We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).

HINWEIS: In diesem Protokoll, Reagenzien und Volumina beschrieben werden pro Arabidopsis Linie ausgedrückt, die getestet wird, und in sechs Wiederholungsvertiefungen für diesen Genotyp führt. Multiplizieren die Materialien mit der Anzahl der Zeilen analysiert werden, wenn mehr als eine Zeile zu analysieren. In dem Video wird Wildtyp - Arabidopsis auf die innere Uhr Mutantenlinie ztl verglichen werden (obwohl repräsentative Ergebnisse von weiteren Leitungen werden anschließend zur Verfügung gestellt werden). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Enzymlösung </td><td></td></tr><tr><td> Zellulase </td><td> 0,5% (w / v) </td></tr><tr><td> Pectinase R10 </td><td> 0,25% (w / v) </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> W5 - Lösung </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> MMg Lösung </td><td></td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 15 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG - Lösung </td><td></td></tr><tr><td> PEG4000 </td><td> 40% (w / v) </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td&gt; <td> 100 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Imaging - Lösung </td><td></td></tr><tr><td> W5-Lösung </td><td> zum Endvolumen </td></tr><tr><td> Fetales Kälberserum </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> Luciferin </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> 50 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Liste der Lösungen. 1. Herstellung von Materialien und Puffer <ol><li> Pflanzenmaterialien <ol><li> Halten Sie Arabidopsis Col -0 Samen in Wasser in einem 1,5 - ml - Röhrchen bei 4 ° C im Dunkeln für vier Tage. Pipette, um die Samen auf dem Boden kommen in einen Topf geben und Transfer zum Langtagsbedingungen (16 Stunden Licht 8 Stunden Dunkelheit) bei 21 ° C für 7 Tage. Lassen Sie einen Deckel auf den Topf für die ersten drei Tage mit hoher Luftfeuchtigkeit zu gewährleisten. Transplantations sechs Sämlinge zu einem neuen 8 cm x 13 cm x 5 cm Topf und weiterhin die Pflanzen unter den gleichen Bedingungen für anoth wächster 21 Tage. Stellen Sie sicher, dass der Boden feucht ist im gesamten Gebäude. </li></ol></li><li> Reporterplasmid <ol><li> Reinige den CCA1pro: LUC - Reporterplasmid 19 aus Bakterienkultur im Voraus, eine DNA - Extraktions - Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . HINWEIS: 20 &amp; mgr; g Reporterplasmid erforderlich ist (10 &amp; mgr; l bei 2 ug / ul in dH 2 O) für eine Transfektion. </li></ol></li><li> Lösungen HINWEIS: Für dieses Protokoll fünf Lösungen benötigt werden: Enzymlösung, Wasch 5 (W5) Lösung, Mannitol-Magnesium (MMG) Lösung, Polyethylenglykol (PEG) -Lösung und Imaging - Lösung (Tabelle 1). Bereiten Sie diese, bevor auf die Isolierung von Protoplasten Schritt weiter. <ol><li> Herstellung von 10 ml der Enzymlösung gemäß Tabelle 1, wobei sich die Enzyme letzten, und Filtern der Lösung durch einen 0,22 um - Spritzenfilter sterilisieren. </li><li> Bereiten Sie die verbleibenden Lösungen in folgenden Volumina: 15 ml W5-Lösung, 10 ml MMg solution, 1 ml PEG - Lösung und 1,5 ml Imaging - Lösung gemäß Tabelle 1. Hinweis: Es ist wichtig, dass die PEG-Lösung nicht weniger hergestellt wird, als eine Stunde vor der Transfektion, um sicherzustellen, dass das PEG vollständig aufgelöst hat. Filter sterilisieren die Imaging-Lösung durch einen 0,22 &amp; mgr; m Spritzenfilter. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> Abb . 1: Isolierung von Protoplasten Die Blätter von erwachsenen Arabidopsis - Pflanzen (A) auf Autoklav Band fixiert mit der unteren epidermalen Schicht nach oben (B). (C) Magic Tape auf die untere Schicht der Epidermis mit der Spitze eines 15 ml konischen Röhrchen sanft gepresst. (D) Das magische Band wird entfernt , um die Mesophyllzellen (E) zu belichten. (F) Streifen des Autoklaven Band mit Urlaubs gebunden sind, auf die Enzymlösung, die Cellulase und Pektinase, schwebte Protoplasten in die Lösung freizusetzen. (G) Die Blatt Skelette auf Autoklaven Band bleiben , nachdem Enzym die Verdauung und werden verworfen, die Protoplasten in Enzymlösung verlassen (H). (I) Endgültige resultierende Mesophyll - Protoplasten (Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Isolierung von Protoplasten <ol><li> Beschriften Sie eine Petrischale und 10 ml Filter-sterilisierte Enzymlösung. </li><li> Fix vier Streifen Autoklav-Band mit der klebrigen Seite auf einer sauberen Laborfläche nach oben, und die Größe der Petrischale Markierung auf dem Streifen. </li><li> Schneiden Sie Blätter von 4-Wochen alten Pflanzen (Abbildung 1a), und drücken Sie die obere Epidermis auf den Autoklaven Band (dh der unteren epidermalen Seite nach oben ( <strong&gt; Abbildung 1b)). </li><li> Drücken Sie vorsichtig Streifen Magic Tape auf die untere epidermalen Oberfläche eine 15 ml konischen Röhrchen mit. Achten Sie darauf , nicht in das Blattgewebe (Abbildung 1c) zu vernichten. Vorsichtig die magische Klebeband abziehen die unteren Epidermis (Abbildung 1d) abzustreifen und Mesophyll - Zellen (1e) aus. </li><li> Schneiden Sie den Autoklaven Band der Petrischale, mit Hilfe einer Pinzette zu bewegen , um das Band in die Petrischale und schwimmen auf der Enzymlösung (Abbildung 1f) zu passen, verlässt nach unten zeigt . Drehen, bei 60 Umdrehungen pro Minute auf einem Plattformschüttler für 60 min, während der die Protoplasten werden in die Lösung freigesetzt werden. </li><li> Pinzette benutzen zu entfernen und die Streifen des Autoklaven Band (1g) zu verwerfen und die Lösung pipettiert werden die Protoplasten (Figur 1h) in ein 50 ml konisches Röhrchen enthält. Verwenden Sie eine breite Bohrung Pipettenspitze (wie ein P5000 Spitze oder ein P1000 Spitze mit dem Ende abgeschnitten). </li><li> Zentrifugieren Sie die Protoplasten bei 100 xg für 3 min bei 4 ° C und der Überstand mit einer Pipette entfernen. Achten Sie darauf, wie das Pellet sehr lose ist. </li><li> 10 ml W5-Lösung zu den Protoplasten und resuspendieren durch das Rohr sanft wirbeln. </li><li> Rest ist die Protoplasten auf Eis für 30-60 min. In diesem Schritt beurteilt Ausbeute von Protoplasten in einem Hämozytometer (1I) zu zählen. </li><li> Sammle die Protoplasten durch Zentrifugation bei 100 x g für 3 min bei 4 ° C und entfernt den Überstand mit einer Pipette. Achten Sie darauf, wie das Pellet sehr lose ist. </li><li> Resuspendieren der Protoplasten zu einer Konzentration von 5 x 10 5 Protoplasten / ml in MMg Lösung. </li></ol> 3. Protoplasten Transfection <ol><li> Fügen Sie 10 &amp; mgr; l Reporter-Plasmid (2 ug / ul) zu einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> In 400 ul Protoplasten auf das Rohr. </li><li> Fügen Sie ein Volumen (410 ul) PEG-Lösung und mischen durch das Rohr sanft 12-maliges Umdrehen der Protoplasten zu transfizieren. </li><li> Nach 8-15 min incubation bei Raumtemperatur, verdünnt das Protoplasten-DNA-PEG-Mischung mit vier Bänden (1640 ul) W5-Lösung und mischen durch vorsichtiges sechsmal umgekehrt wird. </li><li> Sammeln Sie die transfizierten Protoplasten durch Zentrifugation bei 100 × g für 2 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wieder einmal vorsichtig, denn das Pellet sehr lose ist. </li><li> Resuspendieren der Protoplasten in 1250 ul Imaging-Lösung. </li><li> Aliquot 200 ul in sechs replizieren Wells einer 96-Well-Platte, füllen Sie alle leeren Brunnen mit W5-Lösung und versiegeln Sie die Platte mit einem Klebstoff klaren Deckel geeignet für Leucht Bildgebung. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Übertragen Sie die Platte zu jeder Leucht Imaging Einrichtung geeignet für Pflanzen Bildgebung. Ändern Sie die Klebe Deckel auf den Platten 10-15 Minuten nach der Übertragung Kondensation und Druckdifferenzen zwischen den Vertiefungen zu vermeiden, dann Imaging starten. Lesen Sie alle die Platte ~ 45 min (3 sec pro Vertiefung) für fünf Tage bei Raumtemperatur. Beachten Sie dasHäufigkeit der Platte liest und die Lesezeit pro Vertiefung könnte auf dem Imaging-Setup abhängig. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Analysieren Sie die Lumineszenz Ergebnisse , eine Analyse - Software (zB Biologische Rhythmen Analyse - Software - System (BRASS) 22). Vergleichen Sie die Mutantenlinie zu Wildtyp-Kontrollen circadian Mängel aufzudecken. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Hier stellen wir einen schnellen Test zirkadianen Zeitraum Defekte in Arabidopsis Linien zu ermitteln, einschließlich der Isolierung von Protoplasten, Transfektion und luminecent Bildgebung. Die zirkadiane Periode in Wildtyp - Arabidopsis und die Uhr - Mutanten CCA1 / lhy, ztl und CCA1 -OX wurde aus Messungen der Lumineszenz von einem CCA1pro berechnet: LUC Reporter und fand aus ganzen Pflanzen zeit- erzeugt mit den veröffentlichten Daten konsistent zu sein raubend transgene Ansätze (Tabelle 2). Unter Verwendung dieses Assays Arabidopsis-Mutanten zu screenen, vermeidet die anfängliche Anforderung transgener Leuchtlinien zu erzeugen, was zeitaufwendig ist und möglicherweise nur zeigen, dass eine bestimmte mutierte Wildtyp-Rhythmen aufweist. Ein klarer Vorteil dieses Protokolls ist , dass jede Arabidopsis Linie in kurzer Zeit für veränderte zirkadianen Rhythmen Transkriptions gescreent werden können, die die Identifizierung von mehreren Genen in Pflanzen helfen beeinflussen Zeitnehmung. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Isolierung von Protoplasten kann mühsam sein, vor allem, wenn die mutierte Linie einen Schatten gestellt Phänotyp zeigt. Zuvor berichteten Verfahren für Protoplasten Erzeugung umfassen Blätter oder Sämlinge in dünne Streifen und Vakuum Schneiden der Streifen mit Enzymlösung infiltriert die Enzyme zu ermöglichen , um die Zellwände 26,27 erreichen. Die anschließende Verdauung erfordert mindestens 3 h Inkubation im Dunkeln die Protoplasten in die Enzymlösung zu lösen. Bei Vakuuminfiltration nicht angewendet wird, sollte die Inkubationszeit bis zu 18 Stunden wird empfohlen. In dem Protokoll hier vorgestellten ist nicht notwendig, Vakuuminfiltration, weil die Epidermiszellschicht undurchdringlich für die Enzyme durch ein Band entfernt wird. Wenn Protoplasten durch Schneiden Pflanzenmaterial zu erzeugen ist es notwendig, getrennte Protoplasten aus Zellwandtrümmer nach der Verdauung; Dies wird typischerweise durch Filtrieren der Lösung oder Reinigung auf einem Zucker Gradienten 27,26 erfolgen. Hier wird jede unverdauten Gewebe auf dem Autoklaven Band bleiben nachVerdauung, so Filtration und Zucker Gradientenreinigung der Protoplasten verzichtet werden kann. Es gibt eine Chance, dass die Belastung aus längeren Protoplastierung Verfahren die Lebensfähigkeit der Zellen und die innere Uhr beeinflusst. Das bandbasierte Protoplastierung Verfahren 20 visualisiert hier ergibt sich eine hohe Anzahl von Protoplasten; und die Lebensfähigkeit der Zellen über einen zirkadianen Zeitreihe gegeben und die Anpassungsperiodenlängen von Protoplasten und ganzen Sämlingen (Tabelle 2), die hier beschriebene Methode wird über alternative Verfahren bevorzugt Protoplasten zu erzeugen. Der Transfektionsstufe des Protokolls ist ein wichtiger Schritt, dass die Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Protoplasten. Die PEG-Lösung kann die DNA in die Zelle geliefert werden, und beide Inkubationszeit in dieser Lösung (Schritt 3.4), und den Prozentsatz der PEG sollte empirisch bestimmt werden. Die Standardkonzentration beträgt 20%, mit geringeren Konzentrationen die Transformationseffizienz zu reduzieren und eine höhereKonzentrationen Lebensfähigkeit reduziert 28. Die Inkubationszeit so kurz wie 5 Minuten konnten effiziente Transfektion der Protoplasten 27 ergeben. Die Protoplasten können auf jeder Leucht Imaging-Plattform abgebildet werden. In diesem Video haben wir einen Lumineszenz-Plattenleser ausgestattet mit Außenbeleuchtung (rot und blauen LEDs, 630 und 470 nm, jeweils bei einer kombinierten Intensität von ~ 20 &amp; mgr; E) verwendet, die für die Hochdurchsatz-Screening und häufige Messungen ermöglicht. Andere Bildgebungsgeräte, die Lumineszenz, wie beispielsweise alternative Plattenleser oder Setups um eine ladungsgekoppelte Vorrichtung (CCD) Kamera basierend erkennt, könnte genauso gut so lange angewendet werden, wie Beleuchtung für die Photosynthese zur Verfügung steht. Der Vorteil der Verwendung einer CCD-Kamera auf einem steuerbaren Schrank montiert ist, dass Licht und Temperatur programmiert werden können. Ein Nachteil ist die längere Aufnahmezeit, die Einführung längere Zeiträume der Finsternis, die Stress zu den Protoplasten zusätzlich dazu führen können, störening endogene Zeitnehmung. Unabhängig davon, welche experimentelle Plattform gewählt wird, die Anpassung der Einstellungen ist wahrscheinlich notwendig sein, im Vergleich zu Einstellungen für Sämlinge oder reifen Pflanzen. Nach unserer Erfahrung bei der Transfektion und / oder Luciferin in dem Abbildungspuffer die Konzentrationen von Reporterplasmid Erhöhung könnte keine erratischen oder schnell dämpfen Rhythmen beheben, das in ersten Experimenten auftreten könnten. In zukünftigen Experimenten kann die hier beschriebene Methode angewendet, um die zirkadianen Phänotyp jeder Mutante von Arabidopsis Linie zu studieren. Mit geringfügigen Modifikationen könnte die Wirkung von zB verschiedene Medikamente auf timekeeping in diesem Setup untersucht werden. Darüber hinaus kann die Transfektion modifiziert werden , um Gen künstliche microRNA enthalten 19 zum Schweigen zu bringen, die Vielseitigkeit dieses Protokolls zu erweitern. Protokolle Reisprotoplasten zu erzeugen , sind gut etablierte 29 und das Bildgebungsprotokoll hier vorgestellten könnte gleichermaßen angewendet werden unsere u zu fördernERSTÄNDIGUNG der Uhr in wirtschaftlich wichtigen monokotylen Kulturpflanzen.

Die meisten lebenden Organismen besitzen ein endogenes Zeitnehmer effiziente Vermittlung von täglichen Änderungen der Umwelt zu unterstützen. Dieser Zeitnehmer, der zirkadianen Uhr reguliert viele Aspekte des Stoffwechsels und der Physiologie eines Organismus vorhersagbare Änderungen der äußeren Umgebung zu antizipieren. Bei Pflanzen zum Beispiel Vorgriff auf zeitlich vorhersehbar Erreger oder Pflanzenfresser Angriffe stark reduziert Gesamt Anfälligkeit 1 bis 4. Stärkemetabolismus ist eng durch die innere Uhr reguliert zuletzt bis zum frühen Morgen , dass Stärke Reserven , um sicherzustellen , ob 5 bei langen oder kurzen Tag Bedingungen gezüchtet. Tatsächlich Pflanzen, mit Zirkadianrhythmen die 24 - Stunden - Umgebung zeigen eine erhöhte Wachstumsraten passende, Kohlenstofffixierung Raten und Überlebensraten auf Pflanzen verglichen 6 eine Uhr nicht passender Zeit läuft. Den starken Einfluss der zirkadianen Rhythmen in allen diesen Verfahren entsteht zu einem großen Teil von der rhythmischen Regulierung von bis zu einem Drittelder gesamten Transkriptom in Arabidopsis 7. Diese rhythmische Genprodukte werden in einem breiten Spektrum von zellulären Prozessen einschließlich Stoffwechselwege, Hormonsignalisierung und Stressreaktionen beteiligt 7. Hinzu kommt, dass, wird durch zirkadianen Regulation der Phosphorylierung 8 und höchstwahrscheinlich andere post-translationale Modifikationen (PTM) direkt circadian Regulierung der Proteinfunktion etabliert. In der Mitte des zirkadianen Uhr , die diese tägliche Transkriptions Umprogrammierung treibt liegt ein Netz von Transkriptions / Translations - Feedback - Schleifen (TTFLs), einschließlich der Morgen-exprimierte Gene zirkadianen Uhr ASSOCIATED 1 (CCA1) und LATE ELONGATED Hypokotyls (LHY), die die Expression unterdrücken des abends Gene ZEITPUNKT dER CAB 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) und die Mitglieder des abends Komplex (EG); LUX ARRHYTHMO (LUX), frühe Blüte 3 (ELF3) und ELF4 9 bis 11. Zusammen Witzh die PSEUDO RESPONSE REGLER -genes (PRR3, 5, 7 und 9), reprimiert TOC1 CCA1 / LHY - Expression während der EG wirkt als positiver Regulator 12 bis 14. Zusätzlich zur Rückkopplungsmechanismen, post-transkriptionale und post-translationalen Regulation der TTFL Netzkomponenten spielt eine wichtige Rolle bei der Abstimmung zirkadianen Rhythmen. Bis heute ist die am häufigsten vorkommende PTM auf zirkadianen Uhr Proteine ​​identifiziert ist Phosphorylierung 15. Die Phosphorylierung von CCA1 von Casein Kinase 2 (CK2) wirkt sich auf seine Bindung 16 Veranstalter zum Ziel und ist wichtig für die Temperaturkompensation des zirkadianen Uhr 17. Die PRR Proteine ​​werden unterschiedlich über den zirkadianen Zyklus phosphoryliert, und die Phosphorylierung von TOC1 wirkt Wechselwirkung mit seinem negativen Regulator, der Abend-Phasen - Taktkomponente Zeitlupe (ZTL) 18. Diese Beispiele zeigen, wie PTMs und Protein-Protein-Wechselwirkungen tune das TTFL Netzwerk in eine 24-Stunden-Transkriptions Oszillators. Für eine detaillierte Einführung in die Transkriptions Clock - Netzwerk und dessen Regulation sind ausgezeichnet jüngsten Bewertungen verfügbar (zB Referenz 15). Doch was bleibt weniger klar ist, inwieweit die rhythmisch geregelte Prozesse und andere Aspekte des Zellstoffwechsels selbst zurück in den Zeitmessungsmechanismus zuzuführen. Umfangreichen Screening von Arabidopsis-Mutanten zur Taktfehler könnten gewinnen weiteres Verständnis, welche Mechanismen oder Signalwege könnte in der Erzeugung von 24 Stunden Rhythmen von einem TTFL Netzwerk eingebunden werden. Zu diesem Zweck Kim und Somers veröffentlichte zuvor ein Durchbruch Verfahren für die effiziente und schnelle Analyse von Takt - Funktion in jeder Arabidopsis Linie 19. Basierend auf der Verwendung von transienten Expression in Protoplasten übertrifft diese Methode die Notwendigkeit für einen stabilen transgenen Linien oder kreuzt, um lumineszente Taktmarkierungslinien. Hier visualisieren wir eine ertragreiche Protoplasten isolation Verfahren 20 mit einer optimierten Protokolls kombiniert circadian Defekte zu screenen durch lumineszente Bildgebung von transient exprimierten Taktmarkierungen in einer 96-Well - Plattenlesegerät. Wir werden gut charakterisierte Uhr Mutanten Wildtyp Col- 0 Arabidopsis vergleichen die Methodik hier erfolgreich erkennt veränderten Tagesrhythmus beschrieben zu bestätigen. Die Protoplasten aus diesen Linien abgeleitet sind mit einem Reporterkonstrukt transfiziert , das Glühwürmchen - Luciferase aus dem zirkadianen CCA1 Promotor exprimiert; CCA1pro: LUC 19. Luciferase katalysiert die mehrstufige Reaktion , in der Luciferin umgewandelt wird elektronisch angeregten Oxyluciferin dass Licht 21 emittiert, die über die Zeit abgebildet wird die Periode, die Amplitude und Phase der Transkriptions Rhythmen in diesen Protoplasten zu beurteilen. Das Protokoll besteht aus drei Hauptteilen; der Protoplasten zu isolieren, die Protoplasten mit dem Reporter-Plasmid transfizieren und Leucht imAltern. Diese drei Teile sollten immer an einem einzigen Tag durchgeführt werden, unter Verwendung von frisch hergestellten Puffer und Reagenzien. Pflanzenwachstum und Reinigung von ausreichenden Mengen an Reporterplasmid sollten im Voraus durchgeführt werden und sind in diesem Protokoll visualisiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride&#160;</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>219466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectinase R10</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327765000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>434630010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Firefly</td>
			<td>Biosynth AG</td>
			<td>L-8200</td>
			<td>Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comply Steam Indicator Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>819-1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>SLS2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96 well, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6050195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 ml, w/o needle</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>302188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 &#181;m</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download at amillar.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAfilter Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>AC6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Optika Microscopes</td>
			<td>B-150POL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module</td>
			<td>Berthold Technologies Ltd</td>
			<td>57947/57948</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

Die Protoplasten von Wildtyp - Arabidopsis wurden zu den bekannten Takt Mutanten im Vergleich CCA1 / lhy (kurze Zeit Mutante 2), ztl (lange Zeit Mutante 23), und die Überexpression Linie CCA1 -OX (24 arrhythmic). LUC Reporter und bebildert in konstantes Licht auf einem Plattenleser über 5 Tage: Alle wurden mit dem CCA1pro transient. Hier zeigen wir , dass in der CCA1 / lhy Mutante, die Freilaufzeit von circadian gesteuerte Genexpression verkürzt wird (Abbildung 2a), in Übereinstimmung mit der veröffentlichten analysierten Zeitraum von stabilen transgenen Expression von Leuchttaktmarkierungen 2,9. Die Periode der zirkadianen Schwingungen in Protoplasten der ZTL - Mutante ist länger als in Wildtyp (2b), in Übereinstimmung mit den zuvor veröffentlichten Ergebnissen aus Sämlingen, Zellsuspension cultures und Protoplasten 19,23,25. Die Überexpression von CCA1 sperrt die Uhr in Morgen-Phase und der globalen Transkription wird arrhythmic 24. Konsequent beobachteten wir keine Schwingungen in CCA1pro: LUC - Expression in CCA1 -OX Protoplasten (Abbildung 2c). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> Abbildung 2: Protoplasten Circadian Rhythms Protoplasten von Col- 0, CCA1 / lhy, ztl und CCA1 -OX transient mit dem CCA1pro umgewandelt wurden: LUC - Konstrukt und zirkadianen Rhythmen in Lumineszenz wurden über 5 Tage abgebildet (A - C). (D) Circadian Zeitraum Schätzungen basieren auf Lumineszenz Spuren in Col -0, CCA1 / lhy und ZTL (A - B). Micheine ± SEM, n = 3-5, t-Test p-Wert , wie angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotyp </td><td> Period (Protoplasten) </td><td> Periode (transgene) </td><td> Berichtet von: </td><td> Referenzen </td></tr><tr><td> Col- 0 </td><td> 23,0 ± 0,21 </td><td> 24,4 ± 0,09 </td><td> pCCA1: LUC in Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td> CCA1 / lhy </td><td> 20,6 ± 0,13 </td><td> 19,9 ± 0,11 </td><td> pCCA1: LUC in Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ~ 18 </td><td> RNA in L er Hintergrund </td><td> (9) </td></tr><tr><td&gt; ztl </td><td> 25,1 ± 0,12 </td><td> 27,4 ± 0,5 </td><td> CAB2: LUC in Ökotyp C24 </td><td> (22) </td></tr><tr><td> CCA1 -OX </td><td> arrhythmic </td><td> arrhythmic </td><td> pCCA1: LUC (LD nur Daten) </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> arrhythmic </td><td> RNA und Protein in Col -0 Hintergrund </td><td> (23) </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Circadian Rhythms in Protoplasten im Vergleich zu transgenen Keimlinge Die zirkadiane Periode von pCCA1. LUC - Expression in Protoplasten im Vergleich zu den Periodenlängen zunächst für die Mutation berichtet und, falls vorhanden, mit pCCA1: LUC - Expression in Col -0.

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Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

Die innere Uhr reguliert etwa ein Drittel der Arabidopsis Transkriptom, aber der Prozentsatz der Gene, die zurück in die Zeitnahme ernähren bleibt unbekannt. Hier visualisieren wir eine Methode, um schnell circadian Phänotypen in jeder Mutantenlinie von Arabidopsis beurteilen mit lumineszenten Bildgebung eines zirkadianen Reporter vorübergehend in Protoplasten ausgedrückt.

Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Aufrufe.  University of Edinburgh.  Die innere Uhr reguliert etwa ein Drittel der Arabidopsis Transkriptom, aber der Prozentsatz der Gene, die zurück in die Zeitnahme ernähren bleibt unbekannt. Hier visualisieren wir eine Methode, um schnell circadian Phänotypen in jeder Mutantenlinie von Arabidopsis beurteilen mit lumineszenten Bildgebung eines zirkadianen Reporter vorübergehend in Protoplasten ausgedrückt. 

Serie: Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Forschung

Biologie

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-dip Transformation von Arabidopsis thaliana Zum Untersuchen PTSO2: β-Glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Design und Analyse des Temperaturpräferenzverhaltens und seines circadianen Rhythmus in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

Quantifizierung der Orofacial Phänotypen in<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.