このモデルは、免疫介在性ヒト後部ブドウ膜炎の病因を含む細胞メカニズムを研究するために使用できます。この技術の意味は、新規薬物の有効性を監視し、化学的疾患の進行に関する機構的な洞察を提供する際のヒトブドウ膜炎のトランスレーショナル研究にまで及びます。このモデルを使用する主な利点は、疾患誘発の信頼性と、疾患の進行を監視できる非侵襲的内視鏡技術の使用です。
ここでは、いくつかの読み出しを使用して疾患を誘発し、病理を評価する方法について説明します IRBP 1-20完全なフロイントアジュバントまたはCFAを調製するには、計算された量のペプチドを最小容量の100%DMSOで再懸濁します。粉末が完全に溶解したら、穏やかな攪拌を使用して注射するマウスの数に応じて最終的に計算されたPBSの量に達するまで少量のPBSをチューブに加え、溶液を混合します。完全なフロイントアジュバントを調製した後、DMSO PBSペプチド溶液を懸濁液に1対1の比率で滴下しながら、溶液を穏やかかつ頻繁にピペットでピペットで粘り気のある均一に分布したエマルジョンを形成します。
溶液を曝気するには、700マイクロリットルに設定された1000マイクロリットルのピペットを使用して、濃厚でクリーミーなエマルジョンが得られるまで溶液を繰り返しピペットします。ペプチド懸濁液を注入する前に、注射する各マウスを別々のケージに入れ、23ゲージ針を備えた1ミリリットルのシリンジを使用して、1%マウス血清を添加した100マイクロリットルのRPMI 1640培地中に1.5マイクログラムの百日咳菌毒素を各動物に送達する。百日咳毒素溶液を注入したら、マウスを首筋のような位置に保持し、皮膚をつまんで首の後ろにテントのような構造を形成する必要があります。
針を指と親指の間のスペースに通し、200マイクロリットルのIRBPエマルジョンをテントを張った皮膚に注入し、注射後の圧力を維持し、針の頭を回転させて皮膚を閉じてから引っ込めます。臨床疾患をスコアリングするために、注射後21日目に、麻酔ペプチド注射マウスにおける花弁反射に対する応答の欠如を確認し、動物を首筋で拘束する。注射直後に1%トロピカミドと2%フェニレフリンを各眼の角膜に局所的に塗布します。.
瞳孔が完全に拡張したら、マウスを専用の顕微鏡ステージに置きます。網膜に完全にアクセスできるように顕微鏡を配置します。必要に応じて、画像プロセス全体を通して接眼レンズを調整して、視神経乳頭と網膜を確認し、網膜領域全体の画像を取得し、周囲のすべてのコーナーを調整してカバーします。
血管漏出を測定するには、100マイクロリットルの2%フルオレセインを首の後ろに皮下投与し、網膜がライブ画像の中央の中心になるようにマウスの位置を変えます。蛍光注入後1.5分と7分でそれぞれの画像を取得する前に、眼底鏡を465〜490ナノメートルの青色光励起フィルターに設定します。すべての画像が取得されたら、腹腔内に回復のための鎮静剤注射剤を投与し、マウスを予熱したマットの上のケージに入れ、マウスが意識を取り戻すまで監視しながら湿潤に浸した食事にアクセスします。
画像の臨床疾患スコアリングでは、視神経乳頭の炎症、網膜血管カフ、網膜組織の浸潤、および構造的損傷の重症度に基づいて臨床評価を行います。これらの各パラメーターを 1 から 5 のスケールでスコアリングします。総計は、眼全体の臨床疾患を表しており、眼あたり最大スコアは20です。
研究の最終臨床エンドポイントのための眼底イメージング後、マウスを安楽死させます。組織学的分析のために、眼瞼全体を離して評価し、次に湾曲した鉗子を地球の後ろに配置して、眼窩結合組織と視神経をつかみ、眼を摘出します。除核した眼を1〜5ミリリットルの4%グルタルアルデヒドに最低15分間入れてから、臓器を1〜5ミリリットルの10%ホルムアルデヒドに少なくとも24時間移します。
組織学的組織染色後、標準プロトコールに従って、免疫細胞浸潤のレベルおよび網膜損傷の程度に基づいて0〜3のスケールでスコアを割り当てた。眼底鏡下変化は、疾患進行時の炎症性変化として分類され、免疫細胞の浸潤や構造障害に基づく組織学的変化に加えて、網膜組織や血管・視神経乳頭の炎症や網膜の構造的損傷などが挙げられます。これらの臨床的および組織病理学的変化は、疾患の進行を評価し、治療介入の有効性を評価するために等級付けおよびスコアリングすることができる。
血管漏出は、モデルおよびヒトブドウ膜炎の病理学的特徴でもある。この分析で示されているように、フルオレセインを使用して、このモデルの別の読み出しとして血管漏れを視覚化できます。研究者は、溶液間の分離の兆候なしにエマルジョンが正しく調製されていることを確認することが不可欠です。
それらは完全に混合されるべきであり、そして最終製品は質感が滑らかであるべきである。この手順は、他の薬物投与方法および網膜免疫細胞集団に浸潤する表現型のためのサイトメトリーと組み合わせることができる。
