We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).

注：このプロトコルでは、記載の試薬およびボリュームがテストされるシロイヌナズナラインごとに表現され、その遺伝子型について6複製ウェルになります。複数の行を分析する場合、分析される行数を有する材料を掛けます。ビデオでは、野生型シロイヌナズナは、（追加の行からの代表的な結果が続いて提供されますが）概日時計突然変異体のラインZTLと比較されます。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 酵素液 </td><td></td></tr><tr><td>セルラーゼ</td><td> 0.5％（w / v）の</td></tr><tr><td>ペクチナーゼR10 </td><td> 0.25％（w / v）の</td></tr><tr><td> D-マンニトール</td><td> 400 mMの</td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 10 mMの</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 20 mMの</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td> 0.1％（w / v）の</td></tr><tr><td> MES、pHは5.7 </td><td> 20 mMの</td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> W5ソリューション </td><td></td></tr><tr><td> NaClを</td><td> 150mMの</td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 125 mMの</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 5 mMの</td></tr><tr><td> MES、pHは5.7 </td><td> 2 mMの</td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 5 mMの</td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> MMGソリューション </td><td></td></tr><tr><td> MES、pHは5.7 </td><td> 4 mMの</td></tr><tr><td> D-マンニトール</td><td> 400 mMの</td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 15 mMの</td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG溶液 </td><td></td></tr><tr><td> PEG4000 </td><td> 40％（w / v）の</td></tr><tr><td> D-マンニトール</td><td> 200 mMの</td></tr><tr><td> CaCl 2 </td&gt; <td> 100 mMの</td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> イメージングソリューション </td><td></td></tr><tr><td> W5ソリューション</td><td>最終容量</td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> 5％（v / v）の</td></tr><tr><td>ルシフェリン</td><td> 1.2 mMの</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td> 50 mg / mlで</td></tr></tbody></table> 表1： ソリューションの一覧。 材料およびバッファの作製<ol><li>植物材料<ol><li>シロイヌナズナコルを保つ-0水に種子を1.5mlチューブ中で4℃の暗所で4日間。ポットに土に種をピペットし、7日間21℃で長日条件下（16時間明8時間の暗）に移します。高湿度を確保するために、最初の3日間、鍋に蓋をしたままにしておきます。移植6新しい8センチメートルのx 13センチメートル×5センチポットに苗とanothため同じ条件で植物を成長を続けます21日えー。土壌は全体で湿っていることを確認してください。 </li></ol></li><li>レポータープラスミド<ol><li>製造業者の説明書に従ってDNA単離キットを使用して、事前に細菌の培養物からLUCレポータープラスミド19：CCA1proを精製します 。 注：20μgのレポータープラスミドをトランスフェクションのため（のdH 2 O中に2μg/μlので10μl）を必要とされます。 </li></ol></li><li>ソリューション 注：このプロトコルのための5つのソリューションが必要とされる：酵素液、洗浄5（W5）溶液、マンニトール、マグネシウム（MMG）溶液を、ポリエチレングリコール（PEG）溶液、及び撮像溶液（ 表1）。プロトプラスト単離工程に進む前に、これらを準備します。 <ol><li> 表1のとおりの酵素溶液10mlを調製し、最後の酵素を追加し、フィルタは、0.22μmのシリンジフィルターを通して溶液を滅菌します。 </li><li>次のボリュームに残っている溶液を調製：15ミリリットルW5ソリューション、10ミリリットルMMG秒表1のとおりolution、1ミリリットルPEG溶液と1.5ミリリットルのイメージングソリューション。 注：これは、PEG溶液は、PEGが完全に溶解していることを確認するために、トランスフェクション前に時間未満何を準備されていないことが重要です。フィルターは、0.22μmのシリンジフィルターを通してイメージング溶液を滅菌します。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> 図1：プロトプラスト単離成人シロイヌナズナ植物（A）の葉を（B）に上向き下部表皮層でオートクレーブテープで固定されています。 （C）マジックテープを穏やかに15ミリリットルコニカルチューブの先端と下側の表皮層に押し付けられます。 （D）マジックテープは葉肉細胞（E）を露出させます。 （F）休暇でオートクレーブテープのストリップ添付の溶液にプロトプラストを放出し、セルラーゼおよびペクチナーゼを含む酵素液に浮いています。 （G）は、葉の骨格は、酵素溶液（H）でプロトプラストを残して、酵素消化後、オートクレーブテープ上に残り、廃棄されます。 （I）の最終結果の葉肉プロトプラスト（スケールバー=50μm）を。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 2.プロトプラストの単離<ol><li>シャーレにラベルを付け、10ミリリットルフィルター滅菌酵素溶液を加えます。 </li><li>きれいなラボの表面に粘着面を上にしてオートクレーブテープの4ストリップを修正し、ストリップ上のペトリ皿のサイズをマーク。 </li><li> （4週齢の植物（ 図1a）の葉をカットし、オートクレーブテープに表皮上層を押してください（上を向いすなわち低い表皮面<stroNG&gt;図1b））。 </li><li>ゆっくり15ミリリットルコニカルチューブを使用して、下側の表皮表面にマジックテープのストリップを押してください。葉組織（ 図1c）を鎮圧しないように注意してください。慎重に下表皮（ 図1D）を除去し、葉肉細胞（ 図1eの）を露出するためにマジックテープをやってのけます。 </li><li>ペトリ皿にテープを移動し、酵素液（ 図1F）上に浮遊するように、使用ピンセットをペトリ皿に合うようにオートクレーブテープをカットし、下向きに残します。プロトプラストを溶液中に放出される時に60分のためのプラットフォームシェーカー上で60rpmで回転させます。 </li><li>オートクレーブテープ片を除去し、廃棄するためにピンセットを使用します（ 図1グラム ）と50mlコニカルチューブにプロトプラスト（ 図1H）を含む溶液をピペット。 （端を切断して、このようなP5000チップまたはP1000チップとして）ワイドボアピペットチップを使用してください。 </li><li>遠心分離機100 xにおけるプロトプラスト4℃で3分間グラムとピペットで上清を除去します。ペレットは非常に緩んでいるとして、注意してください。 </li><li>チューブを穏やかに渦巻くことにより、10ミリリットルのW5プロトプラストに対する解決策と再懸濁を追加します。 </li><li> 30〜60分間氷上でプロトプラストを休ま。このステップの間、血球計数器（ 図1I）にプロトプラストをカウントすることにより、歩留まりを評価します。 </li><li> 4℃で3分間、100×gでの遠心分離によってプロトプラストを収集し、ピペットで上清を除去します。ペレットは非常に緩んでいるとして、注意してください。 </li><li> MMG溶液中の5×10 5個のプロトプラスト/ mlの濃度にプロトプラストを再懸濁します。 </li></ol> 3.プロトプラストトランスフェクション<ol><li> 15ミリリットルコニカルチューブに10μlのレポータープラスミド（2μgの/μl）を追加します。 </li><li>チューブに400μlのプロトプラストを追加します。 </li><li> 1ボリューム（410μl）をPEG溶液を追加し、プロトプラストをトランスフェクションするためにチューブを穏やかに12回転倒混和します。 </li><li> 8-15分INC後室温でubationは、4つのボリューム（1640μL）W5溶液でプロトプラスト-DNA-PEG混合物を希釈し、軽く6回転倒混和します。 </li><li>室温で2分間100×gで遠心分離することによってトランスフェクトされたプロトプラストを収集し、ピペットで上清を除去します。ペレットは非常に緩んでいるようにもう一度、注意してください。 </li><li> 1250μlのイメージングソリューションでプロトプラストを再懸濁します。 </li><li> 6へのアリコート200μlを、96ウェルプレートのウェルを複製W5溶液で任意の空のウェルを満たし、及び発光イメージングに適した接着剤明確な蓋でプレートをシール。 </li></ol> 4.イメージング<ol><li>植物イメージングに適した任意の発光イメージングセットアップにプレートを転送します。撮影を開始し、その後、ウェル間の凝縮および圧力の違いを回避するために、転送した後、プレート上に接着剤の蓋に10〜15分を変更します。室温で5日間のプレート毎〜45分（ウェル当たり3秒）を読みます。 注記：プレートの頻度は、読み取り、ウェルあたりのリードタイムは、撮影設定によって異なります。 </li></ol> 5.データ解析<ol><li>任意の解析ソフトウェア（例えば、生体リズム解析ソフトウェアシステム（BRASS）22）を用いた発光結果を分析します。概日の欠陥を明らかにするために、野生型コントロールに変異体のラインを比較してください。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここでは、プロトプラストの分離、トランスフェクション、およびluminecentイメージングを含むシロイヌナズナ系統における概日周期欠陥をスクリーニングするための迅速なアッセイを、提示します。野生型シロイヌナズナとクロック突然変異体CCA1 / LHY、ZTL、及びCCA1 -OXにおける概日周期はCCA1proからの発光の測定値から算出した：LUCレポーター、よりタイムを使用して、全体の植物から生成された公開されたデータと一致することが見出されかかるトランスジェニックアプローチ（ 表2）。シロイヌナズナ変異体をスクリーニングするために、このアッセイを使用することは時間がかかり、かつ、特定の変異体は、野生型のリズムを示すことを明らかにする可能性がある、トランスジェニック輝線を生成するための初期要件を回避します。このプロトコルの明確な利点は、植物における計時に影響を与える複数の遺伝子の同定を助けるであろう、任意のシロイヌナズナラインが変更された概日転写リズムのために短時間でスクリーニングすることができるということです。 26,27に到達させるために、酵素溶液でストリップを浸潤薄いストリップと真空中に葉や苗を切断することを含みます。その後の消化酵素溶液にプロトプラストを解放するために暗闇の中で、少なくとも3時間のインキュベーションを必要とします。真空浸潤を適用しない場合は、18時間のインキュベーション時間アップをお勧めします。酵素に対する不透過性上皮細胞層がテープによって除去されるので、ここに提示プロトコルでは、真空浸潤は不要です。植物材料を切断してプロトプラストを生成する際には、消化後に細胞壁の破片からプロトプラストを分離する必要があります。これは、典型的には、溶液を濾過または糖勾配27,26上で精製することにより行われます。ここでは、任意の未消化の組織は、後にオートクレーブテープ上に残ります消化ので、プロトプラストの濾過および糖勾配精製を省略することができます。長時間のプロトプラストの手順に起因するストレスが細胞生存率と概日時計に影響を与える可能性があります。ここで可視化し、テープベースのプロトプラスト法20は、プロトプラストの高い数を出します。概日、時系列上での細胞の生存能力を与えられ、プロトプラスト全体実生（ 表2）のマッチング期間の長さは、ここで説明する方法は、プロトプラストを生成するための代替方法よりも好ましいです。 プロトコルのトランスフェクション工程は、そのプロトプラストの生存率に影響を与える重要なステップです。 PEG溶液は、この溶液（段階3.4）で細胞に送達されるDNA、および両方のインキュベーション時間を可能にし、PEGの比率は、経験的に決定されるべきです。標準濃度が低い形質転換効率を低下させる濃度以上では、20％であり、生存能力28を減少させる濃度。 5分ほどの短いインキュベーション時間は、プロトプラスト27の効率的なトランスフェクションをもたらす可能性があります。 プロトプラストは、任意の発光イメージングプラットフォーム上に結像することができます。このビデオでは、我々はハイスループットスクリーニングおよび頻繁な測定を可能にします（〜20μEの複合強度で、それぞれ、赤と青のLED、630および470 nm）の外部ライトを搭載した発光プレートリーダーを、使用しています。照明は、光合成のために利用可能であるような電荷結合素子（CCD）カメラをベース代替プレートリーダーやセットアップなどの発光を検出する他の撮像装置は、長いように等しく良好に適用することができます。制御キャビネットに搭載されたCCDカメラを使用することの利点は、軽量で、温度をプログラムすることができます。欠点は、混乱させるに加えてプロトプラストにストレスを引き起こす可能性が暗闇の長期間を導入し、より長い捕捉時間です内因性の計時をる。かかわらず、実験プラットフォームが選択された、設定の調整は、苗や成熟植物の設定に比べて必要である可能性が高いです。我々の経験では、イメージング・バッファ内のトランスフェクションおよび/またはルシフェリン中にレポータープラスミドの濃度を増加させると、初期の実験で発生する可能性のある不規則なまたは迅速湿リズムを解決する可能性があります。 将来の実験では、ここで説明する方法は、任意の変異シロイヌナズナ線の概日表現型を研究するために適用することができます。軽微な変更では、計時上など様々な薬物の効果は、このセットアップで研究することができました。さらに、トランスフェクションは、さらに、このプロトコルの汎用性を拡大する、19遺伝子サイレンシングのための人工マイクロRNAを含むように修飾することができます。イネプロトプラストを生成するためのプロトコルは、29十分に確立されており、ここで紹介する撮像プロトコルは、均等に私たちのUを促進するために適用することができます経済的に重要な単子葉作物植物におけるクロックのnderstanding。

ほとんどの生物は、環境への日々の変化を効率的に交渉を支援するために、内因性のタイムキーパーを持っています。このタイムキーパー、概日時計は、外部環境の予測可能な変化を先取りするために、生物の代謝および生理学の多くの側面を規制しています。 4 -例えば植物では、時間的に予測可能な病原体や草食動物の攻撃の期待が強く、全体的な感受性1を低減します。デンプン代謝はしっかりと長いまたは短日条件5で成長したかどうかを夜明けまで、最後のその澱粉の埋蔵量を確保するために、体内時計によって制御されています。確かに、24時間の環境ショーに一致する概日時計を持つ植物は、ミスマッチ期間6のクロックを実行している植物に比べて成長率、炭素固定率と生存率を増加させました。すべてのこれらのプロセスにおける概日リズムの広範な影響が最大のリズミカルなレギュレーションから三番目に大きく発生しますシロイヌナズナ7の全トランスクリプトームの。これらのリズミカルな遺伝子産物は、代謝経路、ホルモンシグナル伝達、およびストレス応答7を含む細胞プロセスの広い範囲に関与しています。その上で、タンパク質機能の直接の概日調節は、リン酸化8の概日調節およびおそらく他の翻訳後修飾（PTMを）によって確立されています。 この毎日の転写再プログラミングを駆動する概日時計の中心に/翻訳フィードバックは朝発現遺伝子を含む（TTFLs）を、ループの転写のネットワークがある発現を抑制概日時計ASSOCIATED 1（CCA1）とLATE細長い胚軸（LHY）夕方の遺伝子のCAB 1（TOC1）のタイミング、GIGANTEA（GI）と夜の複合体（EC）のメンバーの、LUX不整脈（LUX）、早咲き3（ELF3）、およびELF4 9から11まで 。一緒にウィットH 疑似レスポンスレギュレーターの -genes（PRR3、5、7、および9）ECが正レギュレータ12として機能するのに対し、TOC1は CCA1 / LHYの発現を抑制する- 14。 TTFLネットワークコンポーネントの、フィードバック機構に追加の転写後及び翻訳後の調節は、チューニング概日リズムに重要な役割を果たしています。現在までに、概日時計タンパク質の同定された最も豊富なPTMは、リン酸化15です。カゼインキナーゼ2（CK2）によるCCA1のリン酸化は、そのは、プロモーター16と概日時計17の温度補償のために重要であるが標的への結合に影響します。 PRRタンパク質を差動概日周期の上にリン酸化され、TOC1のリン酸化は、その負の調節因子との相互作用に影響を及ぼしている、夜、段階的なクロック成分ZEITLUPE（ZTL）18。これらの例は示してどのように24時間へのPTMおよびタンパク質 - タンパク質相互作用のチューニングTTFLネットワーク転写発振器。転写クロック・ネットワークとその規制のより詳細な概要については、優れた最近のレビューは、（ 例えば 、15を参照）が使用可能です。 しかし、どのようなそれほど明らか残っているのはリズミカルに戻って時計機構自体に細胞代謝フィードのプロセスや他の側面を規制する程度です。クロック欠陥のためのシロイヌナズナ変異体の大規模なスクリーニングはTTFLネットワークから24時間のリズムの生成に関与することができたメカニズムやシグナル伝達経路のさらなる理解を得ることができました。このため、Kimとサマーズは、以前に任意のシロイヌナズナライン19における時計機能の効率的かつ迅速な分析のためのブレークスルー方式を発表しました。プロトプラストにおける一過性発現の使用に基づいて、この方法は、安定したトランスジェニック系統の必要性を上回るまたは発光クロックマーカーラインに交差します。ここでは、高収量プロトプラストisolatioを可視化最適化されたプロトコルと組み合わせたn個の方法20は、96ウェルプレートリーダー中で一過性に発現クロックマーカーの蛍光イメージングによる概日欠陥をスクリーニングします。 我々は、変更された概日リズムを検出し、ここで正常に記載の方法を確認するために、十分に特徴づけクロック変異体に野生型Col- 0シロイヌナズナを比較します。 LUC 19：CCA1pro;これらの株由来のプロトプラストは、概日CCA1プロモーターからホタルルシフェラーゼを発現するレポーター構築物でトランスフェクトされています。ルシフェラーゼはルシフェリンを、これらのプロトプラストにおける転写リズムの周期、振幅及び位相を評価するために時間をかけて撮像される光21を出射する電子的に励起オキシルシフェリンに変換された多段階の反応を触媒します。 プロトコルは、三つの主要な部分で構成されています。レポータープラスミド、及び発光イムでプロトプラストをトランスフェクション、プロトプラストの単離エージング。これらの3つの部分が常に新たに調製した緩衝液および試薬を用いて、単一の日に行われるべきです。レポータープラスミドの十分な量の植物成長及び精製は、事前に行われるべきであり、このプロトコルで可視化されていません。

<table><tbody><tr><td>CELLULYSIN Cellulase, &lt;em&gt;Trichoderma viride&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>Merck Millipore</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pectinase R10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Acros Organics</td><td>327765000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>327300010</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fischer Scientific</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td><td>Acros Organics</td><td>434630010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, Firefly</td><td>Biosynth AG</td><td>L-8200</td><td>Dissolve luciferin powder in 0.1 M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50 mM</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9618</td><td></td></tr><tr><td>Comply Steam Indicator Tape</td><td>3M</td><td>1222</td><td></td></tr><tr><td>Magic Tape</td><td>3M</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, 96 well, flat bottom, white</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655075</td><td></td></tr><tr><td>TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates</td><td>Perkin Elmer</td><td>6050195</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 10 ml, w/o needle</td><td>BD Plastipak</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter 0.22 &amp;micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td><td></td><td></td><td>Free download at amillar.org</td></tr><tr><td>QIAfilter Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12262</td><td></td></tr><tr><td>Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell</td><td>Hawksley</td><td>AC6000</td><td></td></tr><tr><td>Bright field microscope</td><td>Optika Microscopes</td><td>B-150POL-B</td><td></td></tr><tr><td>LB942 TriStar&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; multimode reader, with luminescence module</td><td>Berthold Technologies Ltd</td><td>57947/57948</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

野生型シロイヌナズナのプロトプラストは、既知のクロック突然変異体CCA1 / LHY（短周期変異体2）、ZTL（長周期変異体23）、および過剰発現ラインCCA1 -OX（24不整脈）と比較しました。すべては一過CCA1proにトランスフェクトした：LUCレポーターと5日間にわたってプレートリーダー上で一定の光で画像化。 ここでは、CCA1 / LHYの変異体では、概日制御遺伝子発現の自走期間は発光クロックの安定したトランスジェニック発現が2,9マーカーによって分析公開期間に合わせて、（ 図2a）を短縮することを示しています。 ZTL変異体のプロトプラストにおける概日振動の周期は、野生型に比べて長くなっている（ 図2b）、苗から以前に発表された結果に応じて、細胞懸濁液のcultu解像度およびプロトプラスト19,23,25。 CCA1の過剰発現は午前位相でクロックをロックし、グローバルな転写は不整脈24になります 。一貫して、我々はCCA1proに全く振動を観察されない：CCA1 -OX プロトプラストにおけるLUC発現 （ 図2c）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> 図2：Col- 0のプロトプラスト概日リズムプロトプラスト、CCA1 / LHY、ZTL、とCCA1 -OX 一過CCA1proで形質転換した：LUCは、構築し、発光の概日リズムは、5日間で画像化した（A - C）。 （D）コル-0、CCA1 / LHYとZTL（A - B）での発光トレースに基づいて概日周期を推定。私に±SEM、nは3-5、t検定のp値示されているように。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 遺伝子型 </td><td> 期間（プロトプラスト） </td><td> 期間（トランスジェニック） </td><td> によって報告されました： </td><td> リファレンス </td></tr><tr><td> Col- 0 </td><td> 23.0±0.21 </td><td> 24.4±0.09 </td><td> pCCA1：コルでLUC -0 </td><td> （2） </td></tr><tr><td> CCA1 / LHY </td><td> 20.6±0.13 </td><td> 19.9±0.11 </td><td> pCCA1：コルでLUC -0 </td><td> （2） </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 〜18 </td><td> L 小胞体のバックグラウンドでのRNA </td><td> （9） </td></tr><tr><td&gt; ZTL </td><td> 25.1±0.12 </td><td> 27.4±0.5 </td><td> CAB2：C24生態型でLUC </td><td> （22） </td></tr><tr><td> CCA1 -OX </td><td>不整脈の</td><td>不整脈の</td><td> pCCA1：LUC（LDデータのみ） </td><td> （2） </td></tr><tr><td></td><td></td><td>不整脈の</td><td>コル-0バックグラウンドでRNAとタンパク質</td><td> （23） </td></tr></tbody></table> 表2：トランスジェニック苗に比べてプロトプラストにおける概日リズム pCCA1の概日期間：期間最初の変異について報告長さと、利用可能な場合と比較してプロトプラストにおけるLUC発現 、pCCA1と：コル-0でLUC式 。

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Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

概日時計は、シロイヌナズナのトランスクリプトームの約3分の規制が、計時にフィードバックされる遺伝子の割合は不明のまま。ここでは、急速に一過プロトプラスト内で発現の概日レポーターの発光イメージングを使用して、シロイヌナズナのいずれかの変異体のラインに概日表現型を評価するための方法を視覚化します。

発光時計レポーターとシロイヌナズナプロトプラストトランスフェにおける概日表現型の迅速分析

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.7K ビュー.  University of Edinburgh. 概日時計は、シロイヌナズナのトランスクリプトームの約3分の規制が、計時にフィードバックされる遺伝子の割合は不明のまま。ここでは、急速に一過プロトプラスト内で発現の概日レポーターの発光イメージングを使用して、シロイヌナズナのいずれかの変異体のラインに概日表現型を評価するための方法を視覚化します。 

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Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

遺伝学

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to sleep behavior. In vertebrates, circadian rhythm is controlled by a molecular oscillator that functions in both the suprachiasmatic nucleus (SCN; central pacemaker) and individual cells comprising most peripheral tissues. More importantly, disruption of circadian rhythm by exposure to light-at-night, environmental stressors and/or toxicants is associated with increased risk of chronic diseases and aging. The ability to identify agents that can disrupt central and/or peripheral biological clocks, and agents that can prevent or mitigate the effects of circadian disruption, has significant implications for prevention of chronic diseases. Although rodent models can be used to identify exposures and agents that induce or prevent/mitigate circadian disruption, these experiments require large numbers of animals. In vivo studies also require significant resources and infrastructure, and require researchers to work all night. Thus, there is an urgent need for a cell-type appropriate in vitro system to screen for environmental circadian disruptors and enhancers in cell types from different organs and disease states. We constructed a vector that drives transcription of the destabilized luciferase in eukaryotic cells under the control of the human PERIOD 2 gene promoter. This circadian reporter construct was stably transfected into human mammary epithelial cells, and circadian responsive reporter cells were selected to develop the in vitro bioluminescence assay. Here, we present a detailed protocol to establish and validate the assay. We further provide details for proof of concept experiments demonstrating the ability of our in vitro assay to recapitulate the in vivo effects of various chemicals on the cellular biological clock. The results indicate that the assay can be adapted to a variety of cell types to screen for both environmental disruptors and chemopreventive enhancers of circadian clocks.

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

An in vitro bioluminescence assay to determine cellular circadian rhythm in mammary epithelial cells is presented. This method utilizes mammalian cell reporter plasmids expressing destabilized luciferase under the control of the PERIOD 2 gene promoter. It can be adapted to other cell types to evaluate organ-specific effects on circadian rhythm.

体外乳腺上皮細胞の概日リズムを特徴付ける生物発光アッセイ

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

生物学

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene reporters. This new and easy to use in vivo fluorescence monitoring system was developed to record the transcriptional rhythm of the clock gene, Cry1, in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice. To do so, a Cry1 transcription fluorescence reporter was designed and packaged into Adeno-associated virus. Purified, concentrated virus was injected into the mouse SCN followed by the insertion of an optic fiber, which was then fixed onto the surface of the brain. The animals were returned to their home cages and allowed a 1-month post-operative recovery period to ensure sufficient reporter expression. Fluorescence was then recorded in freely moving mice via an in vivo monitoring system that was constructed at our institution. For the in vivo recording system, a 488 nm laser was coupled with a 1 &#215; 4 beam-splitter that divided the light into four laser excitation outputs of equal power. This setup enabled us to record from four animals simultaneously. Each of the emitted fluorescence signals was collected via a photomultiplier tube and a data acquisition card. In contrast to the previous bioluminescence in vivo circadian clock recording technique, this fluorescence in vivo recording system allowed the recording of circadian clock gene expression during the light cycle.

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This newly developed fluorescence-based technology enables long-term monitoring of the transcription of circadian clock genes in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice in real-time and at a high temporal resolution.

生体内で蛍光レポーターを使用してマウス視交叉上核における時計遺伝子発現のモニタリング

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

神経科学

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Analysis of Circadian Photoresponses in Drosophila Using Locomotor Activity

Circadian rhythms are only beneficial to animals if they can be synchronized by changes of ambient conditions. Light and temperature are two dominant environmental parameters that synchronize animal circadian clocks. In Drosophila circadian photo-responses are mediated by a solely blue light photoreceptor named CRYPTOCHROME (CRY). Upon photoreception, CRY changes its conformation and initiates the proteosomal dependent degradation of TIMELESS (TIM). TIM is an important pacemaker protein, thus degradation of TIM will reset the circadian clock. Under constant light conditions (LL), wild type flies quickly become arrhythmic because of the constant degradation of TIM, while flies bearing defects with circadian photo-responses will still be rhythmic. Thus LL triggered arrhythmicity has been used for screening of components in circadian light input pathways. A brief short light pulse in the night can also dramatically shift phases of circadian rhythms. As expected, this phase shift response is reduced in flied with defects in circadian photoresponse. Thus analyzing locomotion behavior rhythmicity under LL or phase changes after short light pulse in constant darkness (DD) are two major methods to study circadian photoresponse. Here we describe how to design and analyze LL and phase response experiments. LL arrhythmicity is suitable for screening light input pathways mutants, whereas phase response validates the results and provide further information for light sensitivity.

Drosophila locomotor activity is a robust and quantitative measurement of circadian photo-responses. We describe protocols for designing behavior experiments for circadian photo-responses and analyzing the data. Studying the circadian photo-responses is important for dissecting the neuronal and molecular mechanisms of light entrainment.

Circadian rhythms are only beneficial to animals if they can be synchronized by changes of ambient conditions. Light and temperature are two dominant ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In circadian rhythms research, for example, clock gene fusions with firefly luciferase give rise to robust rhythms in cellular bioluminescence that persist over many days. Technical limitations associated with photomultiplier tubes (PMT) or conventional microscopy-based methods for bioluminescence quantification have typically demanded that cells and tissues be maintained under quite non-physiological conditions during recording, with a trade-off between sensitivity and throughput. Here, we report a refinement of prior methods that allows long-term bioluminescence imaging with high sensitivity and throughput which supports a broad range of culture conditions, including variable gas and humidity control, and that accepts many different tissue culture plates and dishes. This automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) also allows the observation of spatial variations in luciferase expression across a cell monolayer or tissue, which cannot readily be observed by traditional methods. We highlight how the ALLIGATOR provides vastly increased flexibility for the detection of luciferase activity when compared with existing methods.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetically encoded luciferase is a popular non-invasive reporter of gene expression. Use of an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) enables longitudinal recording from bioluminescent cells under a wide range of conditions. Here we show how ALLIGATOR may be used in the context of circadian rhythms research.

ガスと温度最適化レコーダー (ワニ) をイメージング自動縦ルシフェラーゼを用いた発光レポーターの柔軟な測定

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

概日リズム研究のためのヒト腸腸エンテロイドの最適化

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse repertoire of cellular and physiological processes ranging from sleep-wake cycles to metabolism. This clock mechanism entrains the organism based on environmental changes and coordinates the temporal regulation of molecular and physiological events. Previously, it was demonstrated that autonomous circadian rhythms are maintained even at the single-cell level using cell lines such as NIH3T3 fibroblasts, which were instrumental in uncovering the mechanisms of circadian rhythms. However, these cell lines are homogeneous cultures lacking multicellularity and robust intercellular communications. In the past decade, extensive work has been performed on the development, characterization, and application of 3D organoids, which are in vitro multicellular systems that resemble in vivo morphological structures and functions. This paper describes a protocol for detecting circadian rhythms using a bioluminescent reporter in human intestinal enteroids, which enables the investigation of circadian rhythms in multicellular systems in vitro.

著者スポットライト:多細胞系における概日リズムのin vitro研究

Circadian rhythms, which exist in most organisms, regulate the temporal organization of biological processes. 3D organoids have recently emerged as a physiologically relevant in vitro model. This protocol describes the use of bioluminescent reporters to observe circadian rhythms in organoids, enabling in vitro investigations of circadian rhythms in multicellular systems.

オルガノイドにおける生物発光レポーターによる概日振動のモニタリング

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...

発光時計レポーターとシロイヌナズナプロトプラストトランスフェにおける概日表現型の迅速分析

要約

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ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

体外乳腺上皮細胞の概日リズムを特徴付ける生物発光アッセイ

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ

生体内で蛍光レポーターを使用してマウス視交叉上核における時計遺伝子発現のモニタリング

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

Analysis of Circadian Photoresponses in Drosophila Using Locomotor Activity

ガスと温度最適化レコーダー (ワニ) をイメージング自動縦ルシフェラーゼを用いた発光レポーターの柔軟な測定

オルガノイドにおける生物発光レポーターによる概日振動のモニタリング

オルガノイドにおける生物発光レポーターによる概日振動のモニタリング