Name: quantification of cerebral vascular architecture using two-photon microscopy in a mouse model of hiv-induced neuroinflammation
Uploaded: 2016-01-12T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
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We thank Maria Jepson, Dr. Paivi Jordan, and Dr. Linda Callahan at the University of Rochester Multiphoton Core for technical advice throughout the completion of this protocol. We also thank Dr. Changyong Feng for expert statistical advice, and Dr. Maiken Nedergaard at the University of Rochester Medical Center for the headplate design used in this paper. This work was supported in part by grants T32GM007356 and R01DA026325 from the National Institutes of Health (NIH); and by the University of Rochester Center for AIDS Research grant P30AI078498 (NIH).

動物資源上ロチェスター大学の大学の委員会は、本論文で実行されたすべての手順を承認しました。 1.手術前の準備（およびマウス） <ol><li>必要なすべての機器と手術領域を準備します。事前に70％エタノールを使用して、手順の間に使用されるすべてのツールを滅菌します。必要に応じて、ツールを殺菌するためにガラスビーズ滅菌器やオートクレーブを使用します。 </li><li>イソフルラン気化器に接続されたイソフルラン誘導チャンバー内にマウスを置きます。 1リットル/分の速度で4％イソフルランレベルを設定します。 注意：アストロサイト固有のグリア線維性タンパク質（GFAP）プロモーター（HIVのTat-Tgマウス）で駆動ドキシサイクリン（DOX）誘導性HIV-1 Tatの導入遺伝子とここで報告された実験では、マウスで10 HIVの影響を調べるために使用されました以前に7,10に記載されているように -1、脳血管構造の神経炎症を誘導しました。 </li><li>静かにマウスを観察するために、誘導室にチップ＆＃39; sの立ち直り反射。立ち直り反射が抑制された後、2％にイソフルランレベルを設定し、外科的なベンチでノーズコーンに誘導室からの空気流の方向を変えます。 </li><li>すぐに水注入された加熱パッドに誘導室からマウスを移動します。ノーズコーンを介してイソフルラン（1.5から2パーセント）を適用し続けます。呼吸数（RR）モニタリングによって評価個々のマウスの許容範囲に応じて麻酔を調整します。 注：RRのうつ病は脳の血流および血管径の評価を変更するガスの生理学的パラメータを乱すことができます。毎分55〜65呼吸の間RRを維持しようとしました。心拍数（HR）は、麻酔の深さを評価に使用することができます。血管径の生理学的変化を防止するために、毎分300〜450拍の間で人事を保ちます。一般的に、麻酔を与えられたマウスでは1リットル/分で1.5から2.0パーセントのイソフルランの間で十分です。 </li><li>さらに、麻酔の深さを確認するためにつま先のピンチを実行します。マウスは、COMMが応答しない場合外科手術レンス。 </li></ol>薄頭蓋骨頭蓋窓の調製<ol><li>マウスの目に人工涙ゲルを適用します。完全にハサミや電気かみそりを使用して、マウスの頭皮から髪を削除します。 </li><li>ポビドンヨード溶液を適用することによって頭皮の殺菌。乾燥させます。その後、光学顕微鏡下で、完全にマーキング頭頂骨、尾正面の骨、およびブレグマを露出させ、マウスの頭皮から皮膚を除去。 </li><li>簡単に除去するための膜を乾燥させるために頭蓋骨に10％塩化第二鉄溶液の少量を適用します。静かに頭蓋骨をこすることによって＃45分の5鉗子で乾燥した膜を除去します。 </li><li>ヘッドプレートウィンドウの周りに接着剤の薄層を適用します。静かにウィンドウの中央に関心領域を保ち、マウスの頭蓋骨に対してヘッドプレートを押してください。接着剤を重合するヘッドプレートに歯科用セメントの低下を適用します。 </li><li>薄く塗りますヘッドプレートウィンドウの端に沿って接着剤の生理食塩水を保持するリザーバを作成することができます。接着剤が乾燥した後、マウスのヘッドプレートハーネスにヘッドプレートをネジ止めします。 注：この手順で使用したマウスのヘッドプレートハーネスは、金属ベースと二つの金属柱を持つ構造体です。各列の1春と1蝶ナットがあります。ヘッドプレートは、バネの上に配置され、ヘッドが水平であり、移動しなくなるまで蝶ナットが締め付けられます。 </li><li> 6,000 rpmで設定microtorqueドリルに取り付けられたドリルビットを使用してヘッドプレートウィンドウから任意の接着剤を除去します。血管への構造的な損傷を与えることができ、マウスの頭蓋の過熱を防止するために、すべての10〜15秒を停止します。 <ol><li>新しいドリルビットを使用して、正中線（ヘッドプレートウィンドウの直径の三分の一）から横方向にmicrotorqueドリル1.5ミリメートルを配置します。 4,000 rpmで、この場所の周りに薄い頭蓋骨に開始します。直接的な下向きの圧力で頭蓋骨をそっとドリルを移動します。 </li><li> drilを中止マウスの頭蓋の過熱を防ぐために、玲ごとに10〜15秒。この時間の間に、圧縮空気の缶を使用して、蓄積された頭蓋骨のほこりを取り除きます。 </li><li> 5-10秒間頭蓋骨を冷却するためにRT生理食塩水の滴を使用してください。静かに頭蓋骨間伐を継続するために、軟組織とすべての液体を除去します。 </li></ol></li><li>頭蓋骨の最終薄化のために、ヘッドプレートリザーバ内に生理食塩水の小さなボリュームを置き、軽く小さな血管がはっきりと見えるようになるまで関心のある領域にわたって歯科マイクロブレードを掃引。 </li></ol>生理的パラメータの3モニタリング<ol><li>頭蓋骨が完全に薄くされた後、ホルダーからマウスをデタッチし、その背中の上に置きます。ゆっくりはっきりと内側の太ももを露出するために、両方の後ろ足を下にテープで固定します。 </li><li>ハサミや電気シェーバーで両方の内側の太ももの上に髪を削除します。ポビドンヨードで太ももを覆うことにより、手術部位を消毒します。 </li><li>大腿静脈上記内側右腿の皮膚をつまんで＃5ピンセットを使用して動脈。そっと上向きに皮膚を引っ張って皮膚をカットし、削除するためにハサミを使用しています。 注：左大腿は、外科的合併症（血管奇形、破裂した血管）のイベントに予約されています。 </li><li>手術部位に0.9％生理食塩水の約3〜5滴を適用します。これは、血管のより大きな倍率だけでなく、血管のしっとりサイトを保ち、乾燥防止することができます。ぶっきらぼう2＃45分の5ピンセットを用いて大腿神経血管束に解剖することにより、動脈から大腿静脈を分離します。 </li><li>約1cm離れて大腿動脈の下手術用縫合糸の2、3センチメートルピースを置きます。カテーテル挿入時に過度の血液の損失を防ぐのに役立ちます血管止血帯を作成するために、上部の縫合糸を時計回りに回します。 </li><li>春のはさみを使用して大腿動脈に小さな切開を行います。カテーテルが動脈内に確実になるまで切開し、事前を通じて動脈にカテーテルを配置します。 </li><li&gt;が漏れ、適切なカテーテル留置のために評価するために、上部の縫合糸（止血帯を）のねじれを広げ。縫合糸を使用して血管内にカテーテルの周りに2ノットを結ぶことにより、大腿動脈にカテーテルを固定します。 </li><li>血液凝固を防ぐために、カテーテルを介してヘパリンを10μl（100 IU / ml）を注入します。次に、外科的に単純な中断パターンで4-0縫合糸と一緒に皮膚を縫合することにより、右腿を閉じます。 </li><li>腹腔内に右下腹部にウレタンを50μl（1.2ミリグラム/ g）を注入します。五分後に腹腔内ウレタン100μlの合計左下腹部に別の50μlの注入を繰り返します。同時に、麻酔の深さのために、マウスを再確認しながら、ゆっくりと約0.25％にイソフルランレベルを減少させます。 注：それは腸を穿孔しないように後部腹壁に沿って腹腔内表面的な針を保管してください。これは、腹部直筋ムーをつまんで達成することができます離れて内臓から、その後注入scles。 </li><li>毛細管を使用して、カテーテルから動脈血の40μlのサンプルを収集します。生理食塩水で満たされた、四方コックとヘパリンを充填した注射器を装着し、血圧トランスデューサにカテーテルを取り付けます。 </li><li>カテーテルの意図しない取り外しを防止するための外科用装置に血圧トランスデューサをテープ。平均動脈圧の監視を開始します。 </li><li>血液ガス分析装置の入口ポートへの血液充填したキャピラリーチューブを挿入します。すべての血液が抽出されると、入口から毛細管を削除します。 O 2、CO 2、血液ガスレベルは、血液ガス分析装置から印刷された紙の上に表示されます。 </li></ol>蛍光色素の4注入<ol><li> ＃5ピンセットを用いて、内側左太ももの皮膚をつまんで。そっと上向きに皮膚を引っ張って皮膚をカットし、削除するためにハサミを使用しています。デキストラン共役赤色発光ローダミン色素を準備（70キロダルトン）（生理食塩水に溶解した10mg / kgの）。 </li><li>付属の30 G針で1mlシリンジをvein.Using大腿骨を見つけ、シリンジの130μlのラインへのイメージングのための適切な蛍光色素の先に調製した溶液を描画します。注射器に完全に染料を描画し、しっかりとシリンジ壁をフリックして、すべての気泡を除去します。 <ol><li>ベンド硬質表面ベベル面を上に押し付けることで約30度の角度で30 G針。染料で針を記入し、余分な液体を捨て、100μlのサンプルを残します。 </li></ol></li><li>ゆっくりと大腿静脈に色素の100μlのサンプルを注入します。針を除去した後、任意の出血を止めるために注射部位に安定し、静かに圧力をかけます。色素が5分間循環させます。 注意：代替的に、右大腿静脈に別の手術部位の創出を通じてさらなる血液損失を防止するために、蛍光色素の注入のために代わりに使用することができます。加えて、もし動物は、これはあまりにも多くのヘパリンは、カテーテルをフラッシュするために与えられたことを示している可能性があり、手術部位から制御不能出血しています。そこには凝固が10〜15分以内でないとマウスがまだ出血している場合は、新しいマウスを用いた実験を再開することを検討してください。 </li><li>その胃の上にマウスを反転し、マウスのヘッドプレートハーネスにそれを置き、慎重に、その後、4-0縫合糸と一緒に皮膚を縫合することにより、左太ももを閉じます。 </li></ol> 生体内二光子イメージング5. <ol><li>連続麻酔レベルを維持するために確認して、二光子顕微鏡に手術装置を移動します。ヘッドプレートのリザーバに0.9％生理食塩水の少量を置き、生理食塩水と接触するように、顕微鏡対物レンズを下げます。明視野対物レンズを用いて、関心領域の位置を確認します</li><li>蛍光色素のために適切な波長の二光子レーザー励起を設定します。 25X Oを用いた2光子イメージングを開始しますbjective。 これらの実験で、我々は波長780nmで励起した赤色発光ローダミン色素に結合させたデキストランを使用することに注意してください。色素からの蛍光を検出するための発光フィルタをバンドパス、および20分の480バンドパス放射フィルタは、動脈自己蛍光を検出するために使用した36分の607 </li><li>ビュー画面上の毛細血管床を見つけて、光学ズームを2光子イメージングソフトウェアを使用して、毛細血管の2獲得画像を使用して、このエリアを拡大。 </li><li>イメージングが完了した後、断頭続いて頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。 </li></ol> 6. エクスビボ二光子イメージング<ol><li>極細ハサミを使用して、マウスの正面骨に壁間の骨から頭皮に切開を行います。ポインタ指と親指で頭蓋骨の側面に皮膚を保護します。 </li><li>内側頭頂間骨の下極細ハサミを置き、矢状縫合に沿って頭蓋骨をカット。ブレグマをマーキングした後、約3mmの頭蓋骨を切断停止します。 注：脳を切断しないようにする頭蓋骨を切断する際に上向きの圧力を適用します。 </li><li> ＃5鉗子を使用して、脳から頭蓋骨を分離し、慎重に脳の表面から髄膜を除去します。残りの髄膜は、誤って脳を切ることができます。細心の注意は、これを避けるために注意すべきです。脳が頭蓋骨から外れるまで静かに前方にゆっくりと進行する脳の下の＃5鉗子をスライドさせます。 注意：下向きの圧力が脳を刺さないようにするために使用されるべきであること。 </li><li>マウスのための特定の脳切片ツールで脳を置きます。脳の上に人工脳脊髄液の液滴を適用することにより、脳を洗ってください。 </li><li>ブレグマにブレグマ0から脳の2ミリメートル冠状断面を取り外し-2。上を向い0ブレグマと人工脳脊髄液を含む凹状のスライドガラス上に冠状断面（断面の最も頭側の部分）を配置します。静かに脳SLをカバーガラスカバースリップと氷。 注：これは、血管アーキテクチャを変形させることのように一度脳部に配置されたガラスを押す避けてください。 </li><li>顕微鏡ステージにスライドを移し、カバースリップ上の0.9％生理食塩水を少量入れます。それは生理食塩水に接触するまで、顕微鏡の対物レンズを下げます。明視野対物レンズを用いて脳の正中線の位置を確認します。 </li><li>二光子イメージングを開始し、再び25倍対物レンズを用いて正中線を探します。冠状断面の皮質表面に縦亀裂を探して、これを達成します。正中線の撮影画面の右端を置き、横方向に3完全なフレーム（正中線から約1.5 mm）をビューア画面を上に移動。 これらの実験では、撮像パラメータは、ステップ5.2でノートに記載されたものと同一であったことに注意してください。 </li><li>毛細血管がビュー画面上でかろうじて見えるれる深さの位置を確認します。焦点さらに20の平面を下げますμmでは、zスタックの先頭を決定します。 </li><li> 1μmの画像の厚さを設定します。 100ミクロンのビュー画面を下げて、各画素の1％未満が過飽和となるように全体にレーザーパワーを調整します。 注意：zスタック画像は100の連続した​​500x500x1ミクロン一連の画像からコンパイルされます。より正確な後処理の計算がされるzスタック大きいです。一般的には、100μm以上のzスタックを収集しようとします。 </li><li>隣接するX-Yのアイコンが続くXYリピートアイコンを押します。 zスタックが完了すると、 シリーズ完了アイコンを押して、ファイルを保存します。 </li></ol> 7.データ処理<ol><li> ImageJソフトウェアにおける in vivo毛細血管画像を開きます。手動で二光子ソフトウェアから得られた値に基づいて距離比のピクセルを設定します。 <ol><li> [ツール]メニューから*ストレート*アイコンを選択します。親しい同僚に1毛細血管壁から伸びる線を引きサイトの毛細血管壁、とのImageJで提供さ長さを記録します。 それは明らかに毛細血管壁のエッジを可視化するために、画像にズームインする必要があるかもしれないことに注意してください。 </li><li>繰り返しキャピラリーに沿った異なる位置でのステップ7.1.1と同様に、画像内の複数のキャピラリ。 </li></ol></li><li>そのようなアミラなどの分析ソフトウェアにzスタックファイルを開きます。サブアプリケーションツールバーからフィラメントエディタのアイコンを選択 <ol><li>約20に、視聴者の厚さを設定zスタックの上部または下部のいずれかにビューアを移動します。 </li><li> トレースアイコンを選択し、ロードされた画像の上にカーソルを移動します。 図2Cに記載された場所での毛細血管上のノードを配置します。セグメントは自動的に隣接するノード間で表示されます。全体zスタック全体に毛細血管をトレースします。 注：これは毛細血管を追跡するために、エンドポイントと分岐点との間のノードを配置する必要があるTHRzスタックoughout。 </li><li>これらのノードを削除するには、 中間のアイコンを削除]をクリックします 。 注：これは、 選択1つのアイコンを使用してループを選択することにより、手動で削除する必要があり、誤ったループセグメントを作成し、[削除選択アイコンを選択することができます。ループがトレース中に同じ領域に表示し続ける場合は、ノードが別の毛細血管に配置した可能性があります。 </li><li>トレースが完了すると、自動的に抽出された血管のパラメータを含むスプレッドシートを開くために、グラフ情報]アイコンを選択します。ノードとセグメントの数は、メインビュー画面で利用可能です。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここに記載された方法は、実験モデル/設定の広範囲の脳微小血管構造を分析するために適用することができます。この方法の成功のために、3つの重要なステップを習得する必要があります。まず、薄頭蓋骨窓は、頭蓋骨または基礎脳に損傷を与えてはなりません。それは間伐時に頭蓋骨に穴を開け、または熱誘導性の血管漏出を引き起こすことは容易です。蛍光色素は、焦点面に漏出し、?...

ヒト免疫不全ウイルス1（HIV-1）ウイルス感染の急性期の間に脳に侵入し、かつ生産両方ミクログリア及び脳の常在マクロファージ、それらの活性化につながる感染 - 及び両方宿主由来の炎症性メディエーターおよび可溶性HIV-1の放出をそのような（1,2に見直さ）Tatおよびgp120のようvirotoxins。その結果、慢性神経炎症状態は、HIV-1関連神経認知障害（手）3-5の病因に寄与していると考えられるCNS、に設立されてしまいます。 HIV-1のTatまたはマウスのCNS ​​内のインターロイキン（IL）-17Aの慢性的過剰発現は、微小血管希薄6,7をもたらすことが示されています。これには、慢性神経炎症が脳血管系への影響を介して手の病因に貢献するかもしれないという可能性を提起します。さらに、この問題を調べるために、我々は、脳血管STRUCを定量化する方法を開発しましたトゥーレス。 この論文では、セグメント長、総セグメントの長さを意味する毛細管の直径、及び薄い頭骨皮質窓を通して毛細管ネットワークのインビボイメージングに用いて全毛細管容積平均、毛細管ノード、キャピラリーセグメントの数を定量化するための方法を記載して（前述の修飾されましたプロトコル）8,9、ならびに二光子顕微鏡を用いて脳切片の ex vivoイメージング。脳スライス内の毛細血管網の ex vivoイメージングは、三次元、完全な再構築を可能にしながら、in vivoでの薄頭蓋骨皮質ウィンドウは、脳環境の保全を可能にするので、この組み合わせアプローチは、脳血管のパラメータの全体的な定量を提供します毛細血管ネットワーク - 次に、市販のソフトウェアを用いて定量することができます。

<table><tbody><tr><td>Leica Microscope</td><td>Leica Inc.</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>High Intensity Illuminator</td><td>Dolan-Jenner</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>Heating Pad</td><td>Stryker&amp;nbsp;</td><td>TP3E</td><td></td></tr><tr><td>T/PUMP</td><td>Gaymar Industries, Inc.</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>TEC-4 Isoflurane Vaporizer</td><td>Datex Ohmeda</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>Artificial Tear Gel</td><td>Butler AHS</td><td>7312</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Iodine solution&amp;nbsp;</td><td>Aplicare</td><td>52380-1855-9</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumot #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Ferric Chloride Solution</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-16</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel</td><td>Henkel</td><td>45404</td><td></td></tr><tr><td>Dental Cement</td><td>Stoelting</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>Microtoruqe II Handpiece Kit</td><td>Pearson Dental</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>005 Burr for Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Norland Blade (Dental Microblade)</td><td>Salvin Dental</td><td>6900</td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td>Group 2B Carcinogen</td></tr><tr><td>Braided Suture</td><td>Ethicon</td><td>735G</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Arterial Catheter</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>MAC-01</td><td>The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Blood Pressure Moniter</td><td>World Precision Intruments</td><td>SYS-BP1</td><td></td></tr><tr><td>Blood Pressure Transducer and Cable</td><td>World Precision Intruments</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>RAPIDLab Blood Gas Analyzer&amp;nbsp;</td><td>Siemens&amp;nbsp;</td><td>248</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;l Capillary Tube</td><td>VWR</td><td>15401-413</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline)</td><td>Invitrogen</td><td>D-1830</td><td></td></tr><tr><td>Adult Mouse Brain Slicer Matrix</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope</td><td>Olypmus</td><td>FV-1000 MPE</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td>Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Amira Software</td><td>Visage Imaging&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantification of cerebral vascular architecture using two-photon microscopy in a mouse model of hiv-induced neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

薄頭蓋骨皮質ウィンドウは、皮質毛細血管の in vivo二光子イメージング（ 図1）を可能にします。画像に適した領域は、多数の、明確な毛細血管（ 図1A）を示しています 。同じ視野において、いかなる動脈細胞壁の自己蛍光が存在しない、第二高調波11（ 図1B）によって誘導されるコラーゲンの蛍光などの他の蛍光?...

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Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K ビュー.  University of Rochester Medical Center. This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

ビデオ: Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoで</em神経炎症のモデルのマウスミクログリアの>イメージング

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

神経科学

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

マウスにおける反復低酸素プレコンディショニングと過渡中大脳動脈閉塞後に神経血管保護の定量

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

医学

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

縦<em&gt;インビボ</em&gt;脳血管系のイメージング：中枢神経系疾患との関連

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the regulation of cerebral blood flow (CBF) is incompletely understood, especially at the capillary level. Two-photon microscopy is a powerful tool widely used to study CBF and its regulation. Currently, this field is limited by the lack of in vivo two-photon microscopy studies examining (1) CBF responses in three-dimensions, (2) conducted vascular responses, and (3) localized interventions within the vascular network. Here, we describe a 3D in vivo method using two-photon microscopy to study conducted vascular responses elicited by&#160;local ejection of ATP with a glass micro-pipette. Our method uses fast and repetitive hyperstack two-photon imaging providing precise diameter measurements by maximal intensity projection of the obtained images. Furthermore, we show that this method can also be used to study 3D astrocytic calcium responses. We also discuss the advantages and limitations of glass micro-pipette insertion and two-photon hyperstack imaging.

We present an optimized local ejection procedure using a glass micro-pipette and a fast two-photon hyperstack imaging method, which allows precise measurement of capillary diameter changes and investigation of its regulation in three dimensions.

ガラスマイクロピペットを用いて局所ATP吐出による血管応答を研究する生体内3次元2光子顕微鏡検査

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

免疫・感染学

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.

HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

要約

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慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoでイメージング

クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

マウスにおける反復低酸素プレコンディショニングと過渡中大脳動脈閉塞後に神経血管保護の定量

縦

血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化

磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡

くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

ガラスマイクロピペットを用いて局所ATP吐出による血管応答を研究する生体内3次元2光子顕微鏡検査

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

インビボマウス海馬におけるミクログリアの慢性二光子イメージング

HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

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慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoでイメージング

クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

マウスにおける反復低酸素プレコンディショニングと過渡中大脳動脈閉塞後に神経血管保護の定量

縦

血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化

磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡

くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

ガラスマイクロピペットを用いて局所ATP吐出による血管応答を研究する生体内3次元2光子顕微鏡検査

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

インビボ マウス海馬におけるミクログリアの慢性二光子イメージング

インビボマウス海馬におけるミクログリアの慢性二光子イメージング