私たちは、シャペロンアッセイの彼女の有益な助言のために博士クラウディアCremersに感謝します。ケン・ワンはHdeB精製における彼の技術支援のために認められています。この作品は、ドイツ研究財団（DFG）が提供するポスドク研究フェローシップでサポートされている（航空局へ）ハワード・ヒューズ医学研究所と航空局とUJJ-UDへの健康助成金RO1 GM102829の国立研究所によってサポートされていました。

ペリプラズムHdeBの1発現および精製注：HdeBはEに発現していました大腸菌細胞はプラスミドpTrc- hdeB 10、およびポリミキシン溶解時のペリプラズムから精製を保有。 <ol><li> E.の一晩培養物を準備します200 / mlのアンピシリン（LB アンプ）を含有する 30ミリリットルのLB中でプラスミドpTrc- hdeB 10を保有する 大腸菌細胞。 LB アンプ 4つの1リットル培養物を接種し、0.7のOD 600nmまでに達するまで37℃、200rpmでそれらを成長させます。そして、HdeBの発現を誘導し、30℃の成長温度を低下させるために300μMのIPTGを加えます。 </li><li> 30℃でのタンパク質の発現の5時間後、4℃で5分間、8,000×gでの遠心分離によって細胞を回収。 </li><li> 100で細胞ペレットを4℃で5分間、8,000×gで再び細胞を（50 mMトリス/塩酸、50mMのNaCl、pH7.5）で遠心バッファmlの洗浄。 </li><li>その後、再懸濁80で細胞ペレットは、ML 1mg / mlのポリミキシン硫酸塩を含む、緩衝液。外膜の効率的な破壊のために、穏やかに4°Cで1時間サスペンションをかき混ぜます。 </li><li>細胞質画分と細胞破片を除去し、4℃で15,000×gで20分間、懸濁液を遠心します。これは、可溶性HdeBを含む〜60ミリリットルの上清になります。 </li><li> 6 kDaのMWを持つ透析膜を用いて緩衝液B（20mMトリス/塩酸、0.5mMのEDTA、pH8.0）を150倍体積に対して一晩ペリプラズム抽出物を含む上清を透析カットオフ。 3キロダルトンの分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを使用して、15 mlのタンパク質を濃縮します。 0.2μmの細孔フィルターを使用して、タンパク質溶液をフィルタリングします。 </li><li> 2.5ml /分の流速で5カラム容量の緩衝液Bで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（カラム体積5ml）中にタンパク質を適用します。タンパク質をカラムにロードされると、10分のための緩衝液Bでカラムを洗浄します2.5ml /分の流速。 2.5ml /分6の流量で50分の期間にわたって緩衝液B中の0.5 M NaClの0からの直線勾配で溶出HdeB。 </li><li> 15％SDS-PAGEを使用してHdeBを含む画分を特定します。 5μlの5倍還元SDSローディング緩衝液と20μlのサンプルを混ぜます。負荷10μlのゲル上及びトリス - グリシン緩衝液（14.4グラム/ Lグリシン2.9グラム/ LのTris、を1g / Lのドデシル硫酸ナトリウム、pHが8.3）で実行します。ブロモフェノールバンドがゲル（〜45分）の底に近い移動するまで、150Vでゲルを実行します。 </li><li>プールのすべてのHdeB含有画分、4 L HdeB貯蔵緩衝液に対して4℃で一晩透析（50mMトリス/塩酸、200mMのNaCl、pH8.0）に、および分子量遠心分離フィルターユニットを用いて、約300μMにタンパク質を集中3キロダルトンのカットオフ。吸光係数εの280nmの = 15595 Mを使用して280nmでHdeBの濃度を決定-1 cm -1 で 。 100μlのアリコートとフラッシュフリーの準備液体窒素でアリコートをZE。 注：HdeBは、少なくとも6ヶ月間-70℃で保存することができます。 </li></ol> 2.シャペロン活性アッセイリンゴ酸脱水素をアンフォールディング熱の使用（MDH） 注：下記のように熱的に異なるpH値でのブタのミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素（MDH）のアンフォールディングの凝集で精製HdeBの影響をモニターしました。リストされたすべてのタンパク質濃度は、モノマー濃度を参照してください。 <ol><li> 、MDHを準備4 LバッファーC（50mMリン酸カリウム、50mMのNaCl、pH7.5）に対して4℃で一晩MDHを透析し、30の分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを用いて、約100μMにタンパク質を濃縮しますkDaの。 注：MDHは、硫酸アンモニウム溶液として提供されるようMDHの慎重な透析が必要となります。 </li><li>凝集物を除去するために、4℃、20,000×gで20分間、タンパク質を遠心します。 ε（280nmでの吸光度によってMDH濃度を決定します&lt;サブ&gt; 280ナノメートル= 7,950 M -1 cm -1で）。 50μlのMDHのアリコートとストレージ用フラッシュ凍結アリコートを準備します。 </li><li>温度制御サンプルホルダー、撹拌機を備えた蛍光分光光度計に1ミリリットルの石英キュベットを置きます。 350 nmのλEX /全角を設定します 。 </li><li>キュベットとセットに：（pHは2.0、pHは3.0、pHは4.0、およびpH 5.0ここ）は、所望のpH値で予め温めた（43℃）緩衝液D（150 mMリン酸カリウム、150mMのNaCl）の適切なボリュームを追加します。 43℃にキュベットホルダーの温度。総容量1000μlです。 </li><li> 0.5μMMDHを添加し、バッファ12.5μMHdeB（またはバッファ制御用HdeB記憶バッファの代わりに同量）を加えます。光散乱の監視を開始。 MDHの展開十分可能にするために360秒間の反応をインキュベートします。 </li><li> 2 MバッファなしのK 2 HPO 4の0.16から0.34容量を追加することによって、pHを7に上げ、再続けます別の440秒間光散乱をコーディング。 </li><li>中和後に定義された時点におけるシャペロンの非存在下で記録されたMDH凝集の程度を設定し、100％の（ここではMDHの最大光散乱が観察された500秒後）。各示されたpH値でHdeBの非存在下におけるMDHの光散乱信号にHdeBの活動を正常化します。 </li></ol>分析超遠心（AUC）によるHdeB-LDH複合体形成の3検出注：HdeB単独で又は熱的に乳酸脱水素酵素（LDH）の展開との複合体の沈降速度実験は、分析用超遠心を用いて行きました。 <ol><li> 4 LバッファーC（50mMリン酸カリウム、50mMのNaCl、pH7.5）に対して4℃で一晩LDHを透析、LDHを調製し、30の分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを用いて、約200μmでタンパク質を濃縮しますkDaの。 注：LDHの慎重な透析をLDとして必要とされていますHは、硫酸アンモニウム溶液として提供されます。 </li><li>骨材、4℃20,000×gで20分間遠心分離LDHを削除します。 280nmでの吸光度によってLDH濃度を測定（ε280nmで = 43680 M -1 cm -1 で ）。 50μlのLDHのアリコートとストレージ用フラッシュ凍結アリコートを準備します。 </li><li> 41℃で15分間（それぞれpHは4と7、）バッファーDで30μMHdeBの存在下および非存在下で3μMのLDHをインキュベートします。 注：その完全な凝集のより高い温度の結果でLDHのインキュベーション、およびHdeBの無シャペロン効果を観察することができます。 </li><li>サンプルは室温まで冷却してみましょう。次に、標準的なセクターを含む細胞への負荷サンプルを1.2センチ路長と2チャンネルのセンターピースを形。超遠心分離機に細胞をロードし、前の沈降に少なくとも1時間、22℃に平衡化。 </li><li> 22°Cと12時間それぞれのローター中で167,000×gでスピンサンプル、SEDを監視連続して280 nmでのタンパク質のimentation。以前に実証されているように、各チャネルの透過光強度はなく吸光度より測定した場合、信号対雑音比が改善されます。これはまた、後続のデータフィッティングの品質を向上させます。 </li><li>連続C（s）は分布モデル17を使用して、SEDFIT（バージョン15.01b、2015年12月）でのデータ分析を行います。 SEDFITを使用する方法を記述したチュートリアルでは、参照18で見つけることができます。 <ol><li> 0.7 ME（最大エントロピー）正則の信頼レベルを設定します。 </li></ol></li><li> SEDNTERP 19を使用して、バッファ密度だけでなく、粘度を計算します。凝集したクライアントタンパク質の量を推定するために、参照としてpH7にpHを4に沈降LDHの積分を比較します。 注：沈降分布プロットの統合はSEDFITで直接行うことができます。沈降速度データを分析するための代替ソフトウェアは、最近のレビュー20に記載されています。&lt;/李&gt; </ol> HdeBの存在下での4モニタリングMDH不活性化と再活性化注記：pHを展開MDHのリフォールディングで精製HdeBの影響を中和時MDH活性をモニターすることによって決定しました。 <ol><li> 25μMHdeBの存在下または非存在下で37℃で1時間：（pHは2.0、pHは3.0、pHは4.0、およびpH 5.0ここ）は、所望のpH値でバッファDで1μMMDHをインキュベートします。その後、10分間、20℃まで温度をシフトします。 注：MDHは37℃より高い温度でインキュベートしたときにMDHのリフォールディングをもHdeBの存在下では観察されませんでした。 </li><li>酸変性MDHのリフォールディングを開始するために、0.5 Mリン酸ナトリウム、pH8.0の0.13から0.42の体積の添加によってpH7に試料を中和します。 </li><li> 20℃で2時間インキュベートした後、340nmの9におけるNADHの減少をモニターすることによってMDH活性を決定します。 注：MDHはL-リンゴにオキサロ酢酸のNADH依存性還元を触媒します。 <oL&gt; <li>アッセイ緩​​衝液950μL（50 mMリン酸ナトリウム、pH 8.0、1mMのオキサロ酢酸、および150μMNADH）とのインキュベーション反応液50μlを混合します。 注：アッセイ緩​​衝液中MDHの最終濃度は44 nMであるべきです。 </li><li> 20℃に設定し、ペルチェ温度制御ブロックを備えた分光光度計を用いて吸光度の変化を監視します。 </li><li> pHを7.0に維持してきた44 nMのネイティブMDHにMDH活性の相対を報告します。 </li></ol></li></ol> E.上HdeB過剰発現の5効果酸ストレス下での大腸菌の生存注：E.大腸菌 MG1655のゲノムDNAは、公表されたプロトコル21を用いて単離しました。 <ol><li> E.からhdeBを増幅プライマーhdeBを用いたPCRによるコリ MG1655 - のBamH I-REV GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATTとhdeB - のEcoR I-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C. </li><li>次のように50μl中のPCR反応を設定します：10μlの5×ポリメラーゼバッファー、ゲノムDNA MG1655、0.5μlのDNAポリメラーゼngを、200μMのdNTP、0.5μMのプライマーJUD2、0.5μMプライマーJUD5、150は、50μlにのddH 2 Oを追加します。 </li><li>ステップ1：以下のようhdeBの増幅を行い、95℃、1サイクルで5分。ステップ2：95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃、40サイクルで30秒間。ステップ3：72℃で10分間。 </li><li>制限部位のクローニングのための標準的な方法を用いてプラスミドpBAD18のをEcoR IとのBamH I部位にPCR断片を得られたクローン。製造業者の説明書に従って、プラスミド精製キットを用いてプラスミドを精製します。シークエンス10によって得られたプラスミドを確認します。 </li><li> 、λ - - 、E14 - 、[araD139] B / R [F：株BB7224（ΔrpoH）（遺伝子型にHdeBまたは空ベクター対照pBAD18を発現するプラスミドをトランスフォーム6;（ARGF-LAC）169 flhD5301Δ（fruK-yeiR）725（fruA25）relA1 rpsL150（SM R）rbsR22Δ（fimB-FIME）632（:: IS1）ptsF25 zhf :: Tnの10（TC S）suhX401 deoC1 araDを + rpoH ::館 +; 16）化学的コンピテント細胞を用いました。 注：この株は温度感受性です。 </li><li> 45秒42℃で熱ショック前めっきした後、30℃、200 rpmで細胞を培養します。陽性クローンの単一コロニーストリークアウトを実行し、30℃で一晩インキュベートします。 50ミリリットルのLB アンプで一晩培養を準備し、200rpmで、30℃で細胞を培養。 </li><li>一晩培養物を25 mlのLB アンプに40倍に希釈し、HdeBタンパク質発現を誘導するために30℃、ODを600nmで 200 RPM = 1.0で0.5％アラビノース（ARA）の存在下で細菌を増殖します。 </li><li> pHシフトの実験のために、LBを使用アンプ+アラ0.5のOD 600nmまでに細胞を希釈し、（ここではpHは2.0、pHが3.0、およびpH 4.0）それぞれのpH値に調整して5 M HClを適切なボリュームを追加することによって。 </li><li>示された時点（; pHは3、2.5分; pHは2、1分pHは4、30分）した後、5 M NaOHを適切な容量の添加により培養液を中和します。 </li><li> OD測定値を用いて30℃で12時間培養液中の中和培養物の増殖を監視します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

<html>活性化およびHdeBのシャペロン機能のメカニズムを研究するために、HdeB大量に発現させ、精製しなければなりません。発現ベクター系の数は、この研究で使用した両方ともたpTrcかのpBADベクターを含む、標的タンパク質の高レベルの産生のために利用可能です。プロモーターはE.のために容易にアクセス可能ですコリ RNAポリメラーゼ、したがって、任意のEにHdeBの強い?...

微生物病原体は、酸誘発タンパク質アンフォールディング状態を経験する一般的な自然環境は、その酸性pH食品媒介病原体1に対する有効な障壁として機能する哺乳動物の胃（pH範囲1-4）、です。アミノ酸側鎖のプロトン化に起因するタンパク質のアンフォールディング及び凝集は、生物学的プロセス、損傷細胞構造に影響を与え、最終的に細胞死1,2を引き起こします。細菌のペリプラズムのpHは多孔性の外膜を通過するプロトンの自由拡散にほぼ瞬時に環境pHと平衡するので、グラム陰性細菌のペリプラズムと内側の膜タンパク質は、酸ストレス条件3の下で最も脆弱な細胞成分です。急速な酸の仲介による損傷に対する彼らのペリプラズムプロテオームを保護するために、グラム陰性菌は、酸活性化ペリプラズムシャペロンHdeAとHdeBを利用します。 HdeAは条件付きで無秩序シャペロンであります<sup&gt; 4,5：中性pHでは、HdeAは折り畳まれ、シャペロン不活性な二量体として存在します。 pHが3以下のpHシフトの際に、HdeAのシャペロン機能は、6,7を速やかに活性化されます。 HdeAの活性化は、その単量体への解離、およびモノマー6-8の展開部分を含む深刻な構造変化を、必要とします。一旦活性化されると、HdeAは酸性条件下で展開するタンパク質に特異的に結合します。これは、効果的に低pHでのインキュベーションの間だけでなく、pHを中和時に両方の彼らの凝集を防ぐことができます。 pHを7.0に復帰する、HdeAはATP非依存的にそのクライアントタンパク質のリフォールディングを促進し、その二量体、シャペロン不活性なコンフォメーション9に戻って変換されます。同様に、相同的シャペロンHdeBもシャペロン不活性をpH7.0です。 HdeAとは異なり、HdeBのシャペロン活性は、pH4.0のHdeBが依然として大きく折り畳ま10ダイマーされる条件を、その見かけの最大値に達します。また、さらにpHがコーを下げますHdeBの不活化エス。これらの結果は、それらの広範な相同性にもかかわらず、HdeAとHdeBが彼らの保護シャペロン機能を有する広いpH範囲をカバーすることを可能にする機能的活性化のそれらのモードで異なることを示唆しています。 E.の耐酸性に関与している一つの他のシャペロン大腸菌は中立状態が復元されるまで、折り畳まれていないクライアントタンパク質を安定化させるために表示される、細胞質Hsp31です。 Hsp31の正確な作用モードは、しかし、12謎のままです。このようなサルモネラなどの他の腸内細菌がhdeABオペロンを欠いていることを考えると、他のまだ正体不明のペリプラズムのシャペロンはこれらの細菌11の耐酸性に関与していることが存在するかもしれない可能性が非常に高いです。 ここに提示プロトコルは、 インビトロおよびインビボ10 HdeBのpH依存シャペロン活性を監視することを可能にし、他のシャペロンを調査するために適用することができますHsp31など。あるいは、hdeABの発現を制御する転写因子の複雑なネットワークは、潜在的に、インビボでの応力アッセイにより調べることができます。 インビボでのタンパク質のシャペロン機能を特徴づけるために、異なる実験のセットアップを適用することができます。一つの経路は、タンパク質アンフォールディングストレス条件を適用して表現型のいずれかは、対象の遺伝子を過剰発現または遺伝子の欠失を担持する変異株を特徴付けることです。プロテオミクス研究はシャペロンが存在する場合、ストレス条件下で凝集体はもはやそのタンパク質を同定しないように実施することができる、または特定の酵素に対するシャペロンの影響は、酵素アッセイ14〜16を用いてストレス状態の間に決定することができます。本研究では、すべての主要なEの発現を制御するRpoH熱ショックシグマ因子32を欠いているrpoH欠失株でHdeBを過剰発現することを選びました大腸菌のシャペロンとその削除はSENSを増加することが知られています15のタンパク質のアンフォールディングを引き起こす環境ストレス条件にitivity。 HdeBのインビボシャペロン活性をΔrpoH株のpH感受性を抑制する能力をモニターすることによって決定しました。要するに、ここで紹介するプロトコルは、in vitroならびに in vivoでのコンテキストで酸活性化シャペロンの活性を特徴づけるための迅速かつ簡単な方法を提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2190">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NEB10-beta E. coli cells</td>
			<td style="width:64px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">C3019I</td>
			<td style="width:1791px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LB Broth mix, Lennox</td>
			<td style="width:64px;">LAB Express</td>
			<td style="width:119px;">3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IPTG</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:64px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0826-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Polymyxin B sulfate&#160;</td>
			<td style="width:64px;">ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.2 UM pore sterile Syringe Filter</td>
			<td style="width:64px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td>
			<td style="width:64px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-1153-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mini-Protean TGX, 15%</td>
			<td style="width:64px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Malate dehydrogenase (MDH)</td>
			<td style="width:64px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10127914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Potassium phosphate (Monobasic)</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Potassium phosphate (Dibasic)</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">F-4500 fluorescence spectrophotometer</td>
			<td style="width:64px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">FL25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxaloacetate</td>
			<td style="width:64px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">O4126-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NADH</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">N8129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S9390-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S397-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactate dehydrogenase (LDH)</td>
			<td style="width:64px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392764</td>
			<td>https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&#38;_windowLabel=UCM_RENDERER&#38;_urlType=render&#38;wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">306493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">363782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wizard Plus Miniprep Kit</td>
			<td style="width:64px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1470</td>
			<td>used for plasmid purification (Protocol 5.1)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">L-arabinose</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-300-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:64px;">DOT Scientific Inc</td>
			<td style="width:119px;">DSG36050-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence Cell cuvette</td>
			<td style="width:64px;">Hellma Analytics</td>
			<td style="width:119px;">119004F-10-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:64px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">dNTP set</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Centrifuge Avanti J-26XPI</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">393127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Varian Cary 50 spectrophotometer</td>
			<td style="width:64px;">Agilent Tech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa</td>
			<td style="width:64px;">Spectrum Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">132650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">bp166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Veriti 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of the ph-dependent activity of escherichia coli chaperone hdeb in vitro and in vivo

細菌は、しばしば、このようなpHの変化、温度、酸化還元状態、露光又は機械力などの環境の変化にさらされています。これらの条件の多くは、細胞内のタンパク質のアンフォールディングを引き起こし、生物の生存に有害な影響を与えます。無関係な、ストレス特異的分子シャペロンのグループは、これらのストレス条件の生存に不可欠な役割を果たすことが示されています。完全に折り畳まれてシャペロン非アクティブなストレスの前にしながら、これらのタンパク質は急速に展開し、特定のストレス条件下でシャペロン活性になります。一度これらの条件付きで無秩序シャペロンは異なる凝集しやすい多数のタンパク質に結合し、活性化し、その凝集を防止し、直接または間接的に非ストレス状態への復帰時にリフォールディングタンパク質を容易にします。それらの活性化とクライアントの認識のメカニズムについてのより詳細な理解を得るための第一のアプローチは、精製およびsubsequenを伴いますインビトロシャペロンアッセイを使用して、これらのタンパク質のTの特徴付け。 生体内ストレスアッセイにおけるフォローアップ独立インビトロの結果で得られたことを確認することが不可欠です。 このプロトコルは、Eのシャペロン活性を特徴づけるために、in vitroおよびin vivoの方法で説明し大腸菌 HdeB、酸活性化シャペロン。光散乱測定は、インビトロで 、確立されたモデルのクライアントタンパク質、MDHの酸誘発性の凝集を防止するHdeBの能力のための便利な読み出しとして使用しました。分析超遠心分離実験は、非ストレス状態への復帰時のクライアントタンパク質の運命に光を当てるために、HdeBとそのクライアントタンパク質のLDHとの間の複合体形成を明らかにするために適用しました。クライアントタンパク質の酵素活性アッセイは、pHによって誘発されるクライアントの不活性化および再活性化にHdeBの効果をモニターするために行きました。最後に、生存研究はmonitoするために使用されましたin vivoでの HdeBのシャペロン機能の影響をrを。

HdeAとHdeBは、E相同であります酸ストレス条件10に対してペリプラズムタンパク質を保護することが知られている大腸菌タンパク質。私たちの仕事は、HdeAと同様に、HdeBはまた、分子シャペロンを活性化酸として機能することを明らかにしました。しかし、まだ潜在的に殺菌が、HdeA 6,9,10,22の最適pHよりも有意に高いpHでHdeA、HdeB機能とは対?...

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Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

この研究は、酸性pH条件下で大腸菌 HdeBのシャペロン活性を特徴づけるために、生物物理学的生化学的および分子技術を説明しています。これらのメソッドは、成功し、このようなHdeAなどの他の酸保護シャペロンに適用されており、他のシャペロンとストレス条件のために働くように修正することができます。

のpH依存性活性の検出<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;シャペロンHdeB<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

detection-ph-dependent-activity-escherichia-coli-chaperone-hdeb-vitro

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

10.3K ビュー.  University of Michigan. この研究は、酸性pH条件下で大腸菌 HdeBのシャペロン活性を特徴づけるために、生物物理学的生化学的および分子技術を説明しています。これらのメソッドは、成功し、このようなHdeAなどの他の酸保護シャペロンに適用されており、他のシャペロンとストレス条件のために働くように修正することができます。 

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;：デザイン、生産および精製

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

生化学

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

豊かさと充電転送エシェリヒア属大腸菌の Rna のレベルの定量化

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against human leukocyte antigens (HLA). Histocompatibility guidelines are based on laboratory tests of anti-HLA immunity, which presents either as pre-existing or de novo generated HLA antibodies that constitute a major transplantation barrier. Current tests are built on a single-antigen beads (SAB) platform using a fixed set of ~100 preselected recombinant HLA antigens to probe transplant sera. However, in humans there exist a far greater variety of HLA types, with no two individuals other than identical twins who can share the same combination of HLA sequences. While advanced technologies for HLA typing and direct sequencing can precisely capture any mismatches in DNA sequence between a donor's and recipient's HLA, the SAB assay, due to its limited variety in sequence representation, is unable to precisely detect alloantibodies specifically against the donor HLA mismatches. We sought to develop a complementary method using a different technology to detect and characterize anti-donor HLA antibodies on a personalized basis. The screening tool is a custom peptide array of donor HLA-derived sequences for probing post-transplant sera of the organ recipient to assess the risk for antibody-mediated rejection. On a single array for one donor-recipient pair, up to 600 unique peptides are made based on the donor's HLA protein sequences, each peptide carrying at least one mismatched residue in a 15-amino acid sequence. In our pilot experiments to compare antigen patterns for pre- and post-transplant sera on these arrays, we were able to detect anti-HLA signals with the resolution that also allowed us to pinpoint the immune epitopes involved. These personalized antigen arrays allow high-resolution detection of donor-specific HLA epitopes in organ transplantation.

Mismatches in human leukocyte antigen (HLA) sequences between organ donor and recipient pairs are the major cause of antibody-mediated rejection in organ transplantation. Here we present the use of custom antigen arrays that are based on individual donors' HLA sequences to probe anti-donor HLA alloantibodies in organ recipients.

臓器移植における HLA 同種抗体の検出のためのペプチド配列をお好み

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

SDS ページを用いたリン酸 binding タグ LRRK2 活動によって Rab10 リン酸化検出

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による Hsp33 の構造変化をマッピング

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

TRNA イソペンテニル トランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom body (MB) is a higher brain center proposed to be the neural substrate of complex honeybee behaviors. Although previous studies identified genes and proteins that are differentially expressed in the MBs and other brain regions, the activities of the proteins in each region are not yet fully understood. To reveal the functions of these proteins in the brain, pharmacologic analysis is a feasible approach, but it is first necessary to confirm that pharmacologic manipulations indeed alter the protein activity in these brain regions.
We previously identified a higher expression of genes encoding phospholipase C (PLC) in the MBs than in other brain regions, and pharmacologically assessed the involvement of PLC in honeybee behavior. In that study, we biochemically tested two pharmacologic agents and confirmed that they decreased PLC activity in the MBs and other brain regions. Here, we present a detailed description of how to detect PLC activity in honeybee brain homogenate. In this assay system, homogenates derived from different brain regions are reacted with a synthetic fluorogenic substrate, and fluorescence resulting from PLC activity is quantified and compared between brain regions. We also describe our evaluation of the inhibitory effects of certain drugs on PLC activity using the same system. Although this system is likely affected by other endogenous fluorescence compounds and/or the absorbance of the assay components and tissues, the measurement of PLC activity using this system is safer and easier than that using the traditional assay, which requires radiolabeled substrates. The simple procedure and manipulations allow us to examine PLC activity in the brains and other tissues of honeybees involved in different social tasks.

To test the inhibitory effects of pharmacologic agents on phospholipase C (PLC) in different regions of the honeybee brain, we present a biochemical assay to measure PLC activity in those regions. This assay could be useful for comparing PLC activity among tissues, as well as among bees exhibiting different behaviors.

ミツバチから脳ホモジネート ホスホリパーゼ C 活性の検出

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

培養色素脱失活動の定量化

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

エシェリヒア属大腸菌のウイロイド派生システムを使用して円形の足場に組換え Rna の大量生産

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

サイト指示された突然変異誘発のため生体外でそしてエシェリヒア属大腸菌の RNA 相互作用に代表される生体実験

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...