This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.

注：プロトコルのスキームは、手続きのタイムラインを含め、 図1に示されています。 CVE細胞の1文化とパッセージ<ol><li>完全増殖培地中で培養CVE細胞（のbEnd。3細胞）（高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地、DMEM）は、T75のcm 2の組織培養フラスコ中、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました。 5％CO 2インキュベーター内で37℃で成長します。 </li><li>取り外して、細胞培養培地を廃棄します。 0.25％トリプシン、0.03％EDTA溶液で細胞層を洗浄し、次いで1加算 - フラスコにトリプシンEDTA溶液2mLを3 37℃でフラスコを保つ - 5分。細胞層が分離されるまで、倒立顕微鏡下で細胞を観察します。完全増殖培地の10 mLを加え、穏やかにピペッティングすることにより細胞を吸引します。 </li><li>細胞破片を除去するために、5分間、700×gで15 mLの遠心管とスピンに流体および細胞をデカントします。 </l私&gt; <li>遠心管からの上清を捨てます。完全増殖培地の10 mLを加え、細胞ペレットを再懸濁します。 5分間、700×gで細胞をスピン。 </li><li>遠心管からの上清を捨てます。再懸濁（血球計を用いて計数することによって決定さ、トリパンブルー染色によって死細胞を除外）2.0×10 5細胞/ mlの濃度で完全増殖培地中で細胞ペレットを。 注：たて解凍した細胞は、実験のために少なくとも3継代のためのサブ培養されます。 </li></ol>細胞培養プレート上の細胞を2シードとトリート<ol><li> 96ウェルの細胞外フラックス細胞培養プレート上の種子細胞：80μL/ウェル。 5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞培養プレートを置きます。注：ウェル当たり16×10 3細胞が60に到達します- 24時間以内に80％の密集度に。 </li><li>細胞が化学物質にさらされている場合は、細胞がプレートの底に付着された後、治療を追加（8から24時間後の参照します鼎）。 注：トランスフェクション実験のために、完全増殖培地に抗生物質を追加しないでください。 </li></ol>バイオアナライザを使用したミトコンドリア機能の3.評価<ol><li>アッセイの開始に先立ち、プレートに細胞外フラックス較正溶液150μLを添加し、CO 2なしで37℃でO / Nをインキュベートすることによって較正を有する細胞外フラックスセンサカートリッジを水和。 </li><li>プレート洗浄ステーションを使用して、pH7.0の細胞外フラックスアッセイ培地中に、細胞培養培地を変えます。 60分- 30のためのCO 2なしで37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li> 8μMのオリゴマイシン、4.5μMFCCP、10μMのロテノン、およびDMEM中で10μMのアンチマイシンAの作業溶液を調製します。カートリッジの注入口に原液の負荷25μL：ポートA、オリゴマイシン;ポートB、FCCP。ポートC、細胞外フラックスアッセイ培地とロテノンとアンチマイシンA。 表1に記載したように、アッセイプロトコルを実装。 </li><li>バイオアナライザに水和カートリッジをロードし、「スタート」ボタンをクリックしてキャリブレーションを行います。キャリブレーションが完了した後、カートリッジ底板を取り外し、「アンロードカートリッジ」プロンプトをクリックして、セルプレートをロードします。すべての測定が終了するまで試験を続けます。 </li><li>データファイルを開いて、バイオアナライザーからのレート値を取得します。スプレッドシートファイルにデータをエクスポートします。 </li></ol> 4.データ解析注：データ解析のための計算は、以下の処方されます。 OCRは、 図2に示すような値は、バイオアナライザー機器から得られます。 <ol><li>基底値から（測定3） - 基礎呼吸を計算するために、非ミトコンドリア呼吸（12測定10）を引きます。 注：基礎呼吸=基礎 - 非ミトコンドリア呼吸=レート③ - レート⑩〜⑫。 </li><li> ATP productiを計算するには基底値から（測定3） -で、ATP-リンク呼吸（6測定4）を引きます。 注：ATP産生=基礎 - ATP結合型呼吸=レート③ - レート④〜⑥。 </li><li>最大呼吸から（測定7から9） - 最大呼吸を計算するために、非ミトコンドリア呼吸（12測定10）を引きます。 注：最大呼吸=最大呼吸 - 非ミトコンドリア呼吸=レート⑦〜⑨ - レート⑩〜⑫。 </li><li> スペア容量を計算するには 、最大呼吸から基底値（測定3）（ - 9測定7）を引きます。 注：予備能力=最大呼吸 - 基礎=レート⑦〜⑨ - レート③。 </li><li> ATP-リンク呼吸（測定4）から- プロトンリークを計算するために、非ミトコンドリア呼吸（12計測10）を引きます。 注：プロトンリーク= ATP結合型呼吸 - 非ミトコンドリアリットルの呼吸=レート④ - レート⑩〜⑫。 </li></ol>

<ol>
	<li>Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+signaling+organelles+in+the+vascular+endothelium.">Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).</li><li>Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cytoskeletal+elements+are+critical+for+flow-mediated+dilation+in+human+coronary+arterioles.">Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles.</a> Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).</li><li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+mitochondrial+clustering+creates+an+oxidant-rich+nuclear+domain+required+for+hypoxia-induced+transcription.">Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription.</a> Sci Signal. 5, ra47 (2012).</li><li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Ca2+]i+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2+-induced+Ca2++release.">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).</li><li>Sutendra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Nogo+and+the+mitochondria-endoplasmic+reticulum+unit+in+pulmonary+hypertension.">The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 3, 88ra55 (2011).</li><li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase.">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).</li><li>Doll, D. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+expression+and+barrier+properties+of+immortalized+mouse+brain+microvessel+endothelial+cells.">Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells.</a> Brain Res. 1130, 17-30 (2007).</li><li>Bukeirat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+regulates+blood-brain+barrier+permeability+and+mitochondrial+function+by+targeting+cytochrome+c.">MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Impairment+in+Cerebrovascular+Endothelial+Cells+is+Involved+in+the+Correlation+between+Body+Temperature+and+Stroke+Severity.">Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity.</a> Aging Dis. 7, 14-27 (2016).</li><li>Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+large+apparent+work+capability+of+the+blood-brain+barrier:+a+study+of+the+mitochondrial+content+of+capillary+endothelial+cells+in+brain+and+other+tissues+of+the+rat.">The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat.</a> Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).</li><li>Oldendorf, W. H., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greater+number+of+capillary+endothelial+cell+mitochondria+in+brain+than+in+muscle.">Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).</li><li>Kaczara, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+monoxide+released+by+CORM-401+uncouples+mitochondrial+respiration+and+inhibits+glycolysis+in+endothelial+cells:+A+role+for+mitoBKCa+channels.">Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels.</a> Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> J Vis Exp. (96), e52350 (2015).</li></ol>

The authors declare no potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article. Open Access fees for this article were provided by Agilent Technologies.

このプロトコルは、脳血管内皮細胞に生体エネルギーの表現型を評価するための方法を表しています。これは、内皮細胞ミトコンドリアの評価のための基本的なアッセイとして働き、それはCVE細胞におけるミトコンドリアシグナル伝達経路に影響を与えることができる刺激のメカニズムを研究するために設計された実験のために最適です。それはまた、BBB-破壊関連疾患のための潜在的治療薬を試験するための方法を提供します。 プロトコル内の重要なステップ細胞外フラックスbioanalyzersはリアルタイムにOCRを測定する能力を持っています。このアッセイでは、適切な細胞密度を特定することが重要です。細胞密度はウェル当たり8×10 3細胞未満であると、基底OCR（ 図2及び図3）分析されるには低すぎます。細胞密度はウェル当たり32×10 3個の細胞を超えている場合、細胞は、オリゴマイシンに応答又はFCCPの下水処理しませんNTS（ 図2及び図3）。我々の実験モデルでは、この細胞株に対する最適な細胞密度は7と治療法10,14を刺激するために複製可能な結果と感度を示しているだけでなく、あたり16×10 3細胞です。 24ウェルバイオアナライザーを使用する場合は、細胞密度の新しい滴定アッセイのために必要とされるであろう。 CVEは、他の内皮細胞または組織型15,16に比べて、ミトコンドリアの大容量を有することには大きなエネルギー生産と生体エネルギー代謝を測定するための少数の細胞の必要性を示唆し、文書化されています。当社は、プライマリとして脳内皮細胞のいくつかのタイプを、テストし、7マウス脳血管内皮細胞を不死化し、人間の脳血管内皮細胞（未発表データ）を不死化しています。 160ピコモル/分 - これらの細胞は、40内の許容可能なOCR（基礎呼吸OCRに到達するために同様の細胞密度を必要と96ウェルプレート、50 - 24ウェルプレート、400ピコモル/分）生体エネルギー分析を行いました。 Kaczara らは、より高い細胞密度17を使用したヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）において、生体エネルギー代謝を測定することを報告しました。 当社グループは、他の組織または器官からの血管細胞を評価しませんでした。理論的には、バイオアナライザーは、潜在的に任意の細胞型に使用することができるが、それは（いくつかの特定の細胞がよく成長するコーティングされたプレートを必要とするかもしれない）、細胞密度、細胞培養培地、および培養条件についてのアッセイの最適化が必要です。なお、実験は、OCRの速度が許容範囲内であることを確認するために完了していることが要求されます。他の臓器の内皮細胞におけるOCRは、細胞密度を増加させる、脳からのCVEよりも低い場合に許容可能なOCRの範囲内で取得することができます。細胞はエネルギーの彼らの主な情報源として酸化的リン酸化を使用していない場合あるいは、バイオアナライザーは最適解ではないでしょうLアッセイ。 バイオアナライザーは、試薬が適用される順序に基づいて、電子伝達鎖の連続的破壊を可能にします。まず、オリゴマイシンは、ミトコンドリア複合体V（ATP合成酵素）を阻害する、適用されます。第二に、FCCP、電子脱共役剤は、プロトン勾配の破壊につながる、適用されます。最後に、ミトコンドリア複合体IおよびIIIを阻害ロテノン及びアンチマイシンAは、それぞれ、電子流の合計阻害をもたらすために適用されます。薬物が特定の電子伝達連鎖反応を遮断、逐次変化はミトコンドリアの機能を反映するように測定することができるので、薬物曝露の順序は必須です。 修正およびトラブルシューティング CVE細胞における刺激に対するミトコンドリアの応答を評価するために、細胞を細胞培養プレートの底に付着させた後の刺激を細胞に適用されることをお勧めします（タイムラインを参照してください。図1に示されています。それは、通常、少なくとも6時間）を要します。処理により複製可能な結果を​​得るためには、一貫性のある細胞密度を維持するために極めて重要です。前処理は、細胞播種の前に設計されている場合、それぞれの前処理のための細胞密度は、慎重に播種するための死細胞を除外し、測定されるべきです。トランスフェクションは、実験計画に含まれている場合は、製造元のトランスフェクションプロトコールを参照してください。 図4に示されるデータで実証、のmiR-34Aは、miR-34aの過剰発現と代謝機能の変化を評価するために、抗生物質を含まない細胞培養培地およびミトストレステストを必要とリポフェクタミンのトランスフェクションキットを使用して、CVE細胞にトランスフェクトしました。プラスミドの用量はまた、以前に公表13のように、最適化することができます。プロトコルに対して行うことができるもう一つの変化は、試薬の濃度を変えています。オリゴマイシン、FCCP、および/またはロテノンとアンチマイシンAの滴定曲線はcompleすることができますテッド。 このアッセイは、ハイスループットの様々な薬剤の分析のために使用されている場合に加えて、我々の以前の刊行物7,13に記載された細胞生存率および細胞増殖を測定するための平行分析を含むことが示唆されています。 OCR値は有意に細胞数（ 図2及び3）の影響を受け、そして細胞増殖および生存率アッセイは、データの標準化の利益しています。しかし、これらのアッセイの完了は、個々の研究室の裁量です。 テクニックの制限事項このプロトコルの主な制限は、我々は唯一の研究ではin vitro細胞培養モデルを使用したことです。現在、内皮細胞のミトコンドリア機能に対処することができる利用可能なエクスビボモデルまたは動物モデルは存在しません。新しいモデルは、インビボで生体エネルギー機能の評価のために開発されることが期待されていると<eメートル&gt; ex vivoでの今後の研究インチ別の制限は、生体エネルギー対策以下のバリア性評価を拡張したものです。まず、生体エネルギーの測定が完了した後、細胞生存率は、電子伝達鎖の完全な破壊後減少する、ための実験を行うことができません。第二に、特定の細胞培養プレートおよびインサートは生体エネルギー値を検出するために必要なバリア性評価のための挿入に適合しません。したがって、生体エネルギーのアッセイ後に完了することができ、多くの機能アッセイは存在しません。しかしながら、特殊な装置が生体エネルギーアッセイの前に、機能的アッセイを行うために開発されることが期待されます。 既存の/代替方法に関して技術の意義ミトコンドリアの機能を評価するための従来の技術は、セル18からミトコンドリアの単離を必要としました。このNEバイオアナライザーを使用してワット技術は、単離されたミトコンドリアを評価するよりも細胞環境のより多くを保持する無傷の細胞におけるミトコンドリア活性の測定を可能にします。 このテクニックをマスターした後、将来のアプリケーションや行き方このプロトコルは、設計とのbEnd。3セルライン用に開発されたが、それはまた、主要な脳血管内皮（pCVE）セル7または他の内皮と互換性があり、我々はpCVEセル7を使用して、我々の以前の出版物でこれを実証しているされています。内皮細胞の他のタイプが使用される場合、培養プレートのコーティングおよび成長因子の使用が必要とされ得ます。ただし、滴定アッセイは、同様に他の細胞型のために推奨されます。このプロトコルは、CVE細胞の生体エネルギーの評価に採用される一般的な方法を提供し、それはさらに、このようにメカニズムの研究や治療応答に適用することができます。

広く、脳血管内皮（CVE）細胞によって形成され、血液脳関門（BBB）は、血管生物学の最も重要非常に異なるユニークな機能を有することが認識されます。これらの内皮細胞は、化学エネルギー源としてアデノシン三リン酸（ATP）の細胞供給の大部分を生成するために、ミトコンドリアを使用しています。 CVE細胞についてATPを提供することに加えて、ミトコンドリア1-4シグナリングセルラなどの血管内皮細胞における種々の細胞プロセス、アポトーシス5、および細胞周期の制御、細胞増殖6。CVE細胞におけるミトコンドリアの生体エネルギー機能の調節不全を調節します損なわれた血管内皮の活動につながる、ミトコンドリア生合成に影響を与え、脳血管疾患および神経変性疾患、 例えば 、脳卒中7,8およびアルツハイマー病（AD）9を悪化させる可能性があります 。私たちは、CVE細胞への傷害がlipopolysacへの暴露を、以下のことが実証されています糖類（LPS）は、ストロークが7成果CVE細胞中のミトコンドリア機能を損なうと悪化します。 t-ブチルヒドロキノン（TBHQ）はCVEセル10における酸化的リン酸化を妨害することによって、脳卒中死亡率を増加させます。したがって、CVE細胞だけでなく、パイロットの中枢神経系のメカニズムに関連した一連の研究（CNS）疾患における生体エネルギー機能の定量的なモデルは、だけでなく、血管生物学にミトコンドリアの機能を標的と治療薬の薬剤スクリーニングにおける画期的な製品を提供します。 単離されたミトコンドリアは、生体エネルギー関数を測定するために使用されてきました。私たちは7、その他11は、細胞外フラックスバイオアナライザーを使用して、無傷のCVE細胞における細胞生体エネルギーの評価を報告しています。アナライザは、内因性細胞生体エネルギー評価の利点を提供します。この感受性と一致するアッセイは、CVE細胞のミトコンドリア代謝を測定し、STIによって生体エネルギー障害を評価するために使用することができますMULIは、CVE細胞内のミトコンドリアの機能に影響を与えるミトコンドリアのシグナル伝達経路のメカニズム、および画面の薬や治療法を調査します。このプロトコルでは、ロテノン、及びアンチマイシンAのオリゴマイシン、カルボニルシアニド-4-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（FCCP）：酸素消費速度（OCRは）は、4つのミトコンドリア攪乱の使用を組み合わせることにより、薬理学的プロファイリングのアプローチを用いてバイオアナライザーによって記録されます我々は、詳細単一のアッセイで、測定および基底ミトコンドリア呼吸、ATP産生、プロトンリーク、最大呼吸、および予備呼吸容量を含むCVE細胞におけるミトコンドリア機能パラメータの計算を可能に最適化されたアプローチを。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">bEnd.3 cell line</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-2299</td>
			<td style="width:197px;">25-30 passages</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:147px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S12450</td>
			<td>10% in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Penicillin/Steptomycin</td>
			<td style="width:147px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30010</td>
			<td>1&#215;100 stocking</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">0.25% trypsin 0.03% EDTA solution</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-000-CI</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Glucose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CAS 50-99-7</td>
			<td>25 mM in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">O4876</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2920</td>
			<td>0.5 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Rotenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R8875</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CAS 1397-94-0</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Plate wash station</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux bioanayzer&#160;&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">XFe96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux cell culture plate</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux sensor cartridge</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux calibrant solution</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux assay medium</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102365-100</td>
			<td>PH buffered prior to assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells

血液脳関門（BBB）の完全性は、脳損傷を防ぐために重要です。脳血管内皮（CVE）細胞がBBBを構成する細胞の種類の一つです。これらの細胞は、最適なミトコンドリア機能を必要とする非常に高いエネルギー需要を有します。疾患または損傷の場合には、これらの細胞におけるミトコンドリア機能は、疾患またはBBBの開口部に生じる、変更することができます。本稿では、我々は全体の、無傷の細胞およびバイオアナライザーを使用して、CVE細胞内のミトコンドリア機能を測定する方法をご紹介します。ミトストレスアッセイは、物理的または化学的に、摂動された細胞をチャレンジし、それらの生体エネルギー機能を評価するために使用されます。さらに、この方法はまた、ミトコンドリア機能に直接影響を持っている新しい治療薬をスクリーニングする便利な方法を提供します。我々は、ミトコンドリアパラ様々な計算を可能にする酸素消費速度を得るために必要な細胞密度を最適化しましたATP産生、最大呼吸、および余力を含めメートル、。また、マイクロRNA、のmiR-34aの導入は、ミトコンドリア活性の顕著なおよび検出可能な減少をもたらすことを実証することによって、アッセイの感度を示しています。本論文で示したデータはのbEnd。3細胞株のために最適化されているが、我々はまた、前臨床および臨床モデルでの有用性を示唆し、一次CVE細胞のためのプロトコルを最適化しました。

酸化ストレスに応答して、CVE細胞の生体エネルギー機能を評価するために、我々は、原発性脳腫瘍の微小血管内皮細胞12と同じ比較バリア特性が表示され、マウスの脳微小血管内皮細胞株のbEnd。3を選択しました。応答の動態および相対強度は、種々の細胞型の間で変化させることは、最初の一連の実験を示す、代謝プロファイリングするためのアッセイで使用するのbEnd。3細胞の最適な数を特定することによって測定OCRレベルを得るように設計された、指定されました評価に続いて、図2は 、データを図3に定量化し、提示されている。基礎呼吸、最大呼吸、および予備の呼吸容量は細胞密度と比例応答を示しました。しかし、ATP産生が過剰コンフルエント細胞培養があることを示唆し、ウェル当たり64×10 3細胞を選択したときに減少しましたこの実験には適していません。ミトコンドリア攪乱に対する応答に基づいて、ウェル当たり32×10 3細胞、 -最適な細胞密度は8の間に発生します。 その後の実験のために、ウェル当たり16×10 3細胞の播種密度は、OCRの変化の最適な検出を可能にするために使用されました。ウェル当たり16×10 3細胞を使用して、我々は、OCRで予想される応答を観察し、マイクロRNAのmiR-34aはCVE細胞（ 図4）にミトコンドリアの機能を低下させることを実証しました。我々は以前のmiR-34aが、これらのセル13において酸化的リン酸化を減少させたことを報告しています。繰り返し実験はまた、最大の呼吸や予備容量を大幅に有意な変化を持っていなくても、基礎呼吸、ATP産生、およびプロトンリークかかわらず、トランスフェクションの24時間後でのCVEにおけるmiR-34aの過剰発現により減少したことを示した（ 図4） 。これらのデータCVEにおけるミトコンドリア機能の変化を検出するバイオアナライザーの感度を示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" /> 実験図1.戦略計画。セル、プレート、およびカートリッジの準備のためのタイムラインは示されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" /> 種々の細胞密度でCVE細胞における図形生体エネルギー関数の2代表的な生データを酸素消費速度は、異なる細胞密度でCVE細胞で測定しました。データは、平均±SDを表す（N = 5）。 OCR：酸素消費速度; FCCP：シアン化カルボニル-4-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン;<html>腐/アンチA：ロテノンとアンチマイシンAに①、②、③と基礎呼吸を示しています。 ④、⑤、⑥とATPが呼吸をリンクされている示しています。 ⑦、⑧、および⑨最大呼吸を示しています。 ⑩、⑪、および⑫非ミトコンドリア呼吸を示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" /> 様々な細胞密度を持つCVE細胞における生体エネルギー機能図3.代表的な結果。基礎呼吸、ATP産生、最大の呼吸、及び予備容量が第4節に示されている式を用いて、図2に生体エネルギー機能アッセイによって生成された生データから計算されています。データは平均±SD（n = 5）を表します。 OCR：酸素消費速度。<html> F = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" /> 図4：のmiR-34aの減少生体エネルギー機能の代表的な結果 （A）の24時間後、トランスフェクションでのmiR-34aの過剰発現は、以下のミトコンドリア機能の生データ。 （B）基礎呼吸、ATP生産、最大呼吸、及び空き容量を図4Aの生体エネルギー機能アッセイによって生成された生データから計算されます。パラメータは、のmiR-34aの第4節過剰発現に示した式で計算される24時間トランスフェクション後にCVE細胞でミトコンドリアの機能を低下させます。データは、平均±SDを表す（N = 5）。 OCR：酸素消費速度。 ****、P &lt;0.0001。ファイル/ ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" /> 表1.インストゥルメントを実行しますプロトコル。

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Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

内皮細胞のミトコンドリアは、血液脳関門の完全性を維持するために重要です。私たちは、脳血管内皮細胞に生体エネルギー機能を測定するためのプロトコルを紹介します。

脳血管内皮細胞での生体エネルギー機能の評価

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K ビュー.  West Virginia University. 内皮細胞のミトコンドリアは、血液脳関門の完全性を維持するために重要です。私たちは、脳血管内皮細胞に生体エネルギー機能を測定するためのプロトコルを紹介します。 

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Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The vesicles are then retrieved from the plasma membrane (endocytosis) and grouped together with the general pool of vesicles within the nerve terminal, until they undergo a new exo- and endocytosis cycle (vesicle recycling). These processes have been studied using a variety of techniques such as electron microscopy, electrophysiology recordings, amperometry and capacitance measurements. Importantly, during the last two decades a number of fluorescently labeled markers emerged, allowing optical techniques to track vesicles in their recycling dynamics. One of the most commonly used markers is the styryl or FM dye 1; structurally, all FM dyes contain a hydrophilic head and a lipophilic tail connected through an aromatic ring and one or more double bonds (Fig. 1B). A classical FM dye experiment to label a pool of vesicles consists in bathing the preparation (Fig. 1Ai) with the dye during the stimulation of the nerve (electrically or with high K+). This induces vesicle recycling and the subsequent loading of the dye into recently endocytosed vesicles (Fig. 1Ai-iii). After loading the vesicles with dye, a second round of stimulation in a dye-free bath would trigger the FM release through exocytosis (Fig. 1Aiv-v), process that can be followed by monitoring the fluorescence intensity decrease (destaining).

Although FM dyes have contributed greatly to the field of vesicle recycling, it is not possible to determine the exact localization or morphology of individual vesicles by using conventional fluorescence microscopy. For that reason, we explain here how FM dyes can also be used as endocytic markers using electron microscopy, through photoconversion. The photoconversion technique exploits the property of fluorescent dyes to generate reactive oxygen species under intense illumination. Fluorescently labeled preparations are submerged in a solution containing diaminobenzidine (DAB) and illuminated. Reactive species generated by the dye molecules oxidize the DAB, which forms a stable, insoluble precipitate that has a dark appearance and can be easily distinguished in electron microscopy 2,3. As DAB is only oxidized in the immediate vicinity of fluorescent molecules (as the reactive oxygen species are short-lived), the technique ensures that only fluorescently labeled structures are going to contain the electron-dense precipitate. The technique thus allows the study of the exact location and morphology of actively recycling organelles.

FM dyes have been of invaluable help in the understanding of synaptic dynamics. FMs are normally followed under the fluorescent microscope during different stimulation conditions. However, photoconversion of FM dyes combined with electron microscopy allows the visualization of distinct synaptic vesicle pools, among other ultrastructure components, in synaptic boutons.

スチリル染料の光変換を使用して、シナプス小胞プールの勉強

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

神経科学

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

CLARITY / CUBIC技術を用いたマウスの脊髄にセロトニン繊維のイメージング

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system. This system is constructed from a broadband white light source, a motorized filter wheel with a set of narrowband interference filters, a light guide, a collecting lens, a video zoom lens, and a monochromatic charged-coupled device (CCD) camera. An ellipsoidal cranial window is made in the skull bone of a rat under isoflurane anesthesia to capture in vivo multispectral diffuse reflectance images of the cortical surface. Regulation of the fraction of inspired oxygen using a gas mixture device enables the induction of different respiratory states such as normoxia, hyperoxia, and anoxia. A Monte Carlo simulation-based multiple regression analysis for the measured multispectral diffuse reflectance images at nine wavelengths (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, and 760 nm) is then performed to visualize the two-dimensional maps of hemodynamics and the light scattering properties of the in vivo rat brain.

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system.

脳血行動態との光散乱特性の同時評価<em&gt;インビボ</emマルチスペクトル拡散反射率イメージングの使用&gt;ラット脳

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and death, caused by white matter lesions in the spinal cord and cerebellum, as well as by demyelination in grey matter. Whilst conventional models of experimental allergic encephalomyelitis are suitable for the investigation of the cell-mediated inflammation in the spinal and cerebellar white matter, they fail to address grey matter pathologies. Here, we present the experimental protocol for a novel rat model of cortical demyelination allowing the investigation of the pathological and molecular mechanisms leading to cortical lesions. The demyelination is induced by an immunization with low-dose myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) in an incomplete Freund&#39;s adjuvant followed by a catheter-mediated intracerebral delivery of pro-inflammatory cytokines. The catheter, moreover, enables multiple rounds of demyelination without causing injection-induced trauma, as well as the intracerebral delivery of potential therapeutic drugs undergoing a preclinical investigation. The method is also ethically favorable as animal pain and distress or disability are controlled and relatively minimal. The expected timeframe for the implementation of the entire protocol is around 8 - 10 weeks.

The protocol presented here allows the reproduction of a widespread grey matter demyelination of both cortical hemispheres in adult male Dark Agouti rats. The method comprises of intracerebral implantation of a catheter, subclinical immunization against myelin oligodendrocyte glycoprotein, and intracerebral injection of a pro-inflammatory cytokine mixture through the implanted catheter.

炎症性サイトカインの脳内注射による広範囲にわたる大脳皮質脱髄のラットモデル

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウム イメージング

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...