このプロトコルは、骨格筋から微小血管内皮細胞を分離するプラットフォーム技術を記述する。これらの細胞は、例えば、血液筋関門機能に関するさらなる洞察を得るために使用することができる。既存の方法よりもこの技術の主な利点は、一次微小血管内皮細胞を高純度で単離することができるということです。
この技術は、健康と病気における筋肉と内皮細胞との相互作用などの免疫媒介性筋疾患の分野における重要な質問に答えるのに役立つ。まず、プロトコルに記載されているとおり、必要なすべてのソリューションと6ウェルプレートを準備します。実用的な手順を開始するには、外科的に鋭い/鈍いはさみ、外科用鋭い/鋭いはさみのペア、およびまっすぐおよび湾曲した鉗子のペアを得る。
70%エタノールですべての手術器具を消毒します。背中に安楽死させた成人男性マウスを置き、70%エタノールで脚を湿らせた。鋭い/鈍い外科用はさみを使用して、股関節で切断することによって各脚全体を切断する。
四肢を閉じた細胞培養皿に入れます。皿を無菌層流れフードに移します。鋭いはさみと湾曲した鉗子を使用して、腰からつま先の先端まで開いた皮膚を切り取ります。
湾曲した鉗子を使用してつま先から股関節まで皮膚を剥がしながら、ストレート鉗子を使用してつま先または足パッドを保持します。筋骨格系の四頭筋を分離するには、膝から腱を切り、大腿骨に沿って筋肉を股関節に切断する。筋肉性三頭筋スラエを分離するためにアキレス腱を切断します。
次に、脛素に沿って大きな窩に切り、筋肉を取り除きます。解離できない腱を取り除くために、湾曲した鉗子で筋肉を保持し、それぞれの適切な腱を切り落とす。2,445マイクロリットルの調製された消化液を新鮮なラベル付けされた細胞培養皿に加え、重量を決定します。
この皿にすべての筋肉片を移します。次に、重量を決定する。両方の測定値の差は、1グラムを超えてはならない筋肉組織の乾燥重量を提供する。
外科的な鋭いはさみを使用して、筋肉組織全体を小さく切る。37°Cで組織懸濁液を5%の二酸化炭素で1.5時間インキュベートし、20分ごとに1ミリリットルのインスリン注射器を約5分間慎重に混合します。インキュベーション後、50ミリリットルのラベル付きチューブに置かれた70マイクロメートルのナイロンストレーナーにサスペンションを移し、流れを通して集める。
8ミリリットルのDMEMで細胞ストレーナーを洗い、流れを通して集める。破片がストレーナーを差し込んでいる場合は、解体溶液を再中断します。セルストレーナーを捨て、サスペンションを300倍の重力で、摂氏20度で10分間遠心分離します。
上清を慎重に除去し、赤血球のリシスのための塩化アンモニウムカリウムライジングバッファーの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁します。室温で30秒間インキュベートします。次いで、反応を停止するために10%FCSを含むDMEMの9ミリリットルを加える。
細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。次に、ノイバウアー細胞計数チャンバーを使用して、細胞数を決定します。CD45陽性細胞の枯渇を開始するには、懸濁液を300倍の重力で、摂氏4度で10分間遠心分離する。
上清を完全に取り除き、90マイクロリットルのMCSバッファーで細胞ペレットを再懸濁します。10マイクロリットルのCD45マイクロビーズを加え、懸濁液を混ぜます。冷蔵庫で摂氏4~8度で15分間インキュベートします。
その後、1 ミリリットルの MCS バッファを追加します。300倍の重力で遠心分離機、摂氏4度で10分間。上清を完全に取り除き、500マイクロリットルのMCSバッファーで細胞を再懸濁します。
大きな磁気カラムをセパレータの磁場に配置します。カラムの貯留部を3ミリリットルのMCSバッファーでリンスします。次に、15ミリリットルの円錐チューブを柱の下に置き、流れを集めます。
列に全細胞懸濁液を塗布し、完全に流れてみましょう。各洗浄ステップの貯留層に3ミリリットルのMCSバッファーを加え、次の洗浄ステップを開始する前にカラムの貯蔵所が空になるまで待つことによって、カラムを3回洗浄します。さらに分離手順で使用するために、列を通過するラベルのないセルを収集します。
CD31陽性細胞の蓄積を開始するには、Neubauer細胞計数チャンバーを使用して細胞数を決定します。その後、ラベルなしの細胞を重力の300倍、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を完全に取り除き、90マイクロリットルのMCSバッファーにペレットを再懸濁します。
10マイクロリットルのCD31マイクロビーズを加え、懸濁液全体を混ぜます。冷蔵庫で摂氏4~8度で15分間インキュベートします。その後、300倍の重力でMCSバッファーと遠心分離機を1ミリリットル、摂氏4度で10分間加えます。
上清を取り除き、500マイクロリットルのMCSバッファーで細胞を再懸濁します。セパレータの磁場に中磁気カラムを配置します。500マイクロリットルのMCSバッファでカラムをすすいでください。
次に、15ミリリットルの円錐チューブを柱の下に置き、流れを集めます。セル全体の懸濁液を列に塗布し、完全に流れ込ませます。各洗浄工程のために500マイクロリットルのMCSバッファーをリザーバに加えてカラムを3回洗浄し、カラムの貯蔵所が空になるまで待ってから次の洗浄ステップを開始します。
列を通過するラベルのないセルは、CD45 マイナス、CD31-負の分数を表します。さらに品質管理のためにそれらを保存します。次に、セパレータからカラムを取り出し、適切なコレクションチューブの上に置きます。
柱にMCSバッファーのピペット2ミリリットル。すぐにプランジャーをカラムに押し込み、磁気標識されたセルをフラッシュします。この CD45 陰性、CD31 陽性の分数は、濃縮されたプライマリマウス IC を表します。
細胞懸濁液を重力350倍、摂氏20度で5分間遠心分離する。上清を完全に取り除き、内皮細胞培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁する。1ミリリットルの内皮細胞培地を含むコーティングされた6ウェル培養プレートの単一のウェルに細胞を移す。
培養の場合、無菌インキュベーターで5%の二酸化炭素を摂氏37度で培養し、2~3日ごとに培地をリフレッシュしてください。細胞が80〜90%合流のとき、2回連続した洗浄工程で2ミリリットルのPBSで細胞を2回含む各ウェルを洗い流す。その後、各ウェルに800マイクロリットルのトリプシンEDTA溶液を加え、3〜5分間無菌インキュベーターに5%の二酸化炭素を加えて摂氏37度でインキュベートします。
この後、少なくとも10%FCSを含むDMEMの1,200マイクロリットルを加えて酵素活性を停止する。350倍の重力で遠心分離機、摂氏20度で5分間。次いで、先に述べたようにCD31細胞を蓄積し、純度を高める。
20%倍率、0.35レンズの数値絞りを持つ明視野または標準位相収縮顕微鏡を使用して、細胞の合流を観察します。本研究では、原発性マウス骨格筋微小血管内皮細胞が単離されている。単離の翌日、原生マウスMMECsおよび残留細胞はコングロマリットを形成し、培養皿の底に付着する。
7日目以降、平らで細長い細胞が観察されるが、他の大部分のスフェロイド細胞の汚染はまだ見える。したがって、MCSを介したCD31陽性選択の別のサイクルが必要である。以下、原生マウスMMECは、合流時に約80〜90%の密度に増殖し、それらは通常、縦方向に整列した細胞の非重なり合う単層を形成する。
接触阻害により合流すると増殖が止まる。フローサイトメトリーによる品質管理は、分離直後の細胞に対してそれぞれ約70%の生存率と純度の両方の値を示しています。MCSを介して別のCD31陽性選択の後に培養された細胞は、純度と生存率に対する満足度を示し、それぞれ95%まで及ぶ。
得られた細胞は、次に、mRNAレベルでのボックスプロテイン7およびM-カドヘリンを組み合わせた筋衛星細胞マーカー遺伝子の遺伝子発現について定量的PCRにより調べる。予想通り、CD45陰性、CD31陰性分数、ならびに分化した一次マウス筋細胞のみがボックスプロテイン7およびMカドヘリンを発現し、CD45陰性、CD31陽性および一次マウスMMECはこれらのマーカーに対して陰性である。第2CD31 MCSステップの後、qPCRはコンフルエントプライマリマウスMMECsにおけるタイトな接合タンパク質の発現を評価するために使用される。
原発性マウスMMECは、クローディン-5、オクルジン、ゾヌラオクルデンス-1の高レベルを発現することが見られるのに対し、pmMCはゾヌラオクルデンス-1の低い発現しか示さなく見られる。この技術は5〜6時間で行うことができる。このプロトコルに従って、移行アッセイまたは低せん断応力実験のような他の方法は、追加の質問に答えるために行うことができる。
このビデオを見た後, あなたは力学と酵素解離と磁気細胞のソートによって骨格筋から原発性微小血管内皮細胞を分離することができるはずです.
