This work was supported by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is the recipient of the Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.

<ol>
	<li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis.">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li><li>Baxter, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+application+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominant+T-cell+epitopes+of+MOG+reside+in+its+transmembrane+and+cytoplasmic+domains+in+EAE.">Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22 (2014).</li><li>Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. 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Molecular Cloning.</a> J Vis Exp. , (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , (2016).</li><li>Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+additives+on+protein+aggregation.">Effect of additives on protein aggregation.</a> Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).</li><li>Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+approach+to+improving+large-scale+production+of+tobacco+etch+virus+protease.">A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease.</a> Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

ここでは、MOG タグタンパク質および方法MOG タグタンパク質から純粋MOG 1-125を生成するための製造のためのプロトコルを記載しています。このプロトコルは、両方の標準的なHisタグベースのタンパク質精製方法、ならびに古いMOGベースのタンパク質15の世代のために以前に記載されたプロトコルに基づいています。それはここで説明されていないが、MOG タグタンパク質の主な用途は、タンパク質抗原での免疫を介してEAEを誘導することです。 EAEは、MOG タグタンパク質と互換性のあるマウスに誘導される様子を説明するプロトコルは、参考文献3に記載されています。我々は以前MOG タグ由来MOG タグまたはMOG 1-125での免疫がないだけで、標準のMOG 35-55ペプチドと比較して大きく、脊髄の炎症および脱髄とCNS自己免疫疾患だけでなく、その病原性のIgH MOG B細胞股関節を誘導することを実証していますT MOGタンパク質を認識すると、MOG タグまたはMOG 1-125に応答して胚中心応答を生成するように活性化されるが、35-55 5 MOGしません。したがって、MOG タグを用いた免疫は、確かに適切な抗MOG B細胞応答を誘導ありません。 MOG タグタンパク質は、（Hisタグを介して）の荷電ニッケル樹脂への吸着および溶出により精製されます。そのため、前のステップで生成されたタンパク質の大量の、吸収および溶出の複数のラウンドは、タンパク質の大部分を収集するために必要とされます。我々は、少なくとも4回、50 mlチューブ用樹脂の適切な量を使用する場合、タンパク質の大部分を分離する必要があることを発見しました。所望の場合、プロトコルは、吸収のラウンドの数を減らすために、より以上の管、さらにニッケル樹脂を用いることがスケールアップすることができます。あるいは、ニッケルカラムでの高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を効果的にHisタグ-タンパク質18 &lt;精製することができます/ SUP&gt;と確かに我々は、HPLCを効率的にMOG タグタンパク質（未発表の観察）を精製することができることを見出しました。 HPLCは、多くの標準的な免疫学の研究室にアクセスできないように、ここに記載されているプロトコルは、一般的な実験装置を使用して実行されるように設計されています。 hisタグの精製に加えて、MOG タグタンパク質は、14を好みに応じてS-タグ精製プロトコルと互換性のあるS-タグを含んでいます。 MOG（主に、ヒトまたはラット）に基づいて、組換えタンパク質を8以前に記載されています。これらは、以降、 大腸菌におけるタンパク質の大量を生産することができる強力な転写プロモーターによって駆動されるシステムに置き換えられている旧式の発現系に基づいていました。私たちのMOG タグ発現系は、MOGタンパク質19の内製のために利用可能なシステムよりもかなり効率的であるPET-32A（+）ベクター、で効率的なT7プロモーターを使用しています。しかし、よhouldは、ここで説明MOG タグタンパク質をマウスMOGに基づいていることに留意す。ヒトMOGタンパク質による免疫化は、マウスMOG 8を用いて誘導する疾患とは異なる特徴を有するマウスにおいてEAEを誘導することが示されています。さらに、ラットMOGは、いくつかの例20のマウスにおけるマウスMOGよりも免疫原性であり得ます。したがって、いくつかの実験的な目的のためにマウスベースMOG タグは理想的ではないかもしれません。私たちはより良いいくつかの目的に合うことができ、ここで説明する精製プロトコルは、これらのすべてのために働くよりもMOG タグタンパク質のいくつかの異なるバージョンを生成するプロセスです。一方で、ニッケル樹脂に吸収するために6×Hisタグを組み込むように、ここで説明した精製プロトコルがあれば、他のMOG発現系、または他のタンパク質のために働く可能性があります。しかし、チオレドキシンタグなしで、高濃度でMOGタンパク質の溶解性に問題がある可能性があり、そしてもちろんそれは、GEにはできません<html>このようnerate純粋MOG 1-125は、MOG タグシステムに固有のものです。 透析を経て前タンパク質のリフォールディングにMOG タグタンパク質濃度を測定することは、この精製プロトコールの成功に不可欠です。濃度が高すぎると、タンパク質が凝集し、その代わりに、個々のタンパク質への折り畳みの溶液から落下することができます。この白色沈殿物を透析チューブの底部に形成するように、透析手順の間に見ることができます。これが発生している場合、6 Mグアニジン再びMOG タグタンパク質を溶解し、タンパク質濃度を測定します。何の析出物が0.5 mg / mlとで形成してはならないとして0.5 mgのタンパク質を希釈/再び透析を開始mLです。 MOG 1-125については、沈殿は、タンパク質が非常に不溶性であるように形成することが期待できます。我々は、これはタンパク質が十分に透析前に希釈されたことを提供MOG 1-125の折り畳みに影響を与えないであろうことを見出しました。 NT &quot;&gt;効果的に純粋なMOG 1-125にMOG タグタンパク質を切断するTEVプロテアーゼのためには、TEVプロテアーゼの十分な量を使用することが重要である。TEVプロテアーゼの古いバージョンでは、21しかし、より現代的なバージョンが苦しむ自己切断を介して不活性化されます不溶性は、参照22で説明したように、市販のTEVプロテアーゼはコストがかかる可能性があるので、我々は生産と精製TEVプロテアーゼをお勧めします。TEVプロテアーゼの不活性化の前にMOG タグタンパク質の十分な切断を達成するために十分なTEVプロテアーゼを添加することが重要である、従って22を発行します。使用している場合実験用純マウスMOG 1-125蛋白質は、蛋白質が高度に不溶性であり、溶液から沈殿し、したがって使用前に広範囲に混合しなければならないことに留意することが重要です。 要約すると、ここでは、MOG タグタンパク質を大量に生産し、精製するためのシンプルなプロトコルを記述しています。 Furtherm鉱石、我々のMOG タグタンパク質にTEVプロテアーゼ切断部位の付加は、必要に応じて純粋MOG 1-125を生成するための機会を提供します。 MOG タグタンパク質は、抗ミエリン自己免疫B細胞およびMOG タグ誘発EAEは、B細胞媒介病態5を内蔵することにより認識され結合されます。したがって、MOG タグタンパク質は、EAEを誘導するタンパク質抗原の広範な使用を制限する主要な障害を克服します。

MSは、ミエリンに向けられた自己免疫応答によって駆動されると考えられているCNSの慢性炎症および神経変性によって特徴付けられるヒト疾患です。時間の経過とともにミエリンおよび軸索の損失は、認知および運動機能1の緩やかな衰退につながります。 「実験的自己免疫性脳脊髄炎」は、CNSミエリンに向け自己免疫疾患の動物モデルのための包括的な用語です。ヒトMSと同様に、EAEは、典型的には、CNSの免疫細胞の浸潤を特徴とし、場合によっては、脱髄2れます。しかし、任意のEAEモデルは、部分的に人間のMSに似ている度合いは、使用される種または株に、基礎となる抗ミエリン自己免疫応答の複雑さによって異なります。 抗ミエリン自己免疫は実験的に、いくつかの方法で誘導することができるが、今日使用される最も一般的な方法は、免疫優性CD4を模倣するアミノ酸の短いペプチドでマウスを免疫化することです<sミエリンタンパク質の&gt; + T細胞エピトープアップ。これは、病原性応答を誘導するための最小要件を示しています。おそらく、これらの中で最も一般的には、C57BL / 6マウス3にEAEを誘導するために使用されるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG 35-55）に由来する21アミノ酸ペプチドです。しかし、いくつかの実験目的のためには、より大きなタンパク質抗原で免疫化することが望ましい、あるいは必要であり、実際にこれにはいくつかの利点が短いペプチドを用いた免疫化の上にあります。タンパク質全体または特定のドメインのいずれかを表す、より大きなタンパク質抗原は、異なる種であっても、複数の近交系マウスでのプレゼンテーションのために正常に処理されるか、またはすることができながら、まず、MHC制限のため、短いペプチドは、通常の株の非常に限られた範囲でのみ有効です4。第二に、より大きなタンパク質抗原は、抗原認識にリンパ球の多くの種類を組み込んだより複雑な免疫応答を誘導するのではなくlimitinすることが可能ですCD4 + T細胞へのG抗原認識。例えば、それらのB細胞受容体（BCR）を介したB細胞は、全体ではなく、処理タンパク質と直接相互作用します。我々と他の人は、MOG 35-55免疫によって活性化されたB細胞は、MOGタンパク質5を認識しないことが示されました。 B細胞は、最近、ヒトMS 6に病原性の役割を果たすことが実証されたので、自己免疫病理にB細胞を組み込むEAEモデルは、ますます重要です。 EAEを誘導するために、より大きなタンパク質抗原を使用することの利点にもかかわらず、そのようなタンパク質のいくつかの市販の供給源が残ります。 MOG 35-55のような短いペプチドは、非常に迅速かつ比較的安価に合成することができるが、実際に、MOGタンパク質を商業オプション購入に限定されず、コスト実質的です。それにもかかわらず、MOGの細胞外ドメイン（MOG 1-125に ）自分自身を生成するために、研究グループのために利用可能ないくつかの発現ベクターがあります。 HoweveR、我々は文献で同定した発現系の全てを、以降、より効率的な発現系7で置換されている古い技術に基づいています。また、大部分はラットまたはヒトMOG 8に基づいています。マウスにおける自己免疫のいくつかの研究では、マウスMOG自己抗原に基づいて抗原が好ましいです。最後に、コマーシャルまたは発現ベクターのいずれかと、我々が同定したすべてのMOG系タンパク質は、MOG 1-125ベースに追加のアミノ酸を含む融合タンパク質です。これらは、同様に私たちは識別できなかった機能を備えているの多くを精製するためのタグと通常は他の配列が含まれます。 これらの制限に対処するために、我々は、MOGタンパク質5の既知の不溶性に対処するためにチオレドキシンを含むタグに融合したマウスMOGの細胞外ドメインに基づく新規な融合タンパク質を生成しました。タグ配列はまた、精製およびTEVプロテアーゼCLE用の6xHis配列を含みます必要に応じて、すべてのタグ配列を完全に除去することが可能avageサイト。これは、我々が純粋なMOG 1-125蛋白質を生成するの知っている唯一の方法です。タンパク質の大量生産を容易にするために、MOG 1-125配列を細菌発現のためにコドン最適化し、MOG タグ融合タンパク質は、PET-32発現系に挿入しました。ここでは、最も免疫学研究所で使用可能な非専門的な装置を使用して、詳細にMOG タグタンパク質を生成し精製するプロトコル、及び純粋MOG 1-125を記述する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1434">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:375px;">BL21 E.coli- pet32-MOGtag</td>
			<td style="width:139px;">Kerfoot lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:803px;">These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">LB broth miller</td>
			<td style="width:139px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">LBL407.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:375px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:139px;">bio basic</td>
			<td style="width:119px;">AB0028</td>
			<td>Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:375px;">IPTG</td>
			<td style="width:139px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">IPT002.5</td>
			<td>Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:375px;">Chicken-egg lysozyme</td>
			<td style="width:139px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">LYS702.10</td>
			<td>Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T-8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:139px;">life technologies</td>
			<td style="width:119px;">20012-027</td>
			<td>Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:139px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">SOD004.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:139px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">TRS002.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Imidazole</td>
			<td style="width:139px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">IMD508.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Guanidine-HCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G3272</td>
			<td>The quality must be greater than 98% purity.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:139px;">bioshop</td>
			<td style="width:119px;">EDT111.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Nickel (II) sulfate</td>
			<td style="width:139px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">NIC700.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:375px;">His bind resin</td>
			<td style="width:139px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">69670-3</td>
			<td>Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Anhydrous ethanol</td>
			<td style="width:139px;">Commercial Alcohols</td>
			<td style="width:119px;">P016EAAN</td>
			<td>Dilute with water as needed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:139px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">ACE222.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sodium acetate trihydrate</td>
			<td style="width:139px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">SAA305.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">bovine serum albumin standard</td>
			<td style="width:139px;">bio-rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Bio-rad protein assay dye reagent concentrate</td>
			<td style="width:139px;">bio-rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:139px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Tris-base</td>
			<td style="width:139px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">TRS001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">7000 MW Snakeskin dialysis tubing</td>
			<td style="width:139px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:119px;">68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148-25ml</td>
			<td>This reagent should not be handled outside of a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">AcTEV protease</td>
			<td style="width:139px;">lifetechnologies</td>
			<td style="width:119px;">12575-015</td>
			<td>Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Polyethyleneglycol 3350</td>
			<td style="width:139px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">PEG335.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">polyethyleneglycol 8000</td>
			<td style="width:139px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">PEG800.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate</td>
			<td style="width:139px;">ebioscience</td>
			<td style="width:119px;">44-2404-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sonicator</td>
			<td style="width:139px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB-120-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Eon microplate spectrometer</td>
			<td style="width:139px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">11-120-611</td>
			<td>This equipment uses the Gen5 data analysis software.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Gen5 data analysis software</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">sodium dodecyl sulphate</td>
			<td style="width:139px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">SDS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">bromophenol blue</td>
			<td style="width:139px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">BRO777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Glycerol</td>
			<td style="width:139px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">GLY001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Protein desalting columns</td>
			<td style="width:139px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:119px;">89849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Glycine</td>
			<td style="width:139px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">GLN001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">precast 12% polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:139px;">bio-rad</td>
			<td style="width:119px;">456-1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Rapid stain reagent</td>
			<td style="width:139px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">553215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Gel dock EZ imager</td>
			<td style="width:139px;">bio-rad</td>
			<td style="width:119px;">1708270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">White Light Sample Tray</td>
			<td style="width:139px;">bio-rad</td>
			<td style="width:119px;">1708272&#160;</td>
			<td>Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Protein ladder</td>
			<td style="width:139px;">bio-rad</td>
			<td style="width:119px;">1610375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple and efficient production and purification of mouse myelin oligodendrocyte glycoprotein for experimental autoimmune encephalomyelitis studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

精製が完了すると、サンプルがステップ1.4、2.1、3.4に回収し、ステップ6.4からの最終生成物は、タンパク質ゲル（ 図3A）上で実行する必要があります。 MOG タグは、最初のT O / Nのサンプルで31.86 kDaのバンドとして表示されますが、ないT 0、および最終的に純粋な生成物にのみバンドでなければならない必要があります。 MOG タグタンパク質が正しく折り畳まれているかどうかをテストするために、MOG タグタンパク質は、FACSによってMOGタンパク質特異的B細胞を標識するために使用することができます。 1で標識マウスリンパ球：Hisタグおよび蛍光標識された第三の抗IgG1抗体に対して向けられた二次抗体と共にMOG タグ 1000希釈、MOG特異的B細胞（ 図3B）を同定することができます。あるいは、MOG タグが直接バックグラウンド染色を減少させるためにフルオロフォアにコンジュゲートすることができるように（二次及び三次抗体に結合するB細胞から得られました）MOG特異的B細胞を同定するための参照5に記載。野生型マウスにおけるMOG結合性B細胞を同定しようとするとき、これらの細胞は通常、5は非常に稀であるので、これは、必要です。 IgH遺伝子MOGマウスは、適切なκ軽鎖と対になったときに、MOGに対する特異性を付与する重鎖ノックインを有します。 MOG タグの結合は、IgH遺伝子MOG B細胞間で増強されるように、これは、このプロトコルは、適切に折り畳まれた抗原を生成することを確認します。重要なことには、IgH遺伝子MOG B細胞は、MOG タグが TおよびB細胞自己免疫の両方を誘導することを確認し、MOG指向EAE 12のモデルにおいて、自己免疫病理に寄与する。 Bradfordアッセイ4.代表的な結果を表1に示すセクションで説明したよう項5に記載のタンパク質をリフォールディングするために透析を開始する前に、ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質濃度を測定する必要があります</strong&gt; 図5にまとめました。 純粋MOG 1-125の生成は、図6に示すように、最終的にMOG 1-125にMOG タグタンパク質とタグ配列の切断をもたらすMOG タグタンパク質にTEVプロテアーゼの添加により達成される。その後、ニッケル樹脂の精製はMOGを除去しますタグ 、タグ配列、及び図6に示すように、最終的に純粋なMOG 1-125が得られTEVプロテアーゼ不純物。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54727/54727fig1.jpg" /> 図1：MOG タグタンパク質 （ダンら 5から許可を得てここに重複。。）。。 MOG タグ融合タンパク質の線状構造、及びアミノ酸及びDNA配列。マウスMOGの細胞外ドメインのDNA配列（MOG1-125、青の下側の配列）にコドン最適化された発現のために細菌（黒）で。この配列は、チオレドキシンおよびMOGタンパク質13,14の既知の不溶性に対抗するS-タグを含むタグへのN末端融合、ならびに精製の15のための6X Hisタグを作成するために、ベクターに合成し、挿入しました。 TEVプロテアーゼ切断部位は、タグ配列からMOG 1-125を分離します 。切断部位TEV代替コンセンサスすべての非MOGのアミノ酸の除去で16の結果を用いて、グルタミン-164およびグリシン-165との間にTEV媒介切断。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54727/54727fig2.jpg" /> 図2：純粋なMOG タグタンパク質を生産するために必要な手順の概要に。MOG タグタンパク質を生成し、MOG タグタンパク質を発現する細菌を一晩培養した後、セクション1に記載されているようにIPTGを用いMOG タグを発現するように誘導され、高濃度に増殖させた細菌を溶解し、ペレット化の一連のタンパク質含有画分をステップその後、粗タンパク質画分から精製されるセクション2. MOG タグに記載されている部3の部分に記載されているMOG タグを含む封入体は、帯電したニッケル樹脂とMOG タグタンパク質の溶出への吸収の4サイクルを通じて抽出されますプールされた溶出液のその後MOG タグタンパク質の収量を決定するためのブラッドフォードアッセイのために採取され、セクション4及び5の最後に記載されて溶出液の残りは、数日間にわたって、酢酸緩衝液中に透析し、タンパク質を濃縮します5ミリグラムの最終濃度にPEG 3350およびPEG 8000を使用して/ mlのBで決定されたMOG タグの利回りに基づいてラドフォードアッセイ部6に記載されているプロセス全体を括弧内に示した各ステップの開始日と、10日間の最小値を取ることができます。しかし、別の停止と開始点は、プロトコルに記載されている、とのステップが必要であれば時間のより多くの量を分散させることができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54727/54727fig3.jpg" /> 図3：MOG タグタンパク質およびその活性の評価の精製 （A）図は、タンパク質精製手順の様々なポイントから収集し、SDS-PAGEゲルで泳動したタンパク質サンプルです。タンパク質発現のT 0 =前（ステップ1.4で収集した）タンパク質の誘導にBL21細菌、T O / N = BL21の細菌が誘導後（収集ステップ2.1）で、原油MOG タグ =可溶化MOG タグタンパク質ステップ3.4で収集したタンパク質精製（）、ピュアMOG タグ = MOG タグタンパク質ステップ6.4に集め精製（後）の前に。野生型C57BL / 6マウスまたはMOGタンパク質7,17のための特定の免疫グロブリン重鎖を発現するのIgH MOGマウスのいずれかからのリンパ節から（B）CD19 POS CD4 陰性にMOG タグタンパク質の結合は、ナイーブB細胞をフローサイトメトリーを用いて評価しました。 。 MOG タグ特異的B細胞を二次抗Hisタグ抗体および蛍光三次抗IgG1抗体、続いMOG タグとリンパ節細胞を染色することによって同定しました。 C57BL / 6またはIgH遺伝子MOGマウス由来の細胞の染色はのIgH MOG細胞のMOG タグ蛍光マイナス1（FMO）コントロール染色と一緒に示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig3large.jpg" target="_blank">してくださいC</a>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをなめます。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54727/54727fig4.jpg" /> 図4：MOG 1-125を生成する手順の概要 MOG タグ タンパク質 から 。プロトコールのステップ3.5で説明したようにMOG タグの溶出液を収集した後、MOG タグタンパク質は、TEVプロテアーゼ切断緩衝液中に透析します。透析が完了すると、TEVプロテアーゼは、MOG 1-125蛋白質にMOG タグの切断をもたらすMOG タグの溶液に添加します。切断溶液の量は、その後減少し、タンパク質精製の前に、バッファBに透析します。切断溶液から不純物が帯電したニッケル樹脂、最終的に純粋なMOGの溶液を得た不純物の溶出への吸収の4連続ラウンドを通じて抽出されます&lt;<html>サブ&gt; 1-125。 MOG 1-125蛋白質濃度はBradfordアッセイによって決定されたタンパク質は、透析を数日間にわたって折り畳まれます。透析が完了すると、MOG 1-125蛋白質は2.24ミリグラムに濃縮される/ mlのPEG 3350およびPEGこのプロトコルは、セクション7で詳しく説明されている8000を使用して、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54727/54727fig5.jpg" /> 図5：MOG タグの濃度を決定するためのブラッドフォードアッセイ標準曲線の例 表1から採取したタンパク質。BSAの標準測定値は595 nmでの光学密度に基づいて、MOG タグの濃度を算出するための回帰式を得るためにプロットしました。F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig5large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54727/54727fig6.jpg" /> 図6：MOG タグタンパク 質およびMOG 1-125 のその後の精製 のTEV切断示さタンパク質サンプルはMOG 1-125のSDS-PAGEゲル実証精製上で実行されている純粋なMOG タグ = MOG タグタンパク質は切断前をTEVするには、（収集しますステップ7.5で収集したTEVプロテアーゼ（）とMOG タグのインキュベーションの72時間後に採取した）ステップ6.4で、MOG タグワット/ TEV =タンパク質画分、MOG 1-中にニッケル樹脂に結合したまま溶出=タンパク質画分（ステップ7.9で収集）125精製プロトコル、ピュアMOG 1-125 = MOG1-125タンパク質精製（ステップ7.12に回収）した後。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> BSA（mg / mlで） </td><td> 0.4 </td><td> 0.35 </td><td> 0.3 </td><td> 0.25 </td><td> 0.2 </td><td> 0.15 </td><td> 0.1 </td><td> 0.05 </td><td> 0 </td></tr><tr><td></td><td> 1.079 </td><td> 0.998 </td><td> 0.948 </td><td> 0.853 </td><td> 0.769 </td><td> 0.699 </td><td> 0.583 </td><td> 0.493 </td><td> 0.373 </td></tr><tr><td></td><td> 1.071 </td><td> 1.014 </td><td> 0.95 </td><td> 0.854 </td><td> 0.777 </td><td> 0.681 </td><td> 0.579 </td><td> 0.484 </td><td> 0.375 </td></tr><tr><td></td><td> 1.069 </td><td> 1.017 </td><td> 0.944 </td><td> 0.848 </td><td> 0.781 </td><tD&gt; 0.687 </td><td> 0.592 </td><td> 0.494 </td><td> 0.374 </td></tr><tr><td> MOG タグ希釈</td><td> 1 </td><td> 1/5 </td><td> 1月25日</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.327 </td><td> 1.013 </td><td> 0.493 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.332 </td><td> 1.063 </td><td> 0.491 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.367 </td><td> 1.088 </td><td> 0.488 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1：MOG タグ タンパク 質 の濃度を決定するためのブラッドフォードアッセイの代表値 BSA DILU。既知の濃度でションは、MOG タグタンパク質精製後の希釈液は、最終MOG タグタンパク質濃度を決定するために使用されている図5に示される標準曲線を決定するために使用されます。行は、595nmで測定した光学密度が含まれており、各行がそれぞれ示された濃度での3反復の合計の1の複製を表します。

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Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

実験的自己免疫性脳脊髄炎研究のためのシンプルで効率的な生産とマウスミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の精製

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

simple-efficient-production-purification-mouse-myelin-oligodendrocyte

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K ビュー.  Western University. We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

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Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

実験的自己免疫性下垂体炎の誘導のためのマウス下垂体免疫原の調製

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

免疫・感染学

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

SJLマウスにおける実験的自己免疫性下垂体炎の誘導

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for study of the human demyelinating disease, multiple sclerosis (MS). EAE is characterized by pathologic infiltration of mononuclear cells into the CNS and by clinical manifestation of paralytic disease. Similar to MS, EAE is also under genetic control in that certain mouse strains are susceptible to disease induction while others are resistant. Typically, C57BL/6 (H-2b) mice immunized with myelin basic protein (MBP) fail to develop paralytic signs. This unresponsiveness is certainly not due to defects in antigen processing or antigen presentation of MBP, as an experimental protocol described here had been used to induce severe EAE in C57BL/6 mice as well as other reputed resistant mouse strains. In addition, encephalitogenic T cell clones from C57BL/6 and Balb/c mice reactive to MBP had been successfully isolated and propagated.
The experimental protocol involves using a cellular adoptive transfer system in which MBP-primed (200 &mu;g/mouse) C57BL/6 donor lymph node cells are isolated and cultured for five days with the antigen to expand the pool of MBP-specific T cells. At the end of the culture period, 50 million viable cells are transferred into naive syngeneic recipients through the tail vein. Recipient mice so treated normally do not develop EAE, thus reaffirming their resistant status, and they can remain normal indefinitely. Ten days post cell transfer, recipient mice are challenged with complete Freund adjuvant (CFA)-emulsified MBP in four sites in the flanks. Severe EAE starts to develop in these mice ten to fourteen days after challenge. Results showed that the induction of disease was antigenic specific as challenge with irrelevant antigens did not induce clinical signs of disease. Significantly, a titration of the antigen dose used to challenge the recipient mice showed that it could be as low as 5 &mu;g/mouse. In addition, a kinetic study of the timing of antigenic challenge showed that challenge to induce disease was effective as early as 5 days post antigenic challenge and as long as over 445 days post antigenic challenge. These data strongly point toward the involvement of a "long-lived" T cell population in maintaining unresponsiveness. The involvement of regulatory T cells (Tregs) in this system is not defined.

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Certain mouse strains are able to resist induction of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) with myelin basic protein. Described here is a simple immunization protocol that reverses the unresponsiveness and induces paralytic disease in several typical EAE resistant mouse stains.

移入、抗原チャレンジにより実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）抵抗性マウス系統の応答がないことを克服する

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While the exact etiology of the disease is yet unclear, autoreactive T lymphocytes are thought to play a central role in its pathophysiology. MS therapy is only partially effective so far and research efforts continue to expand our knowledge on the pathophysiology of the disease and to develop novel treatment strategies. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model for MS sharing many clinical and pathophysiological features. There is a broad diversity of EAE models which reflect different clinical, immunological and histological aspects of human MS. Actively-induced EAE in mice is the easiest inducible model with robust and replicable results. It is especially suited for investigating the effects of drugs or of particular genes by using transgenic mice challenged by autoimmune neuroinflammation. Therefore, mice are immunized with CNS homogenates or peptides of myelin proteins. Due to the low immunogenic potential of these peptides, strong adjuvants are used. EAE susceptibility and phenotype depends on the chosen antigen and rodent strain. C57BL/6 mice are the commonly used strain for transgenic mouse construction and respond among others to myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG). The immunogenic epitope MOG35-55 is suspended in complete Freund's adjuvant (CFA) prior to immunization and pertussis toxin is applied on the day of immunization and two days later. Mice develop a "classic" self-limited monophasic EAE with ascending flaccid paralysis within 9-14 days after immunization. Mice are evaluated daily using a clinical scoring system for 25-50 days. Special considerations for care taking of animals with EAE as well as potential applications and limitations of this model are discussed.

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an established animal model of multiple sclerosis. C57BL/6 mice are immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide 35-55 (MOG35-55), resulting in an ascending flaccid paralysis caused by autoreactive immune cells in the central nervous system. Protocols for disease induction and monitoring will be discussed.

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG<sub&gt; 35〜55</sub&gt;）C57BL / 6マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）誘発

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

酵素消化および勾配分離を使用したマウス皮膚から浸潤白血球の単離

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with embedded pericytes, and the glia limitans composed by the parenchymal basement membrane and astrocytic end-feed embracing the abluminal aspect of central nervous system (CNS) microvessels. In addition to maintaining CNS homeostasis the NVU controls immune cell trafficking into the CNS. During immunosurveillance of the CNS low numbers of activated lymphocytes can cross the endothelial barrier without causing BBB dysfunction or clinical disease. In contrast, during neuroinflammation such as in multiple sclerosis or its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) a large number of immune cells can cross the BBB and subsequently the glia limitans eventually reaching the CNS parenchyma leading to clinical disease. 
Immune cell migration into the CNS parenchyma is thus a two-step process that involves a sequential migration across the endothelial and glial barrier of the NVU employing distinct molecular mechanisms. If following their passage across the endothelial barrier, T cells encounter their cognate antigen on perivascular antigen-presenting cells their local reactivation will initiate subsequent mechanisms leading to the focal activation of gelatinases, which will enable the T cells to cross the glial barrier and enter the CNS parenchyma. Thus, assessing both, BBB permeability and MMP activity in spatial correlation to immune cell accumulation in the CNS during EAE allows to specify loss of integrity of the endothelial and glial barriers of the NVU. 
We here show how to induce EAE in C57BL/6 mice by active immunization and how to subsequently analyze BBB permeability in vivo using a combination of exogenous fluorescent tracers. We further show, how to visualize and localize gelatinase activity in EAE brains by in situ zymogaphy coupled to immunofluorescent stainings of BBB basement membranes and CD45+ invading immune cells.

Here, we present protocols to investigate impairment of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. We specifically address how to determine blood-brain barrier permeability and gelatinase activity involved in leukocyte migration across the glia limitans.&#160;

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible genetic background. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a typical disease model of MS widely used for investigating the pathogenesis in which T lymphocytes specific for myelin antigens initiate an inflammatory reaction in CNS. It is very important to assess how lymphocytes in the CNS regulate the development of disease. However, the approach for measuring the quantity and quality of infiltrated lymphocytes in the CNS is very limited due to the difficulties in isolating and detecting infiltrated lymphocytes from the brain. This manuscript presents a protocol for that is useful for the isolation, identification, and characterization of infiltrated lymphocytes from the CNS and will be helpful for our understanding of how lymphocytes are involved in the development of the CNS autoimmune disease.

This manuscript presents a protocol to induce active experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice. A method for the isolation and characterization of the infiltrated lymphocytes in the central nervous system (CNS) is also presented to show how lymphocytes are involved in the development of CNS autoimmune disease.

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Experimental Autoimmune Uveitis: An Intraocular Inflammatory Mouse Model

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular inflammatory disease model recapitulate the clinical phenotype of posterior uveitis affecting humans. EAU has been used reliably to study the efficacy of novel inflammatory therapeutics, their mode of action and to further investigate the mechanisms that underpin disease progression of intraocular disorders. Here, we provide a detailed protocol on EAU induction in the C57BL/6J mouse - the most widely used model organism with susceptibility to this disease. Clinical assessment of disease severity and progression will be demonstrated using fundoscopy, histological examination and fluorescein angiography. The induction procedure involves subcutaneous&#160;injection of an emulsion containing a peptide (IRBP1-20) from the ocular protein interphotoreceptor retinoid binding protein (also known as retinol binding protein 3), Complete Freund&#39;s Adjuvant (CFA) and supplemented with killed Mycobacterium tuberculosis. Injection of this viscous emulsion on the back of the neck is followed by a single intraperitoneal injection of Bordetella pertussis toxin. At the onset of symptoms (day 12-14) and under general anesthesia, fundoscopic images are taken to assess disease progression through clinical examination. These data can be directly compared with those at later timepoints and peak disease (day 20-22) with differences analyzed. At the same time, this protocol allows the investigator to assess potential differences in vessel permeability and damage using fluorescein angiography. EAU can be induced in other mouse strains - both wildtype or genetically modified - and combined with novel therapies offering flexibility for studying drug efficacy and/or disease mechanisms.

In this report we present a protocol that allows the investigator to generate a mouse model of intraocular uveitis. More commonly referred to as experimental autoimmune uveitis (EAU), this established model captures many aspects of human disease. Herein, we will describe how to induce and monitor disease progression using several readouts.

実験的自己免疫性ブドウ膜炎:眼内炎症性マウスモデル

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular ...

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or microbial lipid antigens presented by the non-polymorphic MHC class I-related molecule CD1d. Preclinical and clinical studies support a role for iNKT cells in cancer, autoimmunity and infectious diseases. iNKT cells are very conserved throughout species and their investigation has been facilitated by mouse models, including CD1d-deficient or iNKT-deficient mice, and the possibility to unequivocally detect them in mice and men with CD1d tetramers or mAbs specific for the semi-invariant TCR. However, iNKT cells are rare and they need to be expanded to reach manageable numbers for any study. Because the generation of primary mouse iNKT cell line in vitro has proven difficult, we have set up a robust protocol to purify and expand splenic iNKT cells from the iV&#945;14-J&#945;18 transgenic mice (iV&#945;14Tg), in which iNKT cells are 30 times more frequent. We show here that primary splenic iV&#945;14Tg iNKT cells can be enriched through an immunomagnetic separation process, yielding about 95-98% pure iNKT cells. The purified iNKT cells are stimulated by anti-CD3/CD28 beads plus IL-2 and IL-7, resulting in 30-fold expansion by day +14 of the culture with 85-99% purity. The expanded iNKT cells can be easily genetically manipulated, providing an invaluable tool to dissect mechanisms of activation and function in vitro and, more importantly, also upon adoptive transfer in vivo.

We describe a rapid and robust protocol to enrich invariant natural killer T (iNKT) cells from mouse spleen and expand them in vitro to suitable numbers for in vitro and in vivo studies.

インビトロおよびインビボ研究のためのマウス不変性ナチュラルキラーT細胞の精製と拡大

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...