および化学的用途で大きな可能性。この空気圧プラットフォームは、このようAuNPプローブのDNAハイブリダイゼーションにより媒介される増殖の概念を用いて比色分析的アプローチと組み合わせてMNP検出用DNA試料の操作を実行するために利用されました。 本論文でプロトコルが説明します開放表面上の空気圧液滴操作プラットフォーム上でのマルチ塩基多型の単純な視覚的検出。この作品は、多塩基多型は、肉眼で検出可能であることを確認します。提案された空気圧式プラットフォームは、生物学的および化学的用途に適しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:245px;">PDMS</td>
			<td style="width:204px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD 184</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">benchtop engravers</td>
			<td style="width:204px;">&#160;Roland DG</td>
			<td style="width:119px;">EGX-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">laser cutting machine</td>
			<td style="width:204px;">Universal Laser Systems, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">VLS 3.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Oxygen plasma treatment system</td>
			<td style="width:204px;">Femto Science Inc. Korea</td>
			<td style="width:119px;">CUTE-MPR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">solenoid valve</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>home built</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">vacuum pump</td>
			<td>ULVAC KIKO, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">DA-30D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">13-nm AuNP solution</td>
			<td style="width:204px;">TAN Bead Inc., Taiwan</td>
			<td style="width:119px;">NG-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">DNA (with 5 -end labeled thiol)</td>
			<td style="width:204px;">MDBio, Inc., Taiwan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>UniRegion&#160;Bio-Tech,. Taiwan</td>
			<td>PBS001-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:204px;">J. T. baker</td>
			<td style="width:119px;">4095-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:245px;">Hydroxylamine solution (NH2OH)</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:245px;">Chloroauric acid (HAuCl4)</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">vortex mixer</td>
			<td style="width:204px;">Digisystem Laboratory Instruments Inc.</td>
			<td style="width:119px;">VM-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">centrifuge</td>
			<td style="width:204px;">Hermle Labortechnik GmbH.</td>
			<td style="width:119px;">Z 216 MK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the visual colorimetric detection of multi-nucleotide polymorphisms on a pneumatic droplet manipulation platform

多塩基多型（MNP）を検出するための簡単かつ視覚的方法は、開放面に空気圧液滴操作プラットフォーム上で行いました。比色DNA検出へのこのアプローチは、金ナノ粒子プローブ（AuNPプローブ）のハイブリダイゼーションを媒介成長に基づいていました。 AuNPの成長の大きさおよび構成は、プローブとハイブリダイズしたDNAサンプルの数によって支配されます。ナノ粒子の特定のサイズ - 及び形状に依存する光学特性に基づいて、プローブへの試料DNA断片におけるミスマッチの数を判別することが可能です。試験は、それぞれの試薬およびDNAサンプルを含む液滴を介して行われ、柔軟なPDMSベースの超疎水性膜の制御された空気圧式吸引搬送空気圧プラットフォーム上で混合しました。液滴が無い側effを持つ生体適合性の高い提案されている空気圧プラットフォーム上でオープン表面上で同時にかつ正確に配信することができます液滴内部のDNAサンプルの電気ショック療法。 2つの推奨方法を組み合わせ、多塩基多型は、空気圧、液滴操作プラットフォーム上で視覚で検出することができます。追加の機器が必要とされません。最終的な結果にプラットフォーム上での液滴をインストールからの手順は、既存の方法よりもはるかに少ない、5分未満を取ります。また、この複合MNP検出アプローチは、マクロシステムのものよりも著しく小さい各操作にのみ10μlのサンプル容量を必要とします。

この研究では、3つのDNAサンプルは、AuNPプローブのDNAハイブリダイゼーションにより媒介される増殖を介して、検出の簡単かつ新規な方法を用いて試験しました。プローブDNAと3種類のDNAサンプルの配列は、具体的には、cDNAは議定書のステップ1に記載されている、TMDNA（3塩基対ミスマッチDNA）、およびSixMDNA（6塩基対ミスマッチDNA）を（完全に相補的DNAをプローブしま...

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The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

この作品は、空気圧、液滴操作プラットフォーム上で多塩基多型を検出するためのシンプルで視覚的な方法を提示します。提案手法では、多塩基多型の液滴操作および検出を含む全体の実験は、高度な機器の助けを借りずに、23℃付近で行うことができます。

空気圧液滴操作プラットフォームのマルチ塩基多型の視覚比色検出

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

the-visual-colorimetric-detection-multi-nucleotide-polymorphisms-on

Research

JoVE Journal

Genetics

7.5K ビュー.  National Taiwan University. この作品は、空気圧、液滴操作プラットフォーム上で多塩基多型を検出するためのシンプルで視覚的な方法を提示します。提案手法では、多塩基多型の液滴操作および検出を含む全体の実験は、高度な機器の助けを借りずに、23℃付近で行うことができます。 

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

遺伝学

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける倍数性の操作

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Exploring the Effects of Spaceflight on Mouse Physiology using the Open Access NASA GeneLab Platform

Performing biological experiments in space requires special accommodations and procedures to ensure that these investigations are performed effectively and efficiently. Moreover, given the infrequency of these experiments it is imperative that their impacts be maximized. The rapid advancement of omics technologies offers an opportunity to dramatically increase the volume of data produced from precious spaceflight specimens. To capitalize on this, NASA has developed the GeneLab platform to provide unrestricted access to spaceflight omics data and encourage its widespread analysis. Rodents (both rats and mice) are common model organisms used by scientists to investigate space-related biological impacts. The enclosure that house rodents during spaceflight are called Rodent Habitats (formerly Animal Enclosure Modules), and are substantially different from standard vivarium cages in their dimensions, air flow, and access to water and food. In addition, due to environmental and atmospheric conditions on the International Space Station (ISS), animals are exposed to a higher CO2 concentration. We recently reported that mice in the Rodent Habitats experience large changes in their transcriptome irrespective of whether animals were on the ground or in space. Furthermore, these changes were consistent with a hypoxic response, potentially driven by higher CO2 concentrations. Here we describe how a typical rodent experiment is performed in space, how omics data from these experiments can be accessed through the GeneLab platform, and how to identify key factors in this data. Using this process, any individual can make critical discoveries that could change the design of future space missions and activities.

The NASA GeneLab platform provides unfettered access to precious omics data from biological spaceflight experiments. We describe how a typical mouse experiment is conducted in space and how data from such experiments can be accessed and analyzed.

オープン アクセス NASA GeneLab プラットフォームを使用してマウスの生理学上の宇宙飛行の効果を探る

Performing biological experiments in space requires special accommodations and procedures to ensure that these investigations are performed effectively ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

ショウジョウバエ視覚系における低豊富な細胞の浄化

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

空気圧液滴操作プラットフォームのマルチ塩基多型の視覚比色検出

要約

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ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

カエノラブディティス・エレガンスにおける倍数性の操作

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

ホットスポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタルポリメラーゼの連鎖反応

オープンアクセス NASA GeneLab プラットフォームを使用してマウスの生理学上の宇宙飛行の効果を探る

ショウジョウバエ視覚系における低豊富な細胞の浄化

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

空気圧液滴操作プラットフォームのマルチ塩基多型の視覚比色検出

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ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける倍数性の操作

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

オープン アクセス NASA GeneLab プラットフォームを使用してマウスの生理学上の宇宙飛行の効果を探る

ショウジョウバエ視覚系における低豊富な細胞の浄化

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

カエノラブディティス・エレガンスにおける倍数性の操作

ホットスポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタルポリメラーゼの連鎖反応

オープンアクセス NASA GeneLab プラットフォームを使用してマウスの生理学上の宇宙飛行の効果を探る