このプロトコルは、遺伝子編集された蚊集団におけるインデル突然変異の有病率および相対的量を決定することができるNHEJ分析のための高いスループットおよび信頼できる構成を提供する。次世代のサンガーシーケンシングと比較して、ddPCRは結果のターンアラウンドタイムが速く、遺伝子組み換え生物のフィールドに対する遺伝的変異の迅速かつ完全な分析を可能にします。この方法は、一般にすべての実験システムに適用できるべきである。
この手順のデモンストレーションは、ヤンの研究室のスタッフ研究員であるタイ・ファムです。まず、25マイクロリットルのデジタル液滴PCR、またはddPCRサンプルミックスを、テキストに記載された割合で、ddPCRスーパーミックス、フォワードおよびリバースプライマー、HEXまたはFAMプローブ、DNAおよび水を添加して調製します。その後、ボルテックスで反応を十分に混合します。
50マイクロリットルのマルチチャンネルピペットを使用して、20マイクロリットルのddPCRサンプルミックスをカートリッジの中央列に積み込みます。その後、200マイクロリットルのマルチチャンネルピペットを使用して、ピペット全体に気泡を発生させることなく、70マイクロリットルのオイルを下の列にロードします。ガスケットを置き、端だけを触れ、中心を避け、凹状の領域を取り付け、プレートを液滴発生器にしっかりと置き、カバーを閉じて実行を開始します。
カートリッジの上段から96ウェルプレートに浸漬ミックスを転送するには、マルチチャンネルピペットを使用し、40マイクロリットルの液体サンプルを30〜45度の角度で3〜5秒間滴下します。その後、45度の角度で3秒以上ゆっくりと井戸に混合物を排出し、横から落ちるようにし、ピペットの2番目の停留所に行って液体を完全に排出します。ホイルヒートシールを使用して、180°Cで5秒間プレートを密封します。
密封プレートをサーモサイクラーに入れ、最初の変性を摂氏95度に10分間設定して、NHEJのPCR条件をドロップオフガイドラインに設定します。その後、摂氏94度の40サイクルを変性させ、1分からアニールまで摂氏55度、2分間摂氏60度を延長します。40サイクル後、摂氏98度で10分間保持し、最後のホールドを摂氏4度に設定します。
すべてのステップに対して、毎秒 2°C のランプレートを使用します。アニール温度は、使用されるプローブまたはプライマーに応じて変化します。左上にA1を適切にラベル付けした液滴リーダーにプレートをしっかりと置きます。
プログラムを開き、FAMを既知の参照チャネルに指定してプレートをセットアップし、HEXを各ウェルの未知のチャンネルに設定します。次に、各サンプルの名前を変更します。テンプレートを保存しながら、直接定量として液滴読み取り実験を実行します。
ソフトウェア分析のための正しい実験パラメータ、すなわちサンプル情報、スーパーミックス、ターゲット名、ターゲットタイプ、シグナルチャンネル1とチャンネル2を指定します。次に、信頼性の高い結果を得るには、10,000 を超えるドロップレット数のしきい値を設定します。次に、ドロップレットタブの各ウェルの液滴数を確認し、すべてが10,000を超していることを確認します。
最後に、1D振幅をチェックして、ネガからの効率的な信号分離を行います。プレート エディタでプレート全体をハイライト表示し、実験タイプをドロップオフに設定します。WT ターゲットを参照として設定し、チャンネル 1 を FAM 用に、チャネル 2 を HEX 用に指定します。
NHEJ ターゲットを不明として設定し、FAM 用のチャネル 1 とチャネル 2 を none に指定します。[2D 振幅] タブで、各サンプルのグラフ ツールを使用してクラスターのしきい値を設定します。尾は通常、NHEJアッセイのWTクラスタに関連付けられます。
[比率]タブで、グラフの右上にある歯車アイコンをクリックし、分数の豊富さを選択して、NHEJイベントの割合に対応するポイントをプロットします。10個の蚊の15種類のプルサンプルにそれぞれ様々なNHEJ対立体が含まれ、落下アッセイを用いて分析および同定し、15個のサンプルすべてが100%インデル対立骨を運んだ。別の実験では、野生型蚊の11個のサンプルを引っ張り、NHEJパーセンテージが異なるNHEJ蚊をこのddPCRプロトコルで調べた。
結果は、同定された割合がアンプリコン分析技術によるインデル検出に比較的近いことを示した。ピペットは泡を避けるためにゆっくりと、そしてすべての乳化液滴が井戸の壁に滴下することを可能にする。
