私たちのプロトコルは、プルダウンアッセイ、分析サイズ排除クロマトグラフィー、分析超遠心分離、ヒストンシャペロニングアッセイなどの技術を使用して、タンパク質がヒストンシャペロンであるかどうかを確認する方法を示しています。ここで取り上げる手法は、タンデムを使用する場合、推定シャペロンを特徴付けるために直接適用できます。彼は構造生物学のテクニックと一緒に行くことができます。
この技術はクロマチン研究の分野に適用できます。ただし、個々の方法は、必要に応じて、目的の他のタンパク質に適用できます。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるスラジット・ガンジー氏で、複雑なプルダウンアッセイを行います。
博士課程の学生であるアルカナ・サマル氏と分析用超遠心分離実験用のRuchir C.Bobde氏、博士課程の学生であるSomanath Baral氏、プラスミドスーパーコイリングアッセイ用のKetul Saharan氏とともに まず、300マイクロリットルの平衡化バッファー中で、5マイクロモルのヒストンシャペロンと20マイクロモルのH2A/H2Bダイマーを混合します。ヒストンシャペロンH2A/H2B複合体を遠心分離して沈殿物を除去します。
平衡化バッファーで事前に平衡化したスピンカラムにサンプルをロードします。100カラム容量または4ミリリットルの洗浄バッファーでカラムを洗浄し、余分なH2A/H2B二量体を除去します。次に、ヒストンシャペロンH2A/H2B複合体を20〜60マイクロモルのH3/H4四量体と混合します。
100カラム容量または4ミリリットルの洗浄バッファーでカラムを再洗浄して、結合していないH3/H4四量体を除去してから、溶出バッファーでサンプルを溶出します。溶出したサンプルを18%SDS-PAGEにかけます。次に、クマシーブリリアントブルーR250で染色し、ゲルを視覚化します。
ヒストンシャペロン中のH2A/H2B二量体、H3/H4四量体を透析バッファーで個別に精製するには、分析サイズ排除クロマトグラフィーを使用します。ランのバッファーを保存して、後でさらに希釈を準備し、AUC セルで参照として使用します。AUCサンプルの場合、精製したシャペロンを別々のチューブで二量体または四量体と混合し、保存した透析バッファーを使用して最終容量450マイクロリットルにし、OD280が0.3〜0.6になります。
ダブルセクターのセンターピースと、吸光度検出器を備えた分析用超遠心分離機を備えた石英窓でセルを組み立てます。400マイクロリットルのサンプル溶液と420マイクロリットルの透析バッファーを、それぞれセルの参照セクターとサンプルセクターに充填します。セルの重量を量り、正確にバランスを取り、4穴のチタンローターにロードします。
セルとローターの下部にあるマークを使用してセルを整列させます。ローターを遠心分離機にロードし、蓋を閉めて運転を開始すると、真空が発生し、温度が安定します。データ解析のために、プログラムSEDNTERPを使用して、タンパク質のアミノ酸組成に基づいて、タンパク質バッファー成分および部分比容積の密度および粘度を計算する。
AUC マシンからプログラム SEDFIT にデータをロードします。メニスカス、赤の線、セルの下部、青い線、およびデータ分析境界の緑の線を定義します。モデルとして連続 CS 配布を選択します。
パラメーター セクションで、最大解像度を 100 に設定します。次に、沈降係数の最小値をゼロに設定し、最大値を10〜15に設定します。最初に摩擦比を1.2に設定し、データから摩擦比を導き出すために浮動小数点を選択します。
1シグマ正則化のF比を0.68に設定します。部分比容積、バッファー密度、および粘度をSEDNTURPから取得するように設定します。[実行]を押して、ソフトウェアがラム方程式を解くようにします。
[フィット] を押して絞り込みます。メインツールバーの表示機能でCSにピークMwを表示を選択して、分子量を推定します。2マイクロモルのH3/H4四量体と4マイクロモルのH2A/H2B二量体を、1マイクロモルから6マイクロモルの範囲のヒストンシャペロンの濃度を上げて、アセンブリバッファー中で最終容量50マイクロリットルまで混合します。
混合物を摂氏4度で30分間インキュベートします。同時に、500ナノグラムの負のスーパーコイルPUC-19プラスミドを、アセンブリバッファー中の1マイクログラムのトポイソメラーゼI酵素で50マイクロリットルの最終容量で前処理します。次に、四量体、二量体、およびヒストンシャペロンを含む予備混合溶液を、弛緩した血漿DNAと組み合わせます。
100マイクロリットルの2Xストップバッファーを加えてインキュベートし、プラスミドDNAを除タンパクしてアセンブリ反応を終了します。反応混合物を含むチューブに等量のトリス飽和フェノールを加え、反応混合物の内容物をよく混合する。その後、試料を遠心分離する。
プラスミドDNAを含む上水相をマイクロピペットで穏やかに回収し、等量のクロロホルムを混合します。混合物を渦巻きます。次に、上部水相を収集し、pH 5.5の1/10容量の3モル酢酸ナトリウム、および2.5容量の氷冷エタノールを加える。
チューブを3〜4回反転させて、溶液をよく混ぜます。サンプルを16, 200 Gで10分間遠心分離し、上清を静かに捨てます。微量のエタノールが蒸発するまでチューブを開いたままにし、沈殿したプラスミドDNAをチューブ内に残します。
SECの分析結果から、シロイヌナズナタンパク質FKBP53の組換えN末端ヌクレオプラスミンドメインは、溶液中で65キロダルトンの五量体であることが明らかになりました。熱処理を施したヌクレオプラスミン試料は、ドメインが非常に熱安定性であることを示した。ヌクレオプラスミンドメインは、塩化ナトリウム2モルまでの塩安定性と最大4モルの尿素安定性を示しました。
プルダウンアッセイにより、ヌクレオプラスミンドメインとH2A/H2Bダイマーとの相互作用は0.4モル塩化ナトリウムまで安定しているのに対し、H3/H4との会合は0.7モルまで安定であることが明らかになりました。シャペロンは、シャペロンに付加される順序に関係なく、H2A/H2B二量体とH3/H4四量体を同時に結合し、オリゴマーの別々の相互作用部位を示します。AUC-SVによる推定分子量は、ヒストンオリゴマーによるヌクレオプラスミンドメインの1:1の化学量論を明らかにしました。
プラスミドスーパーコイリングアッセイでは、組換え植物ヒストンシャペロンAtNRP1およびAtNRP2がスーパーコイルプラスミドの量を増加させ、ヒストンをDNA上に沈着させてヌクレオソームを形成し、DNAスーパーコイリングを引き起こす可能性があることを示唆しました。プラスミドスーパーコイリングアッセイには、ヒストンDNAとシャペロンの特性評価のために特別な注意と可能な最適化が必要です。異性体特性評価テレメトリは、結合安定性を確認するための分析サイズ排除実験のフォローアップとして使用できます。
