We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).

NOTA: In questo protocollo, i reagenti ei volumi descritti sono espressi per linea Arabidopsis che è testato, e si tradurrà in sei pozzi replicati in quel genotipo. Moltiplicare i materiali con il numero di righe da analizzare quando si analizza più di una riga. Nel video, wild-type Arabidopsis sarà confrontato con l&#39;orologio circadiano mutante linea ZTL (anche se i risultati rappresentativi da linee aggiuntive verranno forniti in seguito). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> soluzione enzimatica </td><td></td></tr><tr><td> cellulase </td><td> 0.5% (w / v) </td></tr><tr><td> pectinasi R10 </td><td> 0,25% (w / v) </td></tr><tr><td> D-mannitolo </td><td> 400 mm </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 20 mm </td></tr><tr><td> Albumina sierica bovina </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> MES, pH 5.7 </td><td> 20 mm </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> soluzione W5 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mm </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 125 mm </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MES, pH 5.7 </td><td> 2 mm </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> soluzione MMg </td><td></td></tr><tr><td> MES, pH 5.7 </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> D-mannitolo </td><td> 400 mm </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 15 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> soluzione PEG </td><td></td></tr><tr><td> PEG4000 </td><td> 40% (w / v) </td></tr><tr><td> D-mannitolo </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td&gt; <td> 100 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> soluzione di imaging </td><td></td></tr><tr><td> soluzione W5 </td><td> al volume finale </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> Luciferin </td><td> 1,2 mm </td></tr><tr><td> ampicillina </td><td> 50 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabella 1: elenco delle soluzioni. 1. Preparazione dei Materiali e tamponi <ol><li> materiali vegetali <ol><li> Mantenere Arabidopsis Col -0 semi in acqua in una provetta da 1,5 ml a 4 ° C al buio per quattro giorni. Pipettare i semi nel suolo in una pentola e trasferimento in condizioni di giorno lungo (16 ore di luce 8 ore scuro) a 21 ° C per 7 giorni. Lascia un coperchio sulla pentola per i primi tre giorni di tempo per garantire l&#39;alta umidità. Trapianto sei piantine ad un nuovo 8 cm x 13 cm x 5 cm pentola e continuare a crescere le piante nelle stesse condizioni per another 21 giorni. Assicurarsi che il terreno è umido tutto. </li></ol></li><li> Reporter plasmidi <ol><li> Purificare il CCA1pro: giornalista plasmide LUC 19 da coltura batterica in anticipo, utilizzando un kit di isolamento del DNA secondo le istruzioni del produttore. NOTA: è richiesto 20 mcg giornalista plasmide (10 ml a 2 mg / mL in DH 2 O) per una trasfezione. </li></ol></li><li> soluzioni NOTA: per questo protocollo sono necessari cinque soluzioni: soluzione enzimatica, soluzione di lavaggio 5 (W5) soluzione, mannitolo-Magnesio (MMG), il polietilene glicole (PEG) soluzione, e la soluzione di imaging (Tabella 1). Preparare questi prima di passare alla fase di isolamento protoplasti. <ol><li> Preparare 10 ml di soluzione enzimatica come da Tabella 1, aggiungendo gli enzimi ultima, e filtro sterilizzare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron siringa. </li><li> Preparare le soluzioni rimanenti nei seguenti volumi: 15 ml di soluzione di W5, 10 ml MMg soluzione, 1 ml di soluzione di PEG e soluzione di imaging 1,5 ml come da Tabella 1. NOTA: È importante che la soluzione PEG è non meno preparato di un hr prima della trasfezione per garantire che il PEG è completamente dissolto. Filtro sterilizzare la soluzione di imaging attraverso un filtro siringa da 0,22 micron. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> Figura 1:. Isolamento Protoplast Le foglie delle piante di Arabidopsis adulti (A) sono fissati su nastro autoclave con lo strato epidermico inferiore rivolta verso l&#39;alto (B). (C) Nastro Magic è leggermente premuto sullo strato epidermico inferiore con la punta di un tubo da 15 ml. (D) Il nastro magico viene rimosso per esporre le cellule del mesofillo (E). (F) strisce di nastro autoclave con permessos collegati siano galleggiare sulla soluzione enzimatica contenente cellulasi e pectinasi, rilasciando protoplasti nella soluzione. (G) La foglia scheletri rimangono sul nastro autoclave dopo digestione enzimatica e vengono scartati, lasciando i protoplasti in soluzione enzimatica (H). (I) finali protoplasti mesofillo risultanti (scala bar = 50 micron). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 2. Isolamento Protoplast <ol><li> Etichettare una capsula di Petri e aggiungere 10 ml di soluzione enzimatica sterilizzata per filtrazione. </li><li> Fissare quattro strisce di nastro autoclave con la parte adesiva su una superficie pulita laboratorio e contrassegnare le dimensioni della capsula di Petri sulle strisce. </li><li> Tagliare le foglie di 4 settimane piante vecchie (Figura 1a), e premere l&#39;epidermide superiore sul nastro autoclave (cioè la superficie epidermica inferiore rivolta verso l&#39;alto ( <strong&gt; Figura 1b)). </li><li> Premere delicatamente le strisce di nastro magico sulla superficie epidermica inferiore usando un tubo da 15 ml. Fare attenzione a non schiacciare il tessuto fogliare (Figura 1c). Estrarre con cautela il nastro magico fuori per mettere a nudo l&#39;epidermide inferiore (Figura 1d) ed esporre le cellule del mesofillo (Figura 1e). </li><li> Tagliare il nastro autoclave per adattarsi alla capsula di Petri, usa le pinzette per spostare il nastro nella capsula di Petri e galleggiare sulla soluzione enzimatica (Figura 1F), lascia rivolto verso il basso. Ruotare a 60 rpm su un agitatore piattaforma per 60 minuti, durante il quale i protoplasti saranno rilasciati nella soluzione. </li><li> Utilizzare le pinzette per rimuovere ed eliminare le strisce di nastro autoclave (Figura 1 g) e pipetta la soluzione contenente i protoplasti (Figura 1h) in un tubo conico da 50 ml. Utilizzare un puntale ampio tunnel (come ad esempio una punta P5000 o P1000 una punta con l&#39;estremità tagliate). </li><li> Centrifugare la protoplasti a 100 xg per 3 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante con una pipetta. Fate attenzione, come il pellet è molto sciolto. </li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione W5 ai protoplasti e risospendere agitando delicatamente il tubo. </li><li> Appoggiare i protoplasti in ghiaccio per 30-60 min. Durante questa fase, valutare la resa contando protoplasti in un emocitometro (Figura 1i). </li><li> Raccogliere i protoplasti da centrifugazione a 100 xg per 3 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante con una pipetta. Fate attenzione, come il pellet è molto sciolto. </li><li> Risospendere le protoplasti ad una concentrazione di 5 x 10 5 protoplasti / ml in soluzione MMg. </li></ol> 3. Protoplast Trasfezione <ol><li> Aggiungere 10 ml giornalista plasmide (2 mg / mL) a un tubo da 15 ml. </li><li> Aggiungere 400 microlitri protoplasti al tubo. </li><li> Aggiungere un volume (410 ml) soluzione di PEG e mescolare capovolgendo la provetta delicatamente 12 volte per trasfettare i protoplasti. </li><li> Dopo 8-15 min incubation a temperatura ambiente, diluire la miscela di protoplasti-DNA-PEG con quattro volumi (1640) microlitri soluzione W5 e mescolare invertendo delicatamente sei volte. </li><li> Raccogliere i protoplasti trasfettati mediante centrifugazione a 100 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante con una pipetta. Ancora una volta, fare attenzione, come il pellet è molto sciolto. </li><li> Risospendere le protoplasti a 1.250 ml soluzione di imaging. </li><li> Aliquota 200 ml in sei replicano pozzetti di una piastra a 96 pozzetti, colmare eventuali pozzi vuoti con soluzione W5, e sigillare il piatto con un coperchio trasparente adesivo idoneo per l&#39;imaging luminescenti. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Trasferire la piastra a qualsiasi configurazione di imaging luminescente adatto per l&#39;imaging impianto. Modificare i coperchi adesivi sulle piastre 10-15 minuti dopo il trasferimento per evitare differenze di condensazione e di pressione tra i pozzi, quindi avviare l&#39;imaging. Leggere la piastra ogni ~ 45 min (3 sec per pozzetto) per cinque giorni a temperatura ambiente. Notare lala frequenza di targa legge e il tempo di lettura per pozzetto possono variare a seconda della configurazione di imaging. </li></ol> Analisi 5. I dati <ol><li> Analizzare i risultati di luminescenza con qualsiasi software di analisi (per esempio, Biological Rhythms Analysis System Software (BRASS) 22). Confrontare la linea mutante di controlli wild-type per rivelare difetti circadiani. </li></ol>

<ol>
	<li>Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+synchronizes+jasmonate-mediated+defense+with+insect+circadian+behavior.">Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+circadian+clock+and+innate+immunity+in+Arabidopsis.">Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis.</a> PLoS Pathog. 9 (6), 1003370 (2013).</li><li>Hevia, M. A., Canessa, P., M&#252;ller-Esparza, H., Larrondo, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circadian+oscillator+in+the+fungus+Botrytis+cinerea+regulates+virulence+when+infecting+Arabidopsis+thaliana.">A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).</li><li>Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defence+responses+of+Arabidopsis+thaliana+to+infection+by+Pseudomonas+syringae+are+regulated+by+the+circadian+clock.">Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock.</a> PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).</li><li>Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+control+of+carbohydrate+availability+for+growth+in+Arabidopsis+plants+at+night.">Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).</li><li>Dodd, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+circadian+clocks+increase+photosynthesis,+growth,+survival,+and+competitive+advantage.">Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage.</a> Science. 309 (5734), 630-633 (2005).</li><li>Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+transcriptome+analysis+reveals+circadian+regulation+of+key+pathways+in+plant+growth+and+development.">Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development.</a> Genome Biol. 9 (8), 130 (2008).</li><li>Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Circadian+Phosphoproteomic+Analysis+of+Arabidopsis+Reveals+Extensive+Clock+Control+of+Key+Components+in+Physiological,+Metabolic,+and+Signaling+Pathways.">Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).</li><li>Mizoguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LHY+and+CCA1+Are+Partially+Redundant+Genes+Required+to+Maintain+Circadian+Rhythms+in+Arabidopsis.">LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis.</a> Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).</li><li>Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELF4+is+a+phytochrome-regulated+component+of+a+negative-feedback+loop+involving+the+central+oscillator+components+CCA1+and+LHY.">ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY.</a> Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).</li><li>Lu, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCA1+and+ELF3+Interact+in+the+Control+of+Hypocotyl+Length+and+Flowering+Time+in+Arabidopsis.">CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).</li><li>Nakamichi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSEUDO-RESPONSE+REGULATORS+9,+7,+and+5+are+transcriptional+repressors+in+the+Arabidopsis+circadian+clock.">PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock.</a> Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).</li><li>Dixon, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+repression+of+core+circadian+genes+is+mediated+through+EARLY+FLOWERING+3+in+Arabidopsis.">Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).</li><li>Gendron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+circadian+clock+protein,+TOC1,+is+a+DNA-binding+transcription+factor.">Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).</li><li>Hsu, P. Y., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheels+within+wheels:+the+plant+circadian+system.">Wheels within wheels: the plant circadian system.</a> Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).</li><li>Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+phosphorylation+of+CCA1+is+necessary+for+its+circadian+oscillator+function+in+Arabidopsis.">CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).</li><li>Portol&#233;s, S., M&#225;s, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+interplay+between+protein+kinase+CK2+and+CCA1+transcriptional+activity+is+essential+for+clock+temperature+compensation+in+Arabidopsis.">The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001201 (2010).</li><li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+regulation+of+the+Arabidopsis+circadian+clock+through+selective+proteolysis+and+phosphorylation+of+pseudo-response+regulator+proteins.">Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins.</a> J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).</li><li>Kim, J., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assessment+of+gene+function+in+the+circadian+clock+using+artificial+microRNA+in+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts.">Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).</li><li>Wu, F. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 16 (2009).</li><li>Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase:+the+structure+is+known,+but+the+mystery+remains.">Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains.</a> Structure. 4 (3), 223-228 (1996).</li><li>Edwards, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+regulatory+flexibility+under+changing+environmental+conditions.">Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions.</a> Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424 (2010).</li><li>Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZEITLUPE+Encodes+a+Novel+Clock-Associated+PAS+Protein+from+Arabidopsis.">ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis.</a> Cell. 101 (3), 319-329 (2000).</li><li>Wang, Z. -. Y., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Expression+of+the+CIRCADIAN+CLOCK+ASSOCIATED+1+(CCA1)+Gene+Disrupts+Circadian+Rhythms+and+Suppresses+Its+Own+Expression.">Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression.</a> Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).</li><li>Kim, W. -. Y., Geng, R., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+phase-specific+degradation+of+the+F-box+protein+ZTL+is+mediated+by+the+proteasome.">Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).</li><li>Zhai, Z., Jung, H. -. I., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+protoplasts+from+tissues+of+14-day-old+seedlings+of+Arabidopsis+thaliana.">Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).</li><li>Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+mesophyll+protoplasts:+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis.">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li><li>Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+direct+gene+transfer+to+protoplasts.">Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+rice+green+tissue+protoplast+system+for+transient+gene+expression+and+studying+light/chloroplast-related+processes.">A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes.</a> Plant Methods. 7 (1), 30 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Qui, vi presentiamo un rapido test per lo screening difetti periodo circadiani nelle linee di Arabidopsis, tra cui l&#39;isolamento di protoplasti, trasfezione, e di imaging luminecent. Il periodo circadiano nel wild-type Arabidopsis e l&#39;orologio mutanti CCA1 / Lhy, ZTL, e CCA1 -OX è stato calcolato da misure di luminescenza da un CCA1pro: giornalista LUC ed è risultato essere coerenti con i dati pubblicati generati dalle piante intere che utilizzano più tempo- consumano approcci transgenici (Tabella 2). Usando questo test per lo screening mutanti di Arabidopsis evita il requisito iniziale per generare linee luminescenti transgeniche, che richiede tempo e potrebbe rivelare che soltanto una particolare mutante presenta ritmi wild-type. Un chiaro vantaggio di questo protocollo è che ogni linea di Arabidopsis può essere proiettato in breve tempo per i ritmi circadiani alterati trascrizionali, che aiuterà l&#39;identificazione di altri geni che influenzano cronometraggio nelle piante. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Isolamento di protoplasti può essere laboriosa, soprattutto se la linea mutante mostra un fenotipo nano. Metodi precedentemente segnalati per la generazione di protoplasti coinvolgono taglio foglie o piantine in strisce sottili e vuoto infiltranti le strisce con soluzione enzimatica per consentire gli enzimi di raggiungere le pareti delle cellule 26,27. La digestione successiva richiede almeno 3 ore di incubazione al buio per rilasciare i protoplasti nella soluzione enzimatica. Quando l&#39;infiltrazione vuoto non viene applicata, si consiglia di incubazione di tempo fino a 18 ore. Nel protocollo qui presentato, infiltrazione vuoto è inutile perché lo strato di cellule epidermiche impenetrabili agli enzimi viene rimosso dal nastro. Durante la generazione di protoplasti tagliando materiale vegetale è necessario protoplasti separati da detriti parete cellulare dopo la digestione; Ciò avviene tipicamente filtrando la soluzione o purificare su un gradiente di 27,26 zucchero. Qui, qualsiasi tessuto non digerito rimane sul nastro autoclave dopola digestione, così filtrazione e zucchero gradiente purificazione dei protoplasti può essere omesso. C&#39;è una possibilità che lo stress derivante da procedure protoplasting prolungati colpisce la vitalità cellulare e l&#39;orologio circadiano. Il metodo protoplasting basato su nastro 20 visualizzati qui produce un elevato numero di protoplasti; e data la vitalità delle cellule nel corso di una serie temporale circadiano e le lunghezze d&#39;epoca corrispondenza di protoplasti e le piante intere (Tabella 2), la metodologia qui descritta è preferito rispetto ai metodi alternativi per generare protoplasti. Il passo trasfezione del protocollo è un passaggio fondamentale che ha un impatto sulla vitalità delle protoplasti. La soluzione PEG consente il DNA da consegnare nella cella, e sia il tempo di incubazione in questa soluzione (passo 3.4) e la percentuale di PEG deve essere determinato empiricamente. La concentrazione standard è 20%, con concentrazioni inferiori riducendo l&#39;efficienza di trasformazione e superioriLe concentrazioni che riducono la vitalità 28. Tempo di incubazione più breve di cinque minuti potrebbe produrre efficiente trasfezione dei protoplasti 27. I protoplasti possono essere esposte su qualsiasi piattaforma di imaging luminescenti. In questo video, abbiamo utilizzato un lettore di piastre luminescenza dotato di luci esterne (rosso e LED blu, 630 e 470 nm, rispettivamente, ad una intensità combinata di ~ 20 μE), che consente lo screening high-throughput e le misure frequenti. Altre apparecchiature di imaging che rileva luminescenza, come ad esempio lettori di piastre alternativi o messe a punto, basata soprattutto un dispositivo (CCD) fotocamera ad accoppiamento di carica, potrebbe essere applicato ugualmente bene fino a quando l&#39;illuminazione è disponibile per la fotosintesi. Il vantaggio di utilizzare una telecamera CCD montata su un mobile controllabile è che la luce e la temperatura può essere programmata. Uno svantaggio è il tempo di acquisizione più lungo, introducendo periodi prolungati di oscurità che possono causare stress per i protoplasti oltre a perturbareing cronometraggio endogena. Indipendentemente da quale piattaforma sperimentale viene scelto, la regolazione delle impostazioni è probabile che sia necessaria rispetto alle impostazioni di piantine o piante mature. Nella nostra esperienza, aumentando le concentrazioni di giornalista plasmide durante trasfezione e / o luciferina nel buffer di imaging potrebbe risolvere eventuali ritmi irregolari o bagnatura rapidamente che potrebbero verificarsi negli esperimenti iniziali. In esperimenti futuri, la metodologia qui descritta può essere applicata per studiare il fenotipo circadiano di qualsiasi linea Arabidopsis mutante. Con piccole modifiche, ad esempio l&#39;effetto di diversi farmaci sulla misurazione del tempo potrebbe essere studiato in questa configurazione. Inoltre, la trasfezione può essere modificato per includere microRNA artificiale per silenziamento genico 19, espandendo ulteriormente la versatilità di questo protocollo. Protocolli per generare protoplasti di riso sono ben stabiliti 29 ed il protocollo di imaging qui presentata potrebbe ugualmente essere applicate per migliorare la nostra understanding dell&#39;orologio in economicamente importanti piante coltivate monocot.

La maggior parte degli organismi viventi possiedono una cronometrista endogena per aiutare efficiente negoziazione di variazioni giornaliere per l&#39;ambiente. Questo cronometrista, l&#39;orologio circadiano, regola molti aspetti del metabolismo e la fisiologia di un organismo di anticipare i cambiamenti prevedibili nell&#39;ambiente esterno. Nelle piante, per esempio, l&#39;anticipazione di patogeni o erbivori attacchi temporalmente prevedibili riduce fortemente la suscettibilità complessivo 1-4. Metabolismo L&#39;amido è strettamente regolata dall&#39;orologio circadiano al fine di garantire che le riserve di amido scorso fino all&#39;alba se cresciuti in condizioni di lunghe o corte al giorno 5. In effetti, le piante con gli orologi circadiani corrispondenti ai ambiente spettacolo aumento dei tassi di crescita 24 ore, i tassi di fissazione del carbonio e il tasso di sopravvivenza rispetto agli impianti che eseguono un orologio di periodo non corrispondenti 6. L&#39;ampia influenza dei ritmi circadiani in tutti questi processi deriva in larga misura dalla regolazione ritmico di fino a un terzodel trascrittoma totale in Arabidopsis 7. Questi prodotti genici ritmiche sono coinvolti in una vasta gamma di processi cellulari tra cui vie metaboliche, segnalazione ormonale, e le risposte allo stress 7. In cima a quello, la regolazione circadiana diretta della funzione della proteina è stabilita dal regolamento circadiano della fosforilazione 8 e molto probabilmente altre modificazioni post-traduzionali (PTM). Al centro dell&#39;orologio circadiano che guida questa riprogrammazione trascrizionale quotidianamente si trova una rete di trascrizione / feedback traslazionale loop (TTFLs), compresi i geni del mattino-espresso circadiani CLOCK collegate 1 (CCA1) e tardiva ALLUNGATA hypocotyl (LHY) che reprimere l&#39;espressione dei geni sera TIMING dELLA CABINA 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) ei membri del complesso sera (CE); LUX ARRHYTHMO (LUX), fioritura precoce 3 (ELF3), e ELF4 9 - 11. insieme ingegnoh le -Genès REGOLATORE PSEUDO risposta (PRR3, 5, 7 e 9), TOC1 reprime CCA1 espressione / LHY mentre la CE agisce come un regolatore positivo 12 - 14. Ulteriori meccanismi di retroazione, post-trascrizionale e post-traslazionale regolazione dei componenti di rete TTFL svolge un ruolo importante in ritmi circadiani tuning. Fino ad oggi, il PTM più abbondante identificato sulle proteine ​​orologio circadiano è fosforilazione 15. La fosforilazione di CCA1 da Casein Kinase 2 (CK2) colpisce il suo legame di indirizzare i promotori 16 ed è importante per la compensazione della temperatura dell&#39;orologio circadiano 17. Le proteine ​​PRR sono fosforilati differenziale nel corso del ciclo circadiano, e la fosforilazione di TOC1 colpisce interazione con il suo regolatore negativo, la sera-phased componente orologio Zeitlupe (ZTL) 18. Questi esempi illustrano come PTM e le interazioni proteina-proteina sintonizzare la rete TTFL in 24 oreoscillatore trascrizionale. Per una più dettagliata introduzione alla rete di clock trascrizionale e la sua regolazione, recensioni eccellenti recenti sono disponibili (ad esempio di riferimento 15). Tuttavia, ciò che rimane meno chiaro è la misura in cui i processi ritmicamente regolamentati e altri aspetti del metabolismo cellulare feed back nel meccanismo di misurazione del tempo per sé. Ampia selezione di mutanti di Arabidopsis per difetti di clock potrebbe ottenere una maggiore comprensione di quali meccanismi o vie di segnalazione potrebbero essere coinvolti nella generazione di 24 ritmi hr da una rete TTFL. A tal fine, Kim e Somers pubblicati in precedenza un metodo di break-through per l&#39;analisi efficiente e rapida di funzione orologio in qualsiasi linea Arabidopsis 19. Basato sull&#39;utilizzo di espressione transiente in protoplasti, questa metodologia supera la necessità di linee transgeniche stabili o mette a linee marcatore orologio luminescenti. Qui, visualizziamo un alto rendimento isolatio protoplastiMetodo n 20 in combinazione con un protocollo ottimizzato per schermare difetti circadiani di immagini luminescente marcatori orologio transitoriamente espressi in un lettore di piastre a 96 pozzetti. Confronteremo wild-type Col- 0 Arabidopsis di mutanti di clock ben caratterizzati per confermare la metodologia descritta qui con successo rileva ritmi circadiani alterati. Protoplasti derivati ​​da queste linee sono transfettate con un costrutto giornalista che esprime lucciola luciferasi dal promotore CCA1 circadiano; CCA1pro: LUC 19. Luciferasi catalizza la reazione multistadio in cui luciferina viene convertito eccitato elettronicamente oxyluciferin che emette luce 21, che viene ripreso nel tempo per valutare il periodo, ampiezza e fase dei ritmi trascrizionali in questi protoplasti. Il protocollo è costituito da tre parti principali; isolare i protoplasti, transfecting i protoplasti con il plasmide giornalista, e im luminescentiinvecchiamento. Queste tre parti devono essere sempre eseguite in un solo giorno, utilizzando tamponi e reagenti preparati al momento. La crescita delle piante e la purificazione di quantità sufficienti di giornalista plasmide devono essere eseguiti in anticipo e non sono visualizzati in questo protocollo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride&#160;</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>219466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectinase R10</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327765000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>434630010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Firefly</td>
			<td>Biosynth AG</td>
			<td>L-8200</td>
			<td>Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comply Steam Indicator Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>819-1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>SLS2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96 well, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6050195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 ml, w/o needle</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>302188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 &#181;m</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download at amillar.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAfilter Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>AC6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Optika Microscopes</td>
			<td>B-150POL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module</td>
			<td>Berthold Technologies Ltd</td>
			<td>57947/57948</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

Protoplasti di wild-type di Arabidopsis sono stati confrontati con i noti mutanti orologio CCA1 / Lhy (breve periodo mutante 2), ZTL (lungo periodo mutante 23), e la linea di sovraespressione CCA1 -OX (aritmici 24). Tutti sono stati transitoriamente trasfettate con il CCA1pro: giornalista LUC e ripreso in luce costante su un lettore di piastre in 5 giorni. Qui si dimostra che nel mutante CCA1 / Lhy, il periodo di free-running dell&#39;espressione genica circadiano controllato si accorcia (Figura 2a), in linea con il periodo pubblicato analizzato da stabile espressione transgenica di orologio luminescenti marcatori 2,9. Il periodo di oscillazioni circadiane in protoplasti del mutante ztl è più lungo rispetto al tipo selvatico (figura 2b), in conformità con i risultati precedentemente pubblicati da piantine, sospensione cellulare cultures e protoplasti 19,23,25. Sovraespressione di CCA1 blocca l&#39;orologio mattina fase e trascrizione globale diventa aritmico 24. Coerentemente, abbiamo osservato nessun oscillazioni in CCA1pro: espressione LUC in protoplasti -oX CCA1 (Figura 2c). <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> Figura 2: protoplasti ritmi circadiani protoplasti di Col- 0, CCA1 / Lhy, ZTL, e CCA1 -OX sono stati transitoriamente trasformato con il CCA1pro: LUC costruire e ritmi circadiani in luminescenza sono stati ripreso in 5 giorni (A - C). (D) periodale circadiani basate su tracce di luminescenza in Col -0, CCA1 / Lhy e ZTL (A - B). Meun ± SEM, n = 3-5, t-test p-value come indicato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotipo </td><td> Periodo (protoplasti) </td><td> Periodo (transgenici) </td><td> Segnalato da: </td><td> Riferimenti </td></tr><tr><td> col- 0 </td><td> 23.0 ± 0.21 </td><td> 24.4 ± 0.09 </td><td> pCCA1: LUC a Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td> CCA1 / Lhy </td><td> 20.6 ± 0.13 </td><td> 19.9 ± 0.11 </td><td> pCCA1: LUC a Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ~ 18 </td><td> RNA a L er sfondo </td><td> (9) </td></tr><tr><td&gt; ZTL </td><td> 25.1 ± 0.12 </td><td> 27.4 ± 0.5 </td><td> CAB2: LUC in C24 ecotipo </td><td> (22) </td></tr><tr><td> CCA1 -OX </td><td> aritmica </td><td> aritmica </td><td> pCCA1: LUC (dati LD solo) </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> aritmica </td><td> RNA e proteine ​​a Col -0 sfondo </td><td> (23) </td></tr></tbody></table> Tabella 2: ritmi circadiani in protoplasti Rispetto ai transgenici Piantine Il periodo circadiano di pCCA1. Espressione LUC in protoplasti confronto con le lunghezze d&#39;epoca segnalati per la mutazione e, se disponibile, con pCCA1: espressione LUC a Col -0.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter at JoVE.com

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

L&#39;orologio circadiano regola circa un terzo del trascrittoma di Arabidopsis, ma la percentuale di geni che alimentano di nuovo nel cronometraggio rimane sconosciuto. Qui visualizziamo un metodo per valutare rapidamente fenotipi circadiani in qualsiasi linea mutante di Arabidopsis utilizzando immagini luminescenti di un reporter circadiano transitoriamente espresso in protoplasti.

Analisi Rapida di fenotipi circadiani in Arabidopsis protoplasti transfettate con un luminescenti Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

rapid-analysis-circadian-phenotypes-arabidopsis-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Views.  University of Edinburgh.  L'orologio circadiano regola circa un terzo del trascrittoma di Arabidopsis, ma la percentuale di geni che alimentano di nuovo nel cronometraggio rimane sconosciuto. Qui visualizziamo un metodo per valutare rapidamente fenotipi circadiani in qualsiasi linea mutante di Arabidopsis utilizzando immagini luminescenti di un reporter circadiano transitoriamente espresso in protoplasti. 

Video: Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

Isolamento di protoplasti da tessuti di 14-giorni di età piantine di Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Ricerca

Biologia

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floreale-dip Trasformazione Arabidopsis thaliana Per esaminare PTSO2:: β-glucuronidasi Reporter espressione genica

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

Monitoraggio Cell-autonome Ritmi orologio circadiano di espressione genica mediante bioluminescenza Reporter luciferasi

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semi

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Progettazione e analisi del comportamento delle preferenze di temperatura e del suo ritmo circadiano in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

Quantificazione di orofacciale fenotipi in<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Analisi Rapida di fenotipi circadiani in Arabidopsis protoplasti transfettate con un luminescenti Clock Reporter

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Isolamento di protoplasti da tessuti di 14-giorni di età piantine di Arabidopsis thaliana

Floreale-dip Trasformazione Arabidopsis thaliana Per esaminare PTSO2:: β-glucuronidasi Reporter espressione genica

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans

Monitoraggio Cell-autonome Ritmi orologio circadiano di espressione genica mediante bioluminescenza Reporter luciferasi

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di

Progettazione e analisi del comportamento delle preferenze di temperatura e del suo ritmo circadiano in Drosophila

Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

Quantificazione di orofacciale fenotipi in

Trasfettando Cellule RAW264.7 con luciferasi Reporter Gene