We thank Maria Jepson, Dr. Paivi Jordan, and Dr. Linda Callahan at the University of Rochester Multiphoton Core for technical advice throughout the completion of this protocol. We also thank Dr. Changyong Feng for expert statistical advice, and Dr. Maiken Nedergaard at the University of Rochester Medical Center for the headplate design used in this paper. This work was supported in part by grants T32GM007356 and R01DA026325 from the National Institutes of Health (NIH); and by the University of Rochester Center for AIDS Research grant P30AI078498 (NIH).

動物資源上ロチェスター大学の大学の委員会は、本論文で実行されたすべての手順を承認しました。 1.手術前の準備（およびマウス） <ol><li>必要なすべての機器と手術領域を準備します。事前に70％エタノールを使用して、手順の間に使用されるすべてのツールを滅菌します。必要に応じて、ツールを殺菌するためにガラスビーズ滅菌器やオートクレーブを使用します。 </li><li>イソフルラン気化器に接続されたイソフルラン誘導チャンバー内にマウスを置きます。 1リットル/分の速度で4％イソフルランレベルを設定します。 注意：アストロサイト固有のグリア線維性タンパク質（GFAP）プロモーター（HIVのTat-Tgマウス）で駆動ドキシサイクリン（DOX）誘導性HIV-1 Tatの導入遺伝子とここで報告された実験では、マウスで10 HIVの影響を調べるために使用されました以前に7,10に記載されているように -1、脳血管構造の神経炎症を誘導しました。 </li><li>静かにマウスを観察するために、誘導室にチップ＆＃39; sの立ち直り反射。立ち直り反射が抑制された後、2％にイソフルランレベルを設定し、外科的なベンチでノーズコーンに誘導室からの空気流の方向を変えます。 </li><li>すぐに水注入された加熱パッドに誘導室からマウスを移動します。ノーズコーンを介してイソフルラン（1.5から2パーセント）を適用し続けます。呼吸数（RR）モニタリングによって評価個々のマウスの許容範囲に応じて麻酔を調整します。 注：RRのうつ病は脳の血流および血管径の評価を変更するガスの生理学的パラメータを乱すことができます。毎分55〜65呼吸の間RRを維持しようとしました。心拍数（HR）は、麻酔の深さを評価に使用することができます。血管径の生理学的変化を防止するために、毎分300〜450拍の間で人事を保ちます。一般的に、麻酔を与えられたマウスでは1リットル/分で1.5から2.0パーセントのイソフルランの間で十分です。 </li><li>さらに、麻酔の深さを確認するためにつま先のピンチを実行します。マウスは、COMMが応答しない場合外科手術レンス。 </li></ol>薄頭蓋骨頭蓋窓の調製<ol><li>マウスの目に人工涙ゲルを適用します。完全にハサミや電気かみそりを使用して、マウスの頭皮から髪を削除します。 </li><li>ポビドンヨード溶液を適用することによって頭皮の殺菌。乾燥させます。その後、光学顕微鏡下で、完全にマーキング頭頂骨、尾正面の骨、およびブレグマを露出させ、マウスの頭皮から皮膚を除去。 </li><li>簡単に除去するための膜を乾燥させるために頭蓋骨に10％塩化第二鉄溶液の少量を適用します。静かに頭蓋骨をこすることによって＃45分の5鉗子で乾燥した膜を除去します。 </li><li>ヘッドプレートウィンドウの周りに接着剤の薄層を適用します。静かにウィンドウの中央に関心領域を保ち、マウスの頭蓋骨に対してヘッドプレートを押してください。接着剤を重合するヘッドプレートに歯科用セメントの低下を適用します。 </li><li>薄く塗りますヘッドプレートウィンドウの端に沿って接着剤の生理食塩水を保持するリザーバを作成することができます。接着剤が乾燥した後、マウスのヘッドプレートハーネスにヘッドプレートをネジ止めします。 注：この手順で使用したマウスのヘッドプレートハーネスは、金属ベースと二つの金属柱を持つ構造体です。各列の1春と1蝶ナットがあります。ヘッドプレートは、バネの上に配置され、ヘッドが水平であり、移動しなくなるまで蝶ナットが締め付けられます。 </li><li> 6,000 rpmで設定microtorqueドリルに取り付けられたドリルビットを使用してヘッドプレートウィンドウから任意の接着剤を除去します。血管への構造的な損傷を与えることができ、マウスの頭蓋の過熱を防止するために、すべての10〜15秒を停止します。 <ol><li>新しいドリルビットを使用して、正中線（ヘッドプレートウィンドウの直径の三分の一）から横方向にmicrotorqueドリル1.5ミリメートルを配置します。 4,000 rpmで、この場所の周りに薄い頭蓋骨に開始します。直接的な下向きの圧力で頭蓋骨をそっとドリルを移動します。 </li><li> drilを中止マウスの頭蓋の過熱を防ぐために、玲ごとに10〜15秒。この時間の間に、圧縮空気の缶を使用して、蓄積された頭蓋骨のほこりを取り除きます。 </li><li> 5-10秒間頭蓋骨を冷却するためにRT生理食塩水の滴を使用してください。静かに頭蓋骨間伐を継続するために、軟組織とすべての液体を除去します。 </li></ol></li><li>頭蓋骨の最終薄化のために、ヘッドプレートリザーバ内に生理食塩水の小さなボリュームを置き、軽く小さな血管がはっきりと見えるようになるまで関心のある領域にわたって歯科マイクロブレードを掃引。 </li></ol>生理的パラメータの3モニタリング<ol><li>頭蓋骨が完全に薄くされた後、ホルダーからマウスをデタッチし、その背中の上に置きます。ゆっくりはっきりと内側の太ももを露出するために、両方の後ろ足を下にテープで固定します。 </li><li>ハサミや電気シェーバーで両方の内側の太ももの上に髪を削除します。ポビドンヨードで太ももを覆うことにより、手術部位を消毒します。 </li><li>大腿静脈上記内側右腿の皮膚をつまんで＃5ピンセットを使用して動脈。そっと上向きに皮膚を引っ張って皮膚をカットし、削除するためにハサミを使用しています。 注：左大腿は、外科的合併症（血管奇形、破裂した血管）のイベントに予約されています。 </li><li>手術部位に0.9％生理食塩水の約3〜5滴を適用します。これは、血管のより大きな倍率だけでなく、血管のしっとりサイトを保ち、乾燥防止することができます。ぶっきらぼう2＃45分の5ピンセットを用いて大腿神経血管束に解剖することにより、動脈から大腿静脈を分離します。 </li><li>約1cm離れて大腿動脈の下手術用縫合糸の2、3センチメートルピースを置きます。カテーテル挿入時に過度の血液の損失を防ぐのに役立ちます血管止血帯を作成するために、上部の縫合糸を時計回りに回します。 </li><li>春のはさみを使用して大腿動脈に小さな切開を行います。カテーテルが動脈内に確実になるまで切開し、事前を通じて動脈にカテーテルを配置します。 </li><li&gt;が漏れ、適切なカテーテル留置のために評価するために、上部の縫合糸（止血帯を）のねじれを広げ。縫合糸を使用して血管内にカテーテルの周りに2ノットを結ぶことにより、大腿動脈にカテーテルを固定します。 </li><li>血液凝固を防ぐために、カテーテルを介してヘパリンを10μl（100 IU / ml）を注入します。次に、外科的に単純な中断パターンで4-0縫合糸と一緒に皮膚を縫合することにより、右腿を閉じます。 </li><li>腹腔内に右下腹部にウレタンを50μl（1.2ミリグラム/ g）を注入します。五分後に腹腔内ウレタン100μlの合計左下腹部に別の50μlの注入を繰り返します。同時に、麻酔の深さのために、マウスを再確認しながら、ゆっくりと約0.25％にイソフルランレベルを減少させます。 注：それは腸を穿孔しないように後部腹壁に沿って腹腔内表面的な針を保管してください。これは、腹部直筋ムーをつまんで達成することができます離れて内臓から、その後注入scles。 </li><li>毛細管を使用して、カテーテルから動脈血の40μlのサンプルを収集します。生理食塩水で満たされた、四方コックとヘパリンを充填した注射器を装着し、血圧トランスデューサにカテーテルを取り付けます。 </li><li>カテーテルの意図しない取り外しを防止するための外科用装置に血圧トランスデューサをテープ。平均動脈圧の監視を開始します。 </li><li>血液ガス分析装置の入口ポートへの血液充填したキャピラリーチューブを挿入します。すべての血液が抽出されると、入口から毛細管を削除します。 O 2、CO 2、血液ガスレベルは、血液ガス分析装置から印刷された紙の上に表示されます。 </li></ol>蛍光色素の4注入<ol><li> ＃5ピンセットを用いて、内側左太ももの皮膚をつまんで。そっと上向きに皮膚を引っ張って皮膚をカットし、削除するためにハサミを使用しています。デキストラン共役赤色発光ローダミン色素を準備（70キロダルトン）（生理食塩水に溶解した10mg / kgの）。 </li><li>付属の30 G針で1mlシリンジをvein.Using大腿骨を見つけ、シリンジの130μlのラインへのイメージングのための適切な蛍光色素の先に調製した溶液を描画します。注射器に完全に染料を描画し、しっかりとシリンジ壁をフリックして、すべての気泡を除去します。 <ol><li>ベンド硬質表面ベベル面を上に押し付けることで約30度の角度で30 G針。染料で針を記入し、余分な液体を捨て、100μlのサンプルを残します。 </li></ol></li><li>ゆっくりと大腿静脈に色素の100μlのサンプルを注入します。針を除去した後、任意の出血を止めるために注射部位に安定し、静かに圧力をかけます。色素が5分間循環させます。 注意：代替的に、右大腿静脈に別の手術部位の創出を通じてさらなる血液損失を防止するために、蛍光色素の注入のために代わりに使用することができます。加えて、もし動物は、これはあまりにも多くのヘパリンは、カテーテルをフラッシュするために与えられたことを示している可能性があり、手術部位から制御不能出血しています。そこには凝固が10〜15分以内でないとマウスがまだ出血している場合は、新しいマウスを用いた実験を再開することを検討してください。 </li><li>その胃の上にマウスを反転し、マウスのヘッドプレートハーネスにそれを置き、慎重に、その後、4-0縫合糸と一緒に皮膚を縫合することにより、左太ももを閉じます。 </li></ol> 生体内二光子イメージング5. <ol><li>連続麻酔レベルを維持するために確認して、二光子顕微鏡に手術装置を移動します。ヘッドプレートのリザーバに0.9％生理食塩水の少量を置き、生理食塩水と接触するように、顕微鏡対物レンズを下げます。明視野対物レンズを用いて、関心領域の位置を確認します</li><li>蛍光色素のために適切な波長の二光子レーザー励起を設定します。 25X Oを用いた2光子イメージングを開始しますbjective。 これらの実験で、我々は波長780nmで励起した赤色発光ローダミン色素に結合させたデキストランを使用することに注意してください。色素からの蛍光を検出するための発光フィルタをバンドパス、および20分の480バンドパス放射フィルタは、動脈自己蛍光を検出するために使用した36分の607 </li><li>ビュー画面上の毛細血管床を見つけて、光学ズームを2光子イメージングソフトウェアを使用して、毛細血管の2獲得画像を使用して、このエリアを拡大。 </li><li>イメージングが完了した後、断頭続いて頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。 </li></ol> 6. エクスビボ二光子イメージング<ol><li>極細ハサミを使用して、マウスの正面骨に壁間の骨から頭皮に切開を行います。ポインタ指と親指で頭蓋骨の側面に皮膚を保護します。 </li><li>内側頭頂間骨の下極細ハサミを置き、矢状縫合に沿って頭蓋骨をカット。ブレグマをマーキングした後、約3mmの頭蓋骨を切断停止します。 注：脳を切断しないようにする頭蓋骨を切断する際に上向きの圧力を適用します。 </li><li> ＃5鉗子を使用して、脳から頭蓋骨を分離し、慎重に脳の表面から髄膜を除去します。残りの髄膜は、誤って脳を切ることができます。細心の注意は、これを避けるために注意すべきです。脳が頭蓋骨から外れるまで静かに前方にゆっくりと進行する脳の下の＃5鉗子をスライドさせます。 注意：下向きの圧力が脳を刺さないようにするために使用されるべきであること。 </li><li>マウスのための特定の脳切片ツールで脳を置きます。脳の上に人工脳脊髄液の液滴を適用することにより、脳を洗ってください。 </li><li>ブレグマにブレグマ0から脳の2ミリメートル冠状断面を取り外し-2。上を向い0ブレグマと人工脳脊髄液を含む凹状のスライドガラス上に冠状断面（断面の最も頭側の部分）を配置します。静かに脳SLをカバーガラスカバースリップと氷。 注：これは、血管アーキテクチャを変形させることのように一度脳部に配置されたガラスを押す避けてください。 </li><li>顕微鏡ステージにスライドを移し、カバースリップ上の0.9％生理食塩水を少量入れます。それは生理食塩水に接触するまで、顕微鏡の対物レンズを下げます。明視野対物レンズを用いて脳の正中線の位置を確認します。 </li><li>二光子イメージングを開始し、再び25倍対物レンズを用いて正中線を探します。冠状断面の皮質表面に縦亀裂を探して、これを達成します。正中線の撮影画面の右端を置き、横方向に3完全なフレーム（正中線から約1.5 mm）をビューア画面を上に移動。 これらの実験では、撮像パラメータは、ステップ5.2でノートに記載されたものと同一であったことに注意してください。 </li><li>毛細血管がビュー画面上でかろうじて見えるれる深さの位置を確認します。焦点さらに20の平面を下げますμmでは、zスタックの先頭を決定します。 </li><li> 1μmの画像の厚さを設定します。 100ミクロンのビュー画面を下げて、各画素の1％未満が過飽和となるように全体にレーザーパワーを調整します。 注意：zスタック画像は100の連続した​​500x500x1ミクロン一連の画像からコンパイルされます。より正確な後処理の計算がされるzスタック大きいです。一般的には、100μm以上のzスタックを収集しようとします。 </li><li>隣接するX-Yのアイコンが続くXYリピートアイコンを押します。 zスタックが完了すると、 シリーズ完了アイコンを押して、ファイルを保存します。 </li></ol> 7.データ処理<ol><li> ImageJソフトウェアにおける in vivo毛細血管画像を開きます。手動で二光子ソフトウェアから得られた値に基づいて距離比のピクセルを設定します。 <ol><li> [ツール]メニューから*ストレート*アイコンを選択します。親しい同僚に1毛細血管壁から伸びる線を引きサイトの毛細血管壁、とのImageJで提供さ長さを記録します。 それは明らかに毛細血管壁のエッジを可視化するために、画像にズームインする必要があるかもしれないことに注意してください。 </li><li>繰り返しキャピラリーに沿った異なる位置でのステップ7.1.1と同様に、画像内の複数のキャピラリ。 </li></ol></li><li>そのようなアミラなどの分析ソフトウェアにzスタックファイルを開きます。サブアプリケーションツールバーからフィラメントエディタのアイコンを選択 <ol><li>約20に、視聴者の厚さを設定zスタックの上部または下部のいずれかにビューアを移動します。 </li><li> トレースアイコンを選択し、ロードされた画像の上にカーソルを移動します。 図2Cに記載された場所での毛細血管上のノードを配置します。セグメントは自動的に隣接するノード間で表示されます。全体zスタック全体に毛細血管をトレースします。 注：これは毛細血管を追跡するために、エンドポイントと分岐点との間のノードを配置する必要があるTHRzスタックoughout。 </li><li>これらのノードを削除するには、 中間のアイコンを削除]をクリックします 。 注：これは、 選択1つのアイコンを使用してループを選択することにより、手動で削除する必要があり、誤ったループセグメントを作成し、[削除選択アイコンを選択することができます。ループがトレース中に同じ領域に表示し続ける場合は、ノードが別の毛細血管に配置した可能性があります。 </li><li>トレースが完了すると、自動的に抽出された血管のパラメータを含むスプレッドシートを開くために、グラフ情報]アイコンを選択します。ノードとセグメントの数は、メインビュー画面で利用可能です。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここに記載された方法は、実験モデル/設定の広範囲の脳微小血管構造を分析するために適用することができます。この方法の成功のために、3つの重要なステップを習得する必要があります。まず、薄頭蓋骨窓は、頭蓋骨または基礎脳に損傷を与えてはなりません。それは間伐時に頭蓋骨に穴を開け、または熱誘導性の血管漏出を引き起こすことは容易です。蛍光色素は、焦点面に漏出し、?...

ヒト免疫不全ウイルス1（HIV-1）ウイルス感染の急性期の間に脳に侵入し、かつ生産両方ミクログリア及び脳の常在マクロファージ、それらの活性化につながる感染 - 及び両方宿主由来の炎症性メディエーターおよび可溶性HIV-1の放出をそのような（1,2に見直さ）Tatおよびgp120のようvirotoxins。その結果、慢性神経炎症状態は、HIV-1関連神経認知障害（手）3-5の病因に寄与していると考えられるCNS、に設立されてしまいます。 HIV-1のTatまたはマウスのCNS ​​内のインターロイキン（IL）-17Aの慢性的過剰発現は、微小血管希薄6,7をもたらすことが示されています。これには、慢性神経炎症が脳血管系への影響を介して手の病因に貢献するかもしれないという可能性を提起します。さらに、この問題を調べるために、我々は、脳血管STRUCを定量化する方法を開発しましたトゥーレス。 この論文では、セグメント長、総セグメントの長さを意味する毛細管の直径、及び薄い頭骨皮質窓を通して毛細管ネットワークのインビボイメージングに用いて全毛細管容積平均、毛細管ノード、キャピラリーセグメントの数を定量化するための方法を記載して（前述の修飾されましたプロトコル）8,9、ならびに二光子顕微鏡を用いて脳切片の ex vivoイメージング。脳スライス内の毛細血管網の ex vivoイメージングは、三次元、完全な再構築を可能にしながら、in vivoでの薄頭蓋骨皮質ウィンドウは、脳環境の保全を可能にするので、この組み合わせアプローチは、脳血管のパラメータの全体的な定量を提供します毛細血管ネットワーク - 次に、市販のソフトウェアを用いて定量することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Leica Microscope</td>
			<td style="width:105px;">Leica Inc.</td>
			<td style="width:119px;">MZ8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">High Intensity Illuminator</td>
			<td style="width:105px;">Dolan-Jenner</td>
			<td style="width:119px;">180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:105px;">Stryker&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TP3E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">T/PUMP</td>
			<td style="width:105px;">Gaymar Industries, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">TP-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">TEC-4 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td style="width:105px;">Datex Ohmeda</td>
			<td style="width:119px;">447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Artificial Tear Gel</td>
			<td style="width:105px;">Butler AHS</td>
			<td style="width:119px;">7312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Povidone-Iodine solution&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Aplicare</td>
			<td style="width:119px;">52380-1855-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Dumot #5 Forceps</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">Ferric Chloride Solution</td>
			<td style="width:105px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:119px;">3120-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel</td>
			<td style="width:105px;">Henkel</td>
			<td style="width:119px;">45404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dental Cement</td>
			<td style="width:105px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">51459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Microtoruqe II Handpiece Kit</td>
			<td style="width:105px;">Pearson Dental</td>
			<td style="width:119px;">R14-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">005 Burr for Micro Drill</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Norland Blade (Dental Microblade)</td>
			<td style="width:105px;">Salvin Dental</td>
			<td style="width:119px;">6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Urethane</td>
			<td style="width:105px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U2500</td>
			<td>Group 2B Carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Braided Suture</td>
			<td style="width:105px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">735G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">&#160;Arterial Catheter</td>
			<td style="width:105px;">SAI Infusion Technologies</td>
			<td style="width:119px;">MAC-01</td>
			<td>The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">Blood Pressure Moniter</td>
			<td style="width:105px;">World Precision Intruments</td>
			<td style="width:119px;">SYS-BP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">Blood Pressure Transducer and Cable</td>
			<td style="width:105px;">World Precision Intruments</td>
			<td style="width:119px;">BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">RAPIDLab Blood Gas Analyzer&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Siemens&#160;</td>
			<td style="width:119px;">248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">40 &#956;l Capillary Tube</td>
			<td style="width:105px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">15401-413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline)</td>
			<td style="width:105px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Adult Mouse Brain Slicer Matrix</td>
			<td style="width:105px;">Zivic Instruments</td>
			<td style="width:119px;">BSMAS001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope</td>
			<td style="width:105px;">Olypmus</td>
			<td style="width:119px;">FV-1000 MPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser</td>
			<td style="width:105px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">ImageJ Software</td>
			<td style="width:105px;">National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Amira Software</td>
			<td style="width:105px;">Visage Imaging&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cerebral vascular architecture using two-photon microscopy in a mouse model of hiv-induced neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

薄頭蓋骨皮質ウィンドウは、皮質毛細血管の in vivo二光子イメージング（ 図1）を可能にします。画像に適した領域は、多数の、明確な毛細血管（ 図1A）を示しています 。同じ視野において、いかなる動脈細胞壁の自己蛍光が存在しない、第二高調波11（ 図1B）によって誘導されるコラーゲンの蛍光などの他の蛍光?...

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Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

quantification-cerebral-vascular-architecture-using-two-photon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K ビュー.  University of Rochester Medical Center. This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

ビデオ: Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoで</em神経炎症のモデルのマウスミクログリアの>イメージング

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

神経科学

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

二光子<em&gt; in vivoで</em&gt;間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the regulation of cerebral blood flow (CBF) is incompletely understood, especially at the capillary level. Two-photon microscopy is a powerful tool widely used to study CBF and its regulation. Currently, this field is limited by the lack of in vivo two-photon microscopy studies examining (1) CBF responses in three-dimensions, (2) conducted vascular responses, and (3) localized interventions within the vascular network. Here, we describe a 3D in vivo method using two-photon microscopy to study conducted vascular responses elicited by&#160;local ejection of ATP with a glass micro-pipette. Our method uses fast and repetitive hyperstack two-photon imaging providing precise diameter measurements by maximal intensity projection of the obtained images. Furthermore, we show that this method can also be used to study 3D astrocytic calcium responses. We also discuss the advantages and limitations of glass micro-pipette insertion and two-photon hyperstack imaging.

We present an optimized local ejection procedure using a glass micro-pipette and a fast two-photon hyperstack imaging method, which allows precise measurement of capillary diameter changes and investigation of its regulation in three dimensions.

ガラスマイクロピペットを用いて局所ATP吐出による血管応答を研究する生体内3次元2光子顕微鏡検査

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

生体内での2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて頭固定振る舞いマウスにおけるタンパク質キナーゼの活動を可視化する

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

要約

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慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoでイメージング

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

二光子

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウムイメージング

くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

ガラスマイクロピペットを用いて局所ATP吐出による血管応答を研究する生体内3次元2光子顕微鏡検査

生体内での2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて頭固定振る舞いマウスにおけるタンパク質キナーゼの活動を可視化する

HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

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慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoでイメージング

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

二光子

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

ガラスマイクロピペットを用いて局所ATP吐出による血管応答を研究する生体内3次元2光子顕微鏡検査

生体内での2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて頭固定振る舞いマウスにおけるタンパク質キナーゼの活動を可視化する

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウムイメージング