Name: rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter
Uploaded: 2016-09-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter at JoVE.com

We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).

참고 :이 프로토콜에서 설명 시약 및 볼륨 테스트 애기 줄에 표시되고, 그 유전자형에 대한 여섯 복제 우물 발생합니다. 하나 이상의 선을 분석 할 때 라인의 개수와 재료를 곱 분석한다. (추가 라인에서 대표적인 결과를 후속 제공 하겠지만) 비디오에서 야생형 애기는 주기성 시계 돌연변이 광고 ZTL 비교한다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 효소액 </td><td></td></tr><tr><td> 셀룰라아제 </td><td> 0.5 % (W / V) </td></tr><tr><td> 펙 티나 R10 </td><td> 0.25 % (w / v)의 </td></tr><tr><td> D- 만니톨 </td><td> 400 밀리미터 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 (2) </td><td> 10 mM의 </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 20 mM의 </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 0.1 % (W / V) </td></tr><tr><td> MES, pH가 5.7 </td><td> 20 mM의 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> W5 솔루션 </td><td></td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 150 밀리미터 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 (2) </td><td> 125 밀리미터 </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 5 밀리미터 </td></tr><tr><td> MES, pH가 5.7 </td><td> 2 밀리미터 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 5 밀리미터 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> MMG 솔루션 </td><td></td></tr><tr><td> MES, pH가 5.7 </td><td> 4 mM의 </td></tr><tr><td> D- 만니톨 </td><td> 400 밀리미터 </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 </td><td> 15 mM의 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG 솔루션 </td><td></td></tr><tr><td> PEG 4000 </td><td> 40 % (W / V) </td></tr><tr><td> D- 만니톨 </td><td> 200 밀리미터 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 (2) </td&gt; <td> 100 밀리미터 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> 이미징 솔루션 </td><td></td></tr><tr><td> W5 솔루션 </td><td> 최종 부피 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 5 % (V / V) </td></tr><tr><td> 루시페린 </td><td> 1.2 밀리미터 </td></tr><tr><td> 암피실린 </td><td> 50 ㎎ / ㎖ </td></tr></tbody></table> 표 1 : 솔루션의 목록입니다. 재료 및 버퍼의 1. 준비 <ol><li> 식물 재료 <ol><li> 애기 장대 골 유지 -0 물에 씨앗을 1.5 ml의 튜브에 4 ° C에서 어둠 속에서 나흘. 냄비에 흙 위에 씨앗을 피펫 7 일 동안 21 ° C에서 긴 하루 조건 (16 시간 등 8 시간 어둠)에 전송할 수 있습니다. 높은 습도를 보장하기 위해 3 일을 위해 냄비에 뚜껑을 둡니다. 이식 여섯 새로운 8cm X 13cm X 5cm 냄비에 모종 및 anoth에 대해 동일한 조건에서 식물 성장 계속이십일일 어. 토양이 전체에 습기가 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 리포터 플라스미드 <ol><li> 제조자의 지시에 따라 DNA 분리 키트를 이용하여 사전에 세균 배양 LUC 리포터 플라스미드 19 : CCA1pro 정제. 참고 : 20 μg의 리포터 플라스미드는 형질 전환을위한 (DH 2 O 2 μg의 / μL에 10 μl를)가 필요합니다. </li></ol></li><li> 솔루션 주 :이 다섯 해결책이 필요한 프로토콜의 경우 : 효소 용액을 워시 5 (W5) 용액, 만니톨 - 마그네슘 (MMG) 용액에, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 수용액 및 이미징 솔루션 (표 1). 원형질체 분리 단계를 계속하기 전에 다음을 준비합니다. <ol><li> 표 1에 따라 효소 용액 10 ㎖를 준비 효소 마지막으로 추가하고, 필터를 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 살균 용액. </li><li> 다음 볼륨에 남아있는 솔루션을 준비 : 15 ml의 W5 용액, 10 ml의 MMG의olution, 1 표 1에 따라 ml의 PEG 용액 1.5 ml의 이미징 솔루션을 제공합니다. 참고 :이 PEG 솔루션은 PEG가 완전히 용해 된 것을 확인하기 위해 형질 전에 시간보다 더 적게 준비하는 것이 중요합니다. 필터는 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 이미징 솔루션 살균. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> 그림 1 :. 원형질체 분리 성인 애기 장대 식물 (A)의 잎은 하부 표피 층 (B)를 향 오토 클레이브 테이프에 고정되어있다. (C) 매직 테이프 부드럽게 15ml의 원뿔형 튜브의 선단과 하부 표피층에 가압된다. (D) 매직 테이프 엽육 세포 (E)를 노출시키기 위해 제거된다. (F) 휴가와 오토 클레이브 테이프의 스트립첨부의이 용액에 원형질체를 방출 효소액 함유 셀룰라아제와 펙 티나​​에 뜨게된다. (G)는 해골 효소 분해 후 오토 클레이브 테이프에 남아 있고 잎은 효소 용액 (H)의 원형질체를 떠나, 삭제됩니다. (I) 최종 결과 엽육의 원형질체 (스케일 바 = 50 μm의). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2. 원형질체 분리 <ol><li> 페트리 접시에 레이블을 10 ml의 필터 살균 효소 솔루션을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 깨끗한 실험실 표면에 접착면이 위로와 오토 클레이브 테이프의 네 개의 스트립을 수정 한 스트립의 배양 접시의 크기를 표시합니다. </li><li> (4 주 오래된 식물 (그림 1a)의 잎을 잘라와 위를 향하도록 하부 표피 표면, 즉 (오토 클레이브 테이프에 상부 표피를 누르십시오 <stroNG&gt; 그림 1b)). </li><li> 조심스럽게 15 ML 원뿔 튜브를 사용하여 하부 표피 표면에 매직 테이프의 스트립을 누릅니다. 잎 조직 (그림 1C)을 분쇄 않도록주의하십시오. 조심스럽게 낮은 표피를 제거하는 마법의 테이프를 떼어 (그림 1D)와 엽육 세포를 (그림 1E)를 노출합니다. </li><li> 페트리 접시에 테이프를 이동하고 효소 용액 (그림 1 층)에 떠있는, 사용 핀셋을 배양 접시에 맞게 오토 클레이브 테이프를 잘라, 아래로 향하게 둡니다. 원형질체이 용액에 출시 될시 60 분을위한 플랫폼 통에 60 rpm으로 회전합니다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 원형질체 (그림 1 시간)을 포함하는 용액을 제거하고 오토 클레이브 테이프 (그림 1g)의 스트립을 폐기하고 피펫 핀셋을 사용합니다. 넓은 구멍 피펫 팁을 (예 : P5000 끝이나 끝과 P1000 팁이 차단 등) 사용합니다. </li><li> 100 ×에서 원형질체를 원심 분리기4 ° C에서 3 분 동안 g 및 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 펠렛은 매우 느슨로,주의하십시오. </li><li> 부드럽게 튜브를 소용돌이 10 ML의 W5의 원형질체에 솔루션에 resuspend을 추가합니다. </li><li> 30 ~ 60 분 동안 얼음에 원형질체를 휴식. 이 단계에서, 혈구 (그림 1I)에 원형질체를 계산하여 수율을 평가합니다. </li><li> 4 ° C에서 3 분 동안 100 × g에서 원심 분리하여 원형질체를 수집하고 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 펠렛은 매우 느슨로,주의하십시오. </li><li> MMG 용액에 5 × 105 원형질체 / ml의 농도로 재현 탁 원형질체. </li></ol> 3. 원형질체 형질 <ol><li> 15 ML 원뿔 관에 10 μl의 리포터 플라스미드 (2 μg의 / μL)를 추가합니다. </li><li> 튜브에 400 ㎕의 원형질체를 추가합니다. </li><li> 하나의 볼륨 (410 μL) PEG 솔루션을 추가하고 원형질체를 형질 부드럽게 12 번 튜브를 반전하여 섞는다. </li><li> 8-15 분 INC 후실온에서 ubation는 4 권 (1640 μL) W5 용액과 원형질체-DNA-PEG 혼합물을 희석하고 부드럽게 여섯 번 반전 섞는다. </li><li> 실온에서 2 분 동안 100 XG에서 원심 분리에 의해 형질 전환 된 원형질체를 수집하고 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 펠렛은 매우 느슨로 다시 한 번,주의하십시오. </li><li> 1250 ㎕의 이미징 솔루션의 원형질체를 재현 탁. </li><li> 육으로 나누어지는 200 μL는 W5 솔루션 빈 우물을 작성 및 발광 영상에 적합한 접착제 명확한 뚜껑 접시를 밀봉, 96 웰 플레이트의 우물을 복제합니다. </li></ol> 4. 이미지 <ol><li> 식물의 이미지에 적합한 임의의 발광 이미지 설정에 접시를 전송합니다. 우물 사이에 응축 압력 차이를 방지하기 위해 전송 후 판 10 ~ 15 분에 접착제 뚜껑을 변경 한 후 촬영을 시작합니다. 플레이트를 실온에서 5 일 동안 모든 ~ 45 분 (3 초 아니라 당) 참조하십시오. 참고 :판의 주파수를 읽고 잘 당 판독 시간은 영상 설정에 따라 달라질 수 있습니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 모든 분석 소프트웨어 (예를 들면, 생체 리듬 분석 소프트웨어 시스템 (BRASS) 22)를 이용하여 발광 결과를 분석한다. 일중 결함을 나타 내기 위해 야생 형 컨트롤 돌연변이 라인을 비교합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기, 우리는 원형질체 분리, 형질 전환 및 luminecent 영상을 포함한 애기 라인의 circadian 기간 결함을 화면에 신속한 분석을 제시한다. 야생형의 일주기 기간 애기 장대와 시계 돌연변이 cca1 / lhy, ZTL 및 CCA1 -ox는 CCA1pro에서 발광 측정으로부터 계산 하였다 : LUC 기자와 더 많은 시간 -를 사용하여 전체 식물에서 생성 된 게시 된 데이터와 일치하는 것으로 소비 형질 전환 방법 (표 2). 애기 돌연변이를 스크리닝이 분석을 사용하여 시간이 걸리고 전용 특정 돌연변이는 야생형 리듬을 나타내는 것으로 밝혀 수도 형질 발광 라인을 생성하도록 초기 조건을 회피한다. 이 프로토콜의 명확한 장점은 애기 장대 라인은 식물의 타임 키핑에 영향을 미치는 많은 유전자의 식별 도움이 될 것 변경된 주기성 전사 리듬을 위해 짧은 시간에 상영 될 수 있다는 것이다. (26, 27)에 도달하도록하는 효소 용액으로 스트립 침투 얇은 스트립 진공으로 잎 또는 모종 절단 포함한다. 후속 소화 효소 용액으로 원형질체를 분리하는 어두운 적어도 3 시간 동안 배양을 필요로한다. 진공 침투가 적용되지 않는 경우 18 시간까지 배양 시간의 최대 권장된다. 효소로 꿰 뚫을 표피 세포층이 테이프에 의해 제거되기 때문에 여기에 제시된 프로토콜에서 진공 함침이 불필요하다. 식물 재료를 절단하여 원형질체를 생성 할 때 이것은 소화 후 세포벽 파편 원형질체로부터 분리 할 필요가있다; 이것은 일반적으로 상기 용액을 여과 또는 당 그라데이션 27,26에 정제가 수행된다. 여기에, 모든 소화되지 않은 조직은 오토 클레이브 테이프 이후에 남아소화 원형질체 여과 설탕 구배 정제를 생략 할 수 있도록. 장기간 protoplasting 절차에 기인하는 응력이 세포 생존 및 주기성 시계에 영향을 미치는 가능성이있다. 여기 시각화 테이프 기반 protoplasting 방법 (20)는 원형질체의 높은 숫자를 산출; 및 주기성 시계열상에서 세포의 생존 능력을 부여하고 원형질체 및 전체 모종 (표 2)의 정합 기간의 길이는 여기에 설명 된 방법은 원형질체를 생성하는 다른 방법에 비해 바람직하다. 프로토콜의 형질 전환 단계는 원형질체의 생존에 미치는 영향 중요한 단계이다. 페그 용액을 세포 내로 전달하는 DNA, 두 배양 시간이 용액에 (단계 3.4) 및 실험적으로 결정되어야한다 PEG의 비율을 가능하게한다. 표준 농도 변환 효율 및 높은 저감 낮은 농도로 20 % 인생존 (28)을 감소 농도. 오분 같은 짧은 배양 시간은 원형질체 (27)의 효율적인 형질 전환을 수득 할 수있다. 원형질체는 어떤 발광 이미징 플랫폼에서 이미지화 할 수있다. 이 비디오에서는, 우리는 높은 처리량 검사 및 자주 측정 할 수 있습니다 (~ 20 μE의 결합 강도에 각각 빨간색과 파란색의 LED, 630 및 470 nm의) 외부 조명이 장착 된 발광 플레이트 리더를 사용하고 있습니다. 조명 광합성 사용할 바와 같은 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 기반 대안 플레이트 리더 나 설정 등의 발광을 검출하고, 다른 촬상 장치는, 긴 똑같이 잘 적용될 수있다. 제어 가능한 캐비닛에 장착 된 CCD 카메라를 사용하는 장점은 가볍고 온도를 프로그래밍 할 수있다. 단점은 교란에 추가하여 원형질체에 스트레스를 일으킬 수 어둠의 장기간을 도입, 긴 캡처 시간내생 계시를 보내고. 에 관계없이 선택 실험하는 플랫폼의 설정을 조정 모종 또는 성숙한 식물에 대한 설정과 비교해야 할 것으로 보인다. 우리의 경험에서 영상 버퍼에 형질 전환 및 / 또는 루시페린 동안 리포터 플라스미드의 농도를 증가시키는 것은 초기 실험에서 발생할 수있는 불규칙하거나 빠르게 둔화 리듬을 해결할 수 있습니다. 미래의 실험에서, 여기에 설명 된 방법은 임의의 돌연변이 애기 라인의 주기성 표현형 연구에 적용될 수있다. 약간의 수정과 함께, 계시에 예를 들어, 다양한 약물의 효과는이 설정에서 연구 할 수있다. 또한, 형질 감염은 또한이 프로토콜의 다양성을 확대 19 유전자 침묵 인공 마이크로 RNA를 포함하도록 수정 될 수있다. 쌀 원형질체를 생성하는 프로토콜 29 잘 확립되어 있으며 여기에 제시된 촬상 프로토콜 동등 우리 U를 더욱 적용될 수있다경제적으로 중요한 단자엽 작물의 시계 nderstanding.

대부분의 생명체는 환경에 대한 매일의 변화를 효율적으로 협상을 돕기 위해 내생 시계를 가지고있다. 이 시계의 일 주기성 시계는 외부 환경에서 예측 가능한 변화를 예측하는 생물의 신진 대사와 생리학의 여러 측면을 조절한다. 4 - 예를 들어 식물에서, 시간적으로 예측 병원균이나 초식 동물의 공격을 예상 강하게 전체 감수성 1을 줄일 수 있습니다. 전분 대사는 긴밀하게 길거나 짧은 하루 조건 5에서 성장 여부를 새벽까지 마지막 전분 매장량을 보장하기 위해 일 주기성 시계에 의해 조절된다. 실제로, 24 시간의 환경 쇼 증가 성장률 일치 주기성 시계 식물, 탄소 고정 률과 생존율 동안 부정합 (6)의 클럭을 실행하는 식물에 비해. 이 모든 과정에서 활동 일주기의 광범위한 영향은 세 번째까지의 리듬 규정에서 크게 발생애기 장대 (7) 총 사체의. 이러한 리듬 유전자 산물이 대사 경로 호르몬 신호 및 스트레스 반응 7 세포 과정을 포함하는 넓은 범위에 포함된다. 그 꼭대기에, 단백질 기능을 직접 주기성 조절이 인산화 8 일주기 규제와 아마 다른 번역 후 변형 (PTMS)에 의해 설정됩니다. 이 매일 전사 재 프로그램을 구동하는 일 주기성 시계의 중심에 / 번역 피드백 아침 발현 유전자를 포함하는 (TTFLs을), 루프 전사의 네트워크 거짓말 발현을 억제 주기성 시계 ASSOCIATED 1 (CCA1) 및 LATE 연장 배축 (LHY) - 11 LUX ARRHYTHMO (LUX), 개화 3 (ELF3), 및 ELF4 9, 저녁 유전자 CAB 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) 저녁 복합체 (EC)의 구성원의 타이밍의. 함께 지혜H 의사 RESPONSE 레귤레이터 -genes (PRR3, 5, 7, 9) EC가 양의 레귤레이터 (12)로서 작용하는 반면, TOC1가 CCA1 / LHY 발현을 억제한다 - 14. TTFL 네트워크 구성 요소의 피드백 메카니즘에 추가적인 전사 후 및 번역 후 조절은 튜닝 활동 일주기에서 중요한 역할을한다. 현재까지, 일 주기성 시계 단백질에 확인 된 가장 풍부한 PTM은 인산화 (15)이다. 카제인 키나제 2 (CK2)에 의해 CCA1의 인산화는 발기인 16을 대상으로 바인딩과 주기성 시계 (17)의 온도 보상을위한 중요한 영향을 미친다. PRR 단백질이 차등 일주기 사이클에 인산화 및 TOC1의 인산화가 부정적인 레귤레이터와의 상호 작용에 영향을 미치는되어, 저녁 - 위상 클럭 구성 요소 ZEITLUPE (ZTL) 18. 이러한 예는 설명 방법을 24 시간에 PTMS 및 단백질 - 단백질 상호 작용을 조정 TTFL 네트워크전사 발진기. 전사 시계 네트워크 및 규제에 대한보다 자세한 소개는, 우수한 최근 리뷰 (예를 들어 기준 15)을 사용할 수 있습니다. 그러나 무엇 불분명 남아있는 것은 리듬 조절 과정과 세포 대사의 다른 측면은 다시 계시 메커니즘 자체에 공급하는 정도입니다. 시계 결함에 대한 애기 장대 돌연변이의 광범위한 선별 메커니즘 또는 신호 전달 경로가 TTFL 네트워크에서 24 시간 리듬의 생성에 관여 할 수있는 더 이해를 얻을 수 있습니다. 이를 위해 김 써머 이전에 어떤 애기 라인 (19)에 시계 기능의 효율적이고 신속한 분석을위한 돌파구 방법을 발표했다. 원형질체의 과도 발현의 사용에 기초하여,이 방법은 안정한 형질 전환 라인에 대한 필요성을 능가 또는 형광 마커 클록 라인에 교차. 여기에, 우리는 높은 항복 원형질체의 isolatio을 시각화최적화 프로토콜과 함께 해당 방법 20 96- 웰 플레이트 판독기에서 일시적으로 발현 클록 마커 발광 이미징에 의해 주기성 결함을 선별한다. 우리는 변경된 활동 일주기를 감지 여기에 성공적으로 설명하는 방법을 확인하기 위해 잘 특성화 시계 돌연변이 체에 야생형 Col- 0 애기을 비교합니다. LUC 19 : CCA1pro,이 라인에서 파생 된 원형질체는 주기성 CCA1 발기인에서 반딧불의 루시 페라을 표현 리포터 구조로 형질된다. 루시퍼 라제는 이러한 원형질체의 기간의 진폭 및 전사 리듬의 위상을 평가 시간이 지남에 이미징되는 광 출사 21 oxyluciferin 루시페린이 전자적으로 여기 된 변환 된 다단계 반응을 촉매. 프로토콜은 세 개의 주요 부분으로 구성된다; 리포터 플라스미드 및 발광 IM로 원형질체를 형질 감염, 원형질체를 분리노화. 이들 세 부분은 항상 새로 제조 완충액 및 시약을 사용하여 매일 수행한다. 식물 성장 및 리포터 플라스미드 충분한 양의 정제를 미리 수행되어야하며, 이러한 프로토콜에서 가시화되지 않는다.

<table><tbody><tr><td>CELLULYSIN Cellulase, &lt;em&gt;Trichoderma viride&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>Merck Millipore</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pectinase R10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Acros Organics</td><td>327765000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>327300010</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fischer Scientific</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td><td>Acros Organics</td><td>434630010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, Firefly</td><td>Biosynth AG</td><td>L-8200</td><td>Dissolve luciferin powder in 0.1 M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50 mM</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9618</td><td></td></tr><tr><td>Comply Steam Indicator Tape</td><td>3M</td><td>1222</td><td></td></tr><tr><td>Magic Tape</td><td>3M</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, 96 well, flat bottom, white</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655075</td><td></td></tr><tr><td>TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates</td><td>Perkin Elmer</td><td>6050195</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 10 ml, w/o needle</td><td>BD Plastipak</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter 0.22 &amp;micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td><td></td><td></td><td>Free download at amillar.org</td></tr><tr><td>QIAfilter Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12262</td><td></td></tr><tr><td>Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell</td><td>Hawksley</td><td>AC6000</td><td></td></tr><tr><td>Bright field microscope</td><td>Optika Microscopes</td><td>B-150POL-B</td><td></td></tr><tr><td>LB942 TriStar&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; multimode reader, with luminescence module</td><td>Berthold Technologies Ltd</td><td>57947/57948</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

야생형 애기 장대의 원형질체 cca1 / lhy (단기간 변이체 2) ZTL (장기간 돌연변이 23)과 과발현 라인 CCA1 -ox가 (24 부정맥) 공지 클럭 돌연변이 비교 하였다. 모두 일시적으로 CCA1pro로 형질했다 : LUC 기자 5 일 동안 플레이트 리더에 일정한 빛 군데. 여기에서 우리는 cca1 / lhy 돌연변이에, 일주기 조절 유전자 발현의 자유 실행 기간이 발광 시계의 안정적인 형질 발현이 2,9 마커 분석 게시 기간과 일치, (그림 2a)를 단축 것을 보여줍니다. ZTL 돌연변이의 원형질체의 일 주기성 진동의주기는 야생형보다 더 긴 (그림 2B), 모종에서 이전에 게시 된 결과에 따라, 세포 현탁액의 cultu입술과 원형질체 19,23,25. CCA1의 과발현은 아침 상에 시계를 고정 및 글로벌 전사는 부정맥 (24)가된다. CCA1의 -ox의 원형질체 (그림 2C)에서 LUC 식 : 지속적으로, 우리는 CCA1pro에는 진동을 관찰합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> 그림 2 : Col- 0, cca1 / lhy, ZTL 및 CCA1의 원형질체 활동 일주기 원형질체 -ox 일시적으로 CCA1pro로 형질 전환 하였다 : LUC는 구성과 발광의 활동 일주기 5 일 동안 몇 군데 있었다 (A - C). (D) 골 -0, cca1 / lhy 및 ZTL에 발광 흔적에 따라 일주기 기간 추정치 (A - B). 나를± SEM은, N = 3-5, 표시 t 테스트 p- 값으로. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 유전자형 </td><td> 기간 (원형질체) </td><td> 기간 (유전자 변형) </td><td> 에 의해보고 : </td><td> 참조 </td></tr><tr><td> Col- 0 </td><td> 23.0 ± 0.21 </td><td> 24.4 ± 0.09 </td><td> pCCA1 : 골에 LUC -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td> cca1 / lhy </td><td> 20.6 ± 0.13 </td><td> 19.9 ± 0.11 </td><td> pCCA1 : 골에 LUC -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ~ 18 </td><td> L 어 배경 RNA </td><td> (9) </td></tr><tr><td&gt; ZTL </td><td> 25.1 ± 0.12 </td><td> 27.4 ± 0.5 </td><td> CAB2 : C24 생태형에 LUC </td><td> (22) </td></tr><tr><td> CCA1 -ox </td><td> 부정맥 </td><td> 부정맥 </td><td> pCCA1 : LUC (LD 데이터 전용) </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 부정맥 </td><td> 골 -0 배경에 RNA와 단백질 </td><td> (23) </td></tr></tbody></table> 표 2 : 형질 전환 모종에 비해 원형질체의 활동 일주기 pCCA1의 일주기 기간 :. 기간의 첫 번째 돌연변이보고 길이와, 가능한 경우와 비교하여 원형질체에 LUC 식 pCCA1과 : 골 -0에 LUC 식입니다.

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Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

주기성 시계는 애기 사체의 제에 대한 규제 만 계시로 피드백 유전자의 비율은 알 수없는 남아 있습니다. 여기에서 우리는 신속하게 일시적으로 원형질체에 표시되는 주기성 기자의 발광 이미지를 사용하여 애기 장대의 돌연변이 라인에서 일주기 표현형을 평가하는 방법을 시각화.

발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.7K 조회수.  University of Edinburgh.  주기성 시계는 애기 사체의 제에 대한 규제 만 계시로 피드백 유전자의 비율은 알 수없는 남아 있습니다. 여기에서 우리는 신속하게 일시적으로 원형질체에 표시되는 주기성 기자의 발광 이미지를 사용하여 애기 장대의 돌연변이 라인에서 일주기 표현형을 평가하는 방법을 시각화. 

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Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

연구

유전학

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to sleep behavior. In vertebrates, circadian rhythm is controlled by a molecular oscillator that functions in both the suprachiasmatic nucleus (SCN; central pacemaker) and individual cells comprising most peripheral tissues. More importantly, disruption of circadian rhythm by exposure to light-at-night, environmental stressors and/or toxicants is associated with increased risk of chronic diseases and aging. The ability to identify agents that can disrupt central and/or peripheral biological clocks, and agents that can prevent or mitigate the effects of circadian disruption, has significant implications for prevention of chronic diseases. Although rodent models can be used to identify exposures and agents that induce or prevent/mitigate circadian disruption, these experiments require large numbers of animals. In vivo studies also require significant resources and infrastructure, and require researchers to work all night. Thus, there is an urgent need for a cell-type appropriate in vitro system to screen for environmental circadian disruptors and enhancers in cell types from different organs and disease states. We constructed a vector that drives transcription of the destabilized luciferase in eukaryotic cells under the control of the human PERIOD 2 gene promoter. This circadian reporter construct was stably transfected into human mammary epithelial cells, and circadian responsive reporter cells were selected to develop the in vitro bioluminescence assay. Here, we present a detailed protocol to establish and validate the assay. We further provide details for proof of concept experiments demonstrating the ability of our in vitro assay to recapitulate the in vivo effects of various chemicals on the cellular biological clock. The results indicate that the assay can be adapted to a variety of cell types to screen for both environmental disruptors and chemopreventive enhancers of circadian clocks.

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

An in vitro bioluminescence assay to determine cellular circadian rhythm in mammary epithelial cells is presented. This method utilizes mammalian cell reporter plasmids expressing destabilized luciferase under the control of the PERIOD 2 gene promoter. It can be adapted to other cell types to evaluate organ-specific effects on circadian rhythm.

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

생물학

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene reporters. This new and easy to use in vivo fluorescence monitoring system was developed to record the transcriptional rhythm of the clock gene, Cry1, in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice. To do so, a Cry1 transcription fluorescence reporter was designed and packaged into Adeno-associated virus. Purified, concentrated virus was injected into the mouse SCN followed by the insertion of an optic fiber, which was then fixed onto the surface of the brain. The animals were returned to their home cages and allowed a 1-month post-operative recovery period to ensure sufficient reporter expression. Fluorescence was then recorded in freely moving mice via an in vivo monitoring system that was constructed at our institution. For the in vivo recording system, a 488 nm laser was coupled with a 1 &#215; 4 beam-splitter that divided the light into four laser excitation outputs of equal power. This setup enabled us to record from four animals simultaneously. Each of the emitted fluorescence signals was collected via a photomultiplier tube and a data acquisition card. In contrast to the previous bioluminescence in vivo circadian clock recording technique, this fluorescence in vivo recording system allowed the recording of circadian clock gene expression during the light cycle.

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This newly developed fluorescence-based technology enables long-term monitoring of the transcription of circadian clock genes in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice in real-time and at a high temporal resolution.

Vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 Suprachiasmatic 핵에서 Circadian 시계 유전자 발현의 모니터링

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

신경과학

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Analysis of Circadian Photoresponses in Drosophila Using Locomotor Activity

Circadian rhythms are only beneficial to animals if they can be synchronized by changes of ambient conditions. Light and temperature are two dominant environmental parameters that synchronize animal circadian clocks. In Drosophila circadian photo-responses are mediated by a solely blue light photoreceptor named CRYPTOCHROME (CRY). Upon photoreception, CRY changes its conformation and initiates the proteosomal dependent degradation of TIMELESS (TIM). TIM is an important pacemaker protein, thus degradation of TIM will reset the circadian clock. Under constant light conditions (LL), wild type flies quickly become arrhythmic because of the constant degradation of TIM, while flies bearing defects with circadian photo-responses will still be rhythmic. Thus LL triggered arrhythmicity has been used for screening of components in circadian light input pathways. A brief short light pulse in the night can also dramatically shift phases of circadian rhythms. As expected, this phase shift response is reduced in flied with defects in circadian photoresponse. Thus analyzing locomotion behavior rhythmicity under LL or phase changes after short light pulse in constant darkness (DD) are two major methods to study circadian photoresponse. Here we describe how to design and analyze LL and phase response experiments. LL arrhythmicity is suitable for screening light input pathways mutants, whereas phase response validates the results and provide further information for light sensitivity.

Drosophila locomotor activity is a robust and quantitative measurement of circadian photo-responses. We describe protocols for designing behavior experiments for circadian photo-responses and analyzing the data. Studying the circadian photo-responses is important for dissecting the neuronal and molecular mechanisms of light entrainment.

Circadian rhythms are only beneficial to animals if they can be synchronized by changes of ambient conditions. Light and temperature are two dominant ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In circadian rhythms research, for example, clock gene fusions with firefly luciferase give rise to robust rhythms in cellular bioluminescence that persist over many days. Technical limitations associated with photomultiplier tubes (PMT) or conventional microscopy-based methods for bioluminescence quantification have typically demanded that cells and tissues be maintained under quite non-physiological conditions during recording, with a trade-off between sensitivity and throughput. Here, we report a refinement of prior methods that allows long-term bioluminescence imaging with high sensitivity and throughput which supports a broad range of culture conditions, including variable gas and humidity control, and that accepts many different tissue culture plates and dishes. This automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) also allows the observation of spatial variations in luciferase expression across a cell monolayer or tissue, which cannot readily be observed by traditional methods. We highlight how the ALLIGATOR provides vastly increased flexibility for the detection of luciferase activity when compared with existing methods.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetically encoded luciferase is a popular non-invasive reporter of gene expression. Use of an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) enables longitudinal recording from bioluminescent cells under a wide range of conditions. Here we show how ALLIGATOR may be used in the context of circadian rhythms research.

자동된 경도 Luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

일주기 리듬 연구를 위한 인간 장 장내 생물 최적화

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse repertoire of cellular and physiological processes ranging from sleep-wake cycles to metabolism. This clock mechanism entrains the organism based on environmental changes and coordinates the temporal regulation of molecular and physiological events. Previously, it was demonstrated that autonomous circadian rhythms are maintained even at the single-cell level using cell lines such as NIH3T3 fibroblasts, which were instrumental in uncovering the mechanisms of circadian rhythms. However, these cell lines are homogeneous cultures lacking multicellularity and robust intercellular communications. In the past decade, extensive work has been performed on the development, characterization, and application of 3D organoids, which are in vitro multicellular systems that resemble in vivo morphological structures and functions. This paper describes a protocol for detecting circadian rhythms using a bioluminescent reporter in human intestinal enteroids, which enables the investigation of circadian rhythms in multicellular systems in vitro.

저자 스포트라이트: In vitro Investigations of Circadian Rhythms in Multicellular Systems(다세포 시스템의 일주기 리듬에 대한 시험관 내 조사)

Circadian rhythms, which exist in most organisms, regulate the temporal organization of biological processes. 3D organoids have recently emerged as a physiologically relevant in vitro model. This protocol describes the use of bioluminescent reporters to observe circadian rhythms in organoids, enabling in vitro investigations of circadian rhythms in multicellular systems.

Organoids에서 Bioluminescence Reporter를 사용한 Circadian Oscillations 모니터링

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...

발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석

요약

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이 비디오의 챕터

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana

Vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 Suprachiasmatic 핵에서 Circadian 시계 유전자 발현의 모니터링

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

Analysis of Circadian Photoresponses in Drosophila Using Locomotor Activity

자동된 경도 Luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정

Organoids에서 Bioluminescence Reporter를 사용한 Circadian Oscillations 모니터링

Organoids에서 Bioluminescence Reporter를 사용한 Circadian Oscillations 모니터링