私たちは、シンクロトロンデータ収集時のサポートのためのスイスの光源、ポールシェラー研究所、Villigen、スイスでのビームラインX06DAのスタッフに感謝します。私たちは、優れた技術サポートのためのモニカGompertに感謝しています。プロジェクトはケルン大学でサポートされているとドイツの研究評議会からINST 216/682から1 FUGGを付与しました。 CPの開発健康と疾病の国際大学院から博士課程の交わりが認められています。これらの結果につながる研究は、助成金の契約番号283570（BioStruct-X）の下で欧州共同体のセブンス枠組み計画（FP7 / 2007年から2013年）から資金提供を受けています。

<ol>
	<li>Bouza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+Clostridium+difficile+infection:+understanding+the+healthcare+burden.">Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden.</a> Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).</li><li>O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+infection+caused+by+the+epidemic+BI/NAP1/027+strain.">Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).</li><li>Mitchell, B. G., Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+and+Clostridium+difficile+infection:+a+review.">Mortality and Clostridium difficile infection: a review.</a> Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).</li><li>George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+agent-induced+diarrhea--a+bacterial+disease.">Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease.</a> J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).</li><li>George, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Clostridium+difficile+as+a+cause+of+pseudomembranous+colitis.">Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis.</a> Br Med J. 1 (6114), 695 (1978).</li><li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Narrative+review:+the+new+epidemic+of+Clostridium+difficile-associated+enteric+disease.">Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease.</a> Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).</li><li>Kelly, C. P., LaMont, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile--more+difficult+than+ever.">Clostridium difficile--more difficult than ever.</a> N Engl J Med. 359 (18), 1932-1940 (2008).</li><li>&#220;nal, C. M., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+therapeutic+strategies+for+Clostridium+difficile+infections.">Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).</li><li>Kelly, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Monoclonal+Antibody,+Bezlotoxumab+Targeting+C.+difficile+Toxin+B+Shows+Efficacy+in+Preventing+Recurrent+C.+difficile+Infection+(CDI)+in+Patients+at+High+Risk+of+Recurrence+or+of+CDI-Related+Adverse+Outcomes.">The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes.</a> Gastroenterology. 150 (4), S122 (2016).</li><li>Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+discovery+of+treatments+for+C.+difficile+infection:+A+clinical+and+medicinal+chemistry+review.">Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review.</a> Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).</li><li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+secreted+Pro-Pro+endopeptidase+PPEP-1+(ZMP1/CD2830)+modulates+adhesion+through+cleavage+of+the+collagen+binding+protein+CD2831.">Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831.</a> FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).</li><li>Cafardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+zinc+metalloprotease+through+a+global+analysis+of+Clostridium+difficile+extracellular+proteins.">Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins.</a> PLoS One. 8 (11), e81306 (2013).</li><li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+secreted+metalloprotease+(CD2830)+from+Clostridium+difficile+cleaves+specific+proline+sequences+in+LPXTG+cell+surface+proteins.">A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).</li><li>Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+of+Proline-Proline+Peptide+Bond+Specificity+of+the+Metalloprotease+Zmp1+Implicated+in+Motility+of+Clostridium+difficile.">Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile.</a> Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).</li><li>Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEROPS:+the+database+of+proteolytic+enzymes,+their+substrates+and+inhibitors.">MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeds+to+crystals.">Seeds to crystals.</a> J Struct Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li><li>Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jolly+SAD.">Jolly SAD.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 3), 494-506 (2002).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphics System. , (2002).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Wang, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+phase+ambiguity+in+macromolecular+crystallography.">Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography.</a> Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li><li>Zwart, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+structure+solution+with+the+PHENIX+suite.">Automated structure solution with the PHENIX suite.</a> Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).</li><li>Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallography+over+the+past+decade+for+novel+drug+discovery+-+where+are+we+heading+next?.">X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next?.</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).</li><li>Rubino, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+zinc-bound+Zmp1,+a+zinc-dependent+metalloprotease+secreted+by+Clostridium+difficile.">Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile.</a> J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).</li><li>Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=His-tag+impact+on+structure.">His-tag impact on structure.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63 (Pt 3), 295-301 (2007).</li><li>Gasteiger, E., Walker, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Identification+and+Analysis+Tools+on+the+ExPASy+Server.">Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+screening+for+the+detection+of+soluble+fusion+constructs+expressed+in+E.+coli+using+a+modular+set+of+vectors.">Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors.</a> Microb Cell Fact. 4, 34 (2005).</li><li>Stura, E. A., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+streak+seeding+technique+in+protein+crystallization.">Applications of the streak seeding technique in protein crystallization.</a> J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

X線結晶学は、依然としてタンパク質28の3次元近接原子分解能構造を決定するための最速かつ最も正確な方法です。しかし、十分に秩序単結晶の成長を必要とします。これらは、多くの場合、取得するのが困難であり、結晶状態は、人工的です。しかしながら、他の方法によって決定されたもので、X線結晶学によって決定されるタンパク質構造の比較は、特にNMR、一般的に非常に良い一致を示しています。 PPEP-1の場合には、最近29公開されたNMR構造は、S-ループの移動度を含む当社の結晶構造14との優れた一致を示しています。 このプロトコルは、構造研究およびタグなしrPPEP-1の結晶化および構造決意のためのN末端HisタグrPPEP-1タンパク質の産生および精製を記載します。単結晶は、この場合、成長させることが困難であり、特殊microseeding手順を必要としました。トンで彼は我々がPPEP-1の結果を議論し、プロトコルが任意の他のタンパク質の生産および結晶化のために適合させることができる方法を示しますセクション以下。 構造物の設計と表現のバリエーション 結晶化のために、原因で結晶化の成功とタンパク質構造30上の影響を与える可能性にダイジェストトロンビンによるHisタグを除去することが好ましいとしてrPPEP-1は、N末端Hisタグ付きバリアント（ 図1A）のように表されます。他のタンパク質のためには、さらに、C末端Hisタグ付きバージョン（ 例えば 、同一の制限部位、ベクターたpET22bおよび3 &#39;末端に停止コドンなしの逆方向プライマーを用いてクローニングされた）を試験するために、またはN末端を残すことが望ましいことがありますタグは、結晶化の際に役立つかもしれないいくつかの例のように、未切断Hisタグ。 C末端HisタグコンストラクトのrPPEP-1の収率および安定性のために劣っていました。最良のためさらに、初期テストolubleタンパク質の発現は、以下の大腸菌株に含まれるべきである：BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysSをまたはLemo21（DE3）、BL21（DE3）コドンプラスRIPLまたはロゼッタ2（DE3）、BL21（DE3）スターと3つの異なる温度/インキュベーション時間でのC41（DE3）（37℃、5〜30℃、時間、一晩20℃で3〜4時間）。クローニングする前に、目的のタンパク質の切断を防止するために、ExPASy PeptideCutterツール31を使用して、内部トロンビン切断部位の存在を確認。また、HRV3Cの切断部位（ すなわち、EMBLのPETM-14 32）またはTEVプロテアーゼ（ すなわち EMBLのPETM-11）を提供する利用可能なベクトルがあります。 タンパク質精製 rPPEP-1構築物のための細胞溶解は、氷/水に超音波処理を介して行われます。凝集または細胞破壊を使用かもしれない関係より「穏やかな」細胞溶解方法を沈殿させる傾向がある、より敏感なタンパク質のD。このような化学的細胞溶解として溶解法を使用したときに検出されていない最初の遠心分離工程の後に、不溶性タンパク質の大量をチェックします。 rPPEP-1の精製のための通常のNiNTA樹脂2mlを使用しました。選択された樹脂の容量を結合タンパク質がどのように大規模に製造業者の取扱説明書を読み、それに応じて調整します。 rPPEP-1、樹脂の唯一の1ミリリットルを使用した最初の精製では、タンパク質の多くは、カラムに結合しなかったし、フロースルー（ 図1D）に見出されました。精製タンパク質の純度を低下させる可能性がありすぎ、樹脂を用いて一方。 NiNTAマトリックスに使用されるHisタグ構築物の結合親和性にイミダゾール濃度を調整します。 A280が監視され、各ステップの間にベースラインに達するまで放置した段階的な洗浄手順は、（ すなわち、10ミリメートル、30ミリメートル、50ミリメートル、70 mMイミダゾール）ここで好ましいです。そのようにしないタンパク質は、それが中に溶出うとしても、失われることはありません（50または70 mMの時など ）、高イミダゾール洗浄ステップ。 NHIS-rPPEP-1の場合、いくつかのタンパク質は、すでに30 mMイミダゾールで溶出するが、それが表すタンパク質種の種類は不明です。イミダゾールを透析またはタンパク質溶液から希釈されたときにいくつかのタンパク質は、/凝集体を沈殿させます。このような場合に比べイミダゾールなしバッファの5~10倍の体積を含むビーカー中に溶出することにより、イミダゾールの濃度を低下させる、例えば 150 mmの溶出緩衝液中のイミダゾールの濃度と高いイミダゾール濃度への暴露の時間を減少させます計画された溶出体積。一晩4℃でタンパク質1mg当たり2単位のトロンビンとNHIS-rPPEP-1のインキュベーションのために、ほぼ100％にHisタグを切断するのに十分です。 20℃まで4℃で、mgタンパク質あたり1-10単位を使用することにより、目的のタンパク質のためのトロンビンの量を調整します。 5〜10分間の間隔で遠心限外ろ過ユニットのポーズを用いてタンパク質を濃縮したpを混ぜるときコンセントレータに構築濃度勾配を均質化するrotein。それ以外の場合は高度に濃縮されたタンパク質は、/沈殿物を集約することができます。 結晶 rPPEP-1は、常にX線回折分析に適していない高度に相互成長結晶（単結晶は、このように複数の結晶格子を有し、互いの上に成長する）を生成します。説明はあまりにも多くの核生成事象が相図（ 図7）の核形成ゾーンで起こっていることかもしれません。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/55022/55022fig7.jpg" /> 図7：タンパク質結晶化実験の相図。タンパク質が過飽和されたときに結晶がのみ、形成することができます。核形成は、準安定ゾーン内の核ゾーンと結晶成長で行われます。タンパク質が不飽和のある場合は、ドロップが明確なままになります。 &lt;Pクラスは、= &quot;jove_content&quot;&gt;その後rPPEP-1のない核形成がもはや観察されないと滴が明確に滞在されているようなタンパク質や沈殿剤濃度の低下は、状況は改善されません。小さな核はrPPEP-1結晶が、最終的に成長する準安定域、（ 図7）に直接もたらされるようMicroseedingは、選択した方法でした。元の状態が（2.4 Mリン酸アンモニウム、二塩基、0.1 MトリスpHは8.5）が位置C5（ 図4）（pH及び沈殿剤濃度のかなりハイエンド）に位置している方法で、新しいのほとんどを最適化画面を設計することにより条件は、準安定域16（ 図7）の一部を表現するために高い傾向と低い過飽和と条件に対応しています。このように、播種時に持ち込まれている核は、潜在的に大きな単結晶に成長することができます。その手順（新たに形成された結晶の量と大きさ）を最適化するには、元のシードストックは10を希釈することができます<suP&gt; -2 10 -5〜。ここで、シードストックのいくつかの希釈物は、大きな単結晶を製造するための最良の種の希釈を決定するために試験することができます。あるいは、動物ウィスカーや尾の毛（ウサギ、ネコ、チンチラや馬）を使用して、ストリーク播種は33を使用することができます。 手順は、生成物ペプチドとrPPEP-1の基質ペプチドを共結晶化するために使用することができます。 1.25オングストロームまでの回折空間群P2 1で結晶を種子株から得た：1に希釈した最適化手順で250。最適化手順のリン酸アンモニウムの画面内に非常に類似した条件に由来しながら結晶が二空間群P2 1 2 1 2 1（非結合タンパク質）およびP2 1（複雑な構造）で成長します。結晶パッキングに主に単独の活性部位の下塗りしていない側に対処するすべての小分子およびペプチドはsoake可能性があり、両方のR-PPEP-1結晶形で発見結晶にD。分子のこの側面は、結晶中に存在する溶媒からアクセスできます。サブサイトまたはプライマー処理した側の両方に対処する分子のみS-ループ開口として、rPPEP-1と共結晶化される必要があるが、活性部位にそれらを収容するために必要とされるであろう。またで3残基に基質ペプチドの長さを制限事実 - さらに、rPPEP-1はS3&#39;site（この領域の結晶連絡先の促進）に近い基質結合部位からの出口に隣接する分子と接触しますこれらの2つの結晶形で下塗りした側。 クリスタルマウントとクライオ保護 タンパク質結晶の取り付けは実体顕微鏡下での操作中にいくつかのスキルを必要とするため、いくつかの練習を必要とする方法です。 backgrounに寄与する結晶の周りの溶媒の過剰を防ぐために、ナイロンループ（または任意の他のループ、 例えば litholoop）の最適な長さを選択してくださいD散乱および回折データの対雑音比、したがって低い信号。最適なループサイズ/長さはまた、結晶がループを通って滑らないように結晶の釣りが容易になります。最も長い寸法で約100から200ミクロンであるrPPEP-1の結晶については、0.1〜0.2ミリメートルサイズのナイロンループを選択しました。凍結保護はまた、凍結状態に転送する際に結晶が浸透圧ショックが発生する可能性がありますように、データ品質の悪化に寄与することができます。これは妨げる、あるいは結晶の内部秩序を破壊することがあります。慎重に凍結保護の種類と濃度を選択します。 rPPEP-1の結晶を20％グリセロールまたは30％スクロースのいずれかで凍結保護しました。基質ペプチド複合体または他のリガンドとrPPEP-1の複合体を結晶化する場合、グリセロールがrPPEP-1 14の基質結合部位の下塗りされた部位に結合するように、ショ糖は、凍結保護剤として選択されるべきです。 構造決意 AutoSol溶液は49.2±18.4のベイズCC、0.41のFOM（性能指数）、0.17のスキューと0.85の相関RMSを得ました。モデルマップの相関は0.86であり、R / R 自由の要因は0.21 / 0.24です。すべてのこれらのパラメータは、成功した構造ソリューションを示します。

クロストリジウム・ディフィシルは、院内抗生物質関連下痢症の感染1の主要な原因の1つです。このグラム陽性嫌気性細菌は、糞口経路を介して、その胞子の形を介して送信されます。過去十年間で、新しい&#39;&#39;流行&#39;&#39;または&#39;&#39;の超&#39;&#39;株（ 例えば BI / NAP1 / 027）北米、欧州2の新規感染と死亡率の大幅な増加を引き起こしました。 C.ディフィシル -関連疾患（CDAD）は、高い致死率3との生活を脅かす大腸の炎症です。症状は、下痢4から偽膜性大腸炎5、しばしば致命的な中毒性巨大結腸6の範囲です。 毒性株が多剤耐性であり、再発率が7高いほどCDADの治療は困難です。抗生物質メトロニダゾール、fidaxomicinまたはバンコマイシンが含まれる、またはrepetitiのモーメント療法でvely再発例の糞便細菌叢移植。新しい治療戦略が緊急に8を必要とされています。いくつかの進展がC.ディフィシル毒素B 9をターゲットに 、治療用モノクローナル抗体Bezlotoxumabとして記録され、最近成功した第III相臨床試験を通過し、FDAやEMAと承認のために提出されました。さらに、新たな抗生物質は臨床試験10の異なる段階で、現時点ではテストされています。 効果的な治療法を開発するために新たな治療標的を識別しなければなりません。ノックアウト株におけるPPEP-1の欠如がCの病原性を減少させるように、そのような有望な標的である最近C.ディフィシルプロテアーゼプロリン-プロリンエンドペプチダーゼ-1（;; CD2830 / Zmp1 EC 3.4.24.89 PPEP-1）が発見されました生体内 11インチ ディフィシル 。 PPEP-1は、それらのC末端で2 C.ディフィシルアドヘシンを切断分泌型メタロプロテアーゼ12,13で13こうして付着bacterを解放人間の腸上皮からIA。したがって、 クロストリジウム・ディフィシルの固着性と運動性の表現型の間のバランスを維持することに関与しています。 PPEP-1に対する選択的阻害剤を開発するために、それはその3次元構造の詳細な知識が不可欠であるその基質を認識する方法を理解します。私たちは、基質ペプチド14でPPEP-1単独および複合体中の第1の結晶構造を解決しました。 PPEP-1は、2プロリン残基15との間に選択的に切断ペプチド結合最初の既知のプロテアーゼです。それは二重ねじれた方法で基板を結合し、プロテアーゼ活性部位14をカバーする S-ループに位置する残基の延長脂肪族-芳香族、ネットワークを介して、それを安定化させます。この基質結合モードはPPEP-1に固有のものであり、現在までに人間のプロテアーゼには見られません。これは有望な薬物標的になり、および阻害剤のオフターゲット効果は非常に低いです。 選択PPEP-1 INHを開発し、画面に将来的にibitors純粋な単分散PPEP-1タンパク質を多量に必要とされます。また、第一の阻害剤の結合様式を決定するために、PPEP-1との共結晶構造が決定されなければなりません。私たちの手でPPEP-1は常に相互成長結晶を生成します。したがって、私たちはPPEP-1の単一回折品質の結晶を生成するために最適化手順を開発しました。このプロトコルでは、我々は詳細にPPEP-1 14の生産、精製、結晶化および構造ソリューションについて説明します。我々は、亜鉛単一波長異常分散を介して最適化画面と構造決意に16 microseeding続く精製タグの除去と分泌シグナル配列、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを欠くPPEP-1変異体の大腸菌における細胞内発現を使用します（亜鉛-SAD）17。このプロトコルは、他のタンパク質（ 例えば 、の産生および構造決意に適合させることができます&lt;/ em&gt;のメタロプロテアーゼ）と相互成長結晶の製造タンパク質について、特にインチリクエストに応じて、構築物（をpET28a-NHIS-rPPEP-1）のプラスミドDNAおよび回折データは、教育目的のために提供することができます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Genes / Vectors / cell strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a vector</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>Thrombin cleavable N-terminal His-tag</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; strain BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td>RNase H deficient</td></tr><tr><td>Codon-optimized gene (for &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;) of PPEP-1 (CD630_28300)</td><td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td><td>custom</td><td>amino acids 27-220</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antifoam B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>aqueous-silicone emulsion</td></tr><tr><td>Agar</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>Buffer grade</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>any</td><td></td><td>Buffer grade</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>Buffer grade</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 100%</td><td>any</td><td></td><td>purest grade</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td>any</td><td></td><td>for storage and cryocooling of crystals</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment (general)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>any</td><td></td><td>providing temperatures of 20 &amp;deg;C - 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Glassware</td><td>any</td><td></td><td>baffled Erlenmeyer flasks (50 ml - 2.8 L)</td></tr><tr><td>Centrifuge for large culture volumes</td><td>any</td><td></td><td>centrifuge for processing volumes up to 12 L</td></tr><tr><td>Sonicator Vibra-Cell VCX500</td><td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>or any other sonicator / cell disruptor</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>any</td><td></td><td>centrifuge providing speeds up to 150,000 x g</td></tr><tr><td>NiNTA Superflow resin</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Empty Glass Econo-Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7371007</td><td>or any other empty glass or plastic column</td></tr><tr><td>Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>Chromatography system &amp;Auml;kta Purifier</td><td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td>or any other chromatography system</td></tr><tr><td>Dialysis tubing Spectra/Por 3</td><td>Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing closures</td><td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafiltration units (concentrators) 10,000 NWCO</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spectrophotometer</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment (crystallography)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low volume pipette 0.1-10 &amp;micro;l</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Positive displacement pipette Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>Crystallization robot</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells</td><td>TTP</td><td>4150-05810</td><td>or any other 96-well crystallization plate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>24-well CombiClover Junior Plate</td><td>Jena Bioscience</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Clear Sealing Tape</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>Siliconized Glass Cover Slides</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++</td><td>Jena Bioscience</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>JBS Beads-for-Seeds</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT (nylon loops)</td><td>Hampton Research</td><td>diverse</td><td>loop sizes 0.025 mm - 0.5 mm</td></tr><tr><td>CrystalCap Vial</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Foam Dewar 800 ml</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Foam Dewar 2 L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>Vial Clamp, Straight</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>CrystalWand Magnetic, Straight</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 Vial Holder</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane Color Coder - White</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Straight microforcep</td><td>any</td><td></td><td>for manipulation of sealing tape. &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Acupuncture needle</td><td>any</td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; from a pharmacy</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>any</td><td></td><td>for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X</td></tr></tbody></table>

production, crystallization and structure determination of c. difficile ppep-1 via microseeding and zinc-sad

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

rPPEP-1を大腸菌 BL21（DE3）スター（ 図1C）で最も高い収率で、いくつかの大腸菌株で過剰発現されます。最初のNiNTAアフィニティークロマトグラフィー工程後の6xHisタグが正常タンパク質の大部分から切断することができ、第二のNiNTAステップで未消化のタンパク質を完全にトロンビン消化されたタンパク質（ 図1D）から分離することができます。 S200 16/600カラムタグなしrPPEP-1に時折有するモノマーとして移動するには、おそらく二量体種（ 図2A）に対応する面し。タンパク質は、（ 図2B）純粋であり、収率は大腸菌培養物1 Lから約50mgのタンパク質です。 rPPEP-1は、多くの場合、リン酸を含む、様々な条件（ 図3）に結晶化します。結晶は、非常にすべての条件に相互成長しているので、結晶の最適化を実行しなければなりませんでした。 図4は SCHEMを示しています最適化手順のeが条件商業画面SaltRx E4（52）（ 図3B-C）由来の結晶を行いました。再び相互成長結晶は、ウェルA6-D6（ 図4）に登場しました。 microseedストックは最適化画面の条件C6に成長した結晶（2.55 Mリン酸アンモニウム、二塩基、0.1 MトリスpHは8.5）から調製し、1希釈した：母液中1,000。明確で、他の残りの20の条件に希釈シードストックを播種後2〜7日高い回折品質の大規模な単一格子結晶が最も滴中（ 図5）が観察された降下。 1.67オングストロームの解像度にナイロンループ（ 図5E）回折データに結晶をマウントした後、異常信号が2オングストロームに延びる、亜鉛SAD（ 表1）を介して構造決意のために収集しました。さらに、1.4オングストロームの解像度にネイティブ回折データは、HIGの決意のために収集しました時間分解能構造（ 表1）。 rPPEP-1の結晶構造を解決することができた（ 図6）と1.4Å分解能（PDB ID：5A0P）での0.156 / 0.182のR / R 自由の要因に洗練された天然構造のモデルをさらに精緻化統計のための14（ 表を参照してください1）。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 構造/データセット </td><td> ピークのZn-SAD </td><td> ネイティブ </td></tr><tr><td>データ収集</td><td></td><td></td></tr><tr><td>空間群</td><td> P2 1 2 1 2 1 </td><td> P2 1 2 1 2 1 </td></tr><tr><td> A、B、C（A） </td><td> 43.17、71.68、117.70 </td><td> 43.17、71.77、117.80 </td></tr><tr><td> α、β、γ（°） </td><td> 90、90、90 </tD&gt; <td> 90、90、90 </td></tr><tr><td>波長（Å） </td><td> 1.28254 </td><td> 1 </td></tr><tr><td>解像度（Å） </td><td> 45.5から1.67（1.72から1.67） </td><td> 45.5から1.40（1.49から1.40） </td></tr><tr><td>観測の号</td><td> 779717（34025） </td><td> 310074（45851） </td></tr><tr><td>独特の反射の号</td><td> 80960（5597） </td><td> 71874（11172） </td></tr><tr><td>多重度</td><td> 9.6（6.1） </td><td> 4.3（4.1） </td></tr><tr><td>完全性（％） </td><td> 99.2（93.0） </td><td> 98.2（95.6） </td></tr><tr><td> Rmerge（％） </td><td> 6.8（56.5） </td><td> 5.2（52.6） </td></tr><tr><td> &lt;I /σ（I）&gt; </td><td> 21.86（2.81） </td><td> 15.66（2.48） </td></tr><tr><td> CC（1/2）（％） </td><td> 100（85.1） </td><td> 99.9（85.5） </td></tr><tr><td>洗練統計</td><td></td><td></td></tr><tr><td> RのワットORK / R を無料 D（％） </td><td></td><td> 15.60 / 18.17 </td></tr><tr><td>非Hタンパク質原子の番号</td><td></td><td> 3109 </td></tr><tr><td>水分子の番号</td><td></td><td> 532 </td></tr><tr><td>イオン/重原子の番号</td><td></td><td> 2のZn </td></tr><tr><td>他の分子の号</td><td></td><td> - </td></tr><tr><td> TLSグループの番号/チェーン</td><td></td><td> 9 </td></tr><tr><td>二乗平均平方根偏差</td><td></td><td></td></tr><tr><td>結合長さ（Å） </td><td></td><td> 0.006 </td></tr><tr><td>結合角（°） </td><td></td><td> 1.022 </td></tr><tr><td>平均B因子（Å2） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>全てのタンパク質原子</td><td></td><td> 16.12 </td></tr><tr><td>水</td><td></td><td> 29.74 </td></tr><tr><td>他の原子</td><td></td><td> 10.12 </td></tr><tr><td>ラマチャンドランプロットE（％） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>最も好ま</td><td></td><td> 98.72 </td></tr><tr><td>さらに、許可されました</td><td></td><td> 1.28 </td></tr><tr><td>許可されていません</td><td></td><td> 0 </td></tr><tr><td> PDBエントリー</td><td></td><td> 5a0p </td></tr></tbody></table> 表1：データ収集および精密化統計。

Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD at JoVE.com

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

の生産、結晶化と構造決意<em&gt; C。ディフィシル</em&gt; PPEP-1 Microseeding及び亜鉛SADを介しました

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

production-crystallization-structure-determination-c-difficile-ppep-1

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

11.5K ビュー.  University of Cologne. Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein. 

ビデオ: Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

構造研究のためのジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体の生産

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

化学

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

生化学

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the disordered and protease labile C-terminus of the protein. This manuscript describes the methods to purify recombinant Nsa1 from S. cerevisiae for structural analysis by both X-ray crystallography and SAXS. X-ray crystallography was utilized to solve the structure of the well-ordered N-terminal WD40 domain of Nsa1, and then SAXS was used to resolve the structure of the C-terminus of Nsa1 in solution. Solution scattering data was collected from full-length Nsa1 in solution. The theoretical scattering amplitudes were calculated from the high-resolution crystal structure of the WD40 domain, and then a combination of rigid body and ab initio modeling revealed the C-terminus of Nsa1. Through this hybrid approach the quaternary structure of the entire protein was reconstructed. The methods presented here should be generally applicable for the hybrid structural determination of other proteins composed of a mix of structured and unstructured domains.

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

This method describes the cloning, expression, and purification of recombinant Nsa1 for structural determination by X-ray crystallography and small-angle X-ray scattering (SAXS), and is applicable for the hybrid structural analysis of other proteins containing both ordered and disordered domains.

S. 酵母から Nsa1 の非構造化領域をモデル化する x 線小角散乱と x 線結晶解析を組み合わせること

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States alone, an average of 41,400 deaths and 1.86 million hospitalizations are caused by influenza virus infection each year 1. Point mutations in the polymerase basic protein 2 subunit (PB2) have been linked to the adaptation of the viral infection in humans 2. Findings from such studies have revealed the biological significance of PB2 as a virulence factor, thus highlighting its potential as an antiviral drug target.
The structural genomics program put forth by the National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) provides funding to Emerald Bio and three other Pacific Northwest institutions that together make up the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). The SSGCID is dedicated to providing the scientific community with three-dimensional protein structures of NIAID category A-C pathogens. Making such structural information available to the scientific community serves to accelerate structure-based drug design.
Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for new lead discovery by targeting a pathway or an entire protein family. Emerald Bio has developed a high-throughput, multi-target parallel processing pipeline (MTPP) for gene-to-structure determination to support the consortium. Here we describe the protocols used to determine the structure of the PB2 subunit from four different influenza A strains.

Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for lead discovery. The following article highlights how the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease utilizes a multi-target approach for gene-to-structure determination of the PB2 influenza A subunit.

インフルエンザポリメラーゼPB2サブユニットの遺伝子の構造決定のためのマルチターゲット並列処理アプローチ

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

免疫・感染学

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and IKK&#946;. Upon activation, the IKK complex phosphorylates the I&#954;B molecules leading to NF-&#954;B nuclear translocation and activation of target genes. Inhibition of the NEMO/IKK interaction is an attractive therapeutic paradigm for the modulation of NF-&#954;B pathway activity, making NEMO a target for inhibitors design and discovery. To facilitate the process of discovery and optimization of NEMO inhibitors, we engineered an improved construct of the IKK-binding domain of NEMO that would allow for structure determination of the protein in the apo form and while bound to small molecular weight inhibitors. Here, we present the strategy utilized for the design, expression and structural characterization of the IKK-binding domain of NEMO. The protein is expressed in E. coli cells, solubilized under denaturing conditions and purified through three chromatographic steps. We discuss the protocols for obtaining crystals for structure determination and describe data acquisition and analysis strategies. The protocols will find wide applicability to the structure determination of complexes of NEMO and small molecule inhibitors.

We describe protocols for the structure determination of the IKK-binding domain of NEMO by X-ray crystallography. The methods include protein expression, purification and characterization as well as strategies for successful crystal optimization and structure determination of the protein in its unbound form.

NEMOのIKK結合ドメインの生産・結晶化・構造決定

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion cofactors triggering a dimer-dodecamer transition. Upon metal ion binding, several structural modifications occur in the active site and at the interaction interface, shaping dimers to promote the self-assembly. To observe such modifications, stable oligomers must be isolated prior to structural study. Reported here is a method that allows the purification of stable dodecamers and dimers of TmPep1050, an M42 aminopeptidase of T. maritima, and their structure determination by X-ray crystallography. Dimers were prepared from dodecamers by removing metal ions with a chelating agent. Without their&#160;cofactor, dodecamers became less stable and were fully dissociated upon heating. The oligomeric structures were solved by the straightforward molecular replacement approach. To illustrate the methodology, the structure of a TmPep1050 variant, totally impaired in metal ion binding, is presented showing no further breakdown of dimers to monomers.

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

This protocol has been developed to study the dimer-dodecamer transition of TmPep1050, an M42 aminopeptidase, at the structural level. It is a straightforward pipeline starting from protein purification to X-ray data processing. Crystallogenesis, data set indexation, and molecular replacement have been emphasized through a case of study, TmPep1050H60A H307A variant.

X線結晶学は 、熱利子マリティマ M42アミノペプチダーゼTmPepT050のオリゴマー状態推移を研究する

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial crystallography experiments at both synchrotrons and XFELs. The method is based upon an understanding of the protein crystal phase diagram, and how that knowledge can be utilized. The method is divided into three stages: (1) optimizing crystal morphology, (2) transitioning to batch, and (3) scaling. Stage 1 involves finding well diffracting, single crystals, hopefully but not necessarily, presenting in a cube-like morphology. In Stage 2, the Stage 1 condition is optimized by crystal growth time. This strategy can transform crystals grown by vapor diffusion to batch. Once crystal growth can occur within approximately 24 h, a morphogram of the protein and precipitant mixture can be plotted and used as the basis for a scaling strategy (Stage 3). When crystals can be grown in batch, scaling can be attempted, and the crystal size and concentration optimized as the volume is increased. Endothiapepsin has been used as a demonstration protein for this protocol. Some of the decisions presented are specific to endothiapepsin. However, it is hoped that the way they have been applied will inspire a way of thinking about this procedure that others can adapt to their own projects.

The aim of this article is to give the viewer a solid understanding of how to transform their small-volume, vapor-diffusion protocol, for growing large, single protein crystals, into a large-volume batch micro-crystallization method for serial crystallography.

連続結晶構造解析実験のためのエンドチアペプシン結晶の成長の最適化

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We describe a versatile microfluidic chip that enables the production of crystals by the efficient method of counter-diffusion. The convection-free environment provided by the microfluidic channels is ideal for crystal growth and useful to diffuse a substrate into the active site of the crystalline enzyme. Here we applied this approach to the CCA-adding enzyme of the psychrophilic bacterium Planococcus halocryophilus in the presented example. After crystallization and substrate diffusion/soaking, the crystal structure of the enzyme:substrate complex was determined at room temperature by serial crystallography and the analysis of multiple crystals directly inside the chip. The whole procedure preserves the genuine diffraction properties of the samples because it requires no crystal handling.

A versatile microfluidic device is described that enables the crystallization of an enzyme using the counter-diffusion method, the introduction of a substrate in the crystals by soaking, and the 3D structure determination of the enzyme:substrate complex by a serial analysis of crystals inside the chip at room temperature.

酵素の結晶化と構造決定:多用途マイクロ流体チップにおける連続結晶学による基質複合体

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

生物学

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

の生産、結晶化と構造決意

要約

さらに動画を探す

この動画の章

構造研究のためのジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体の生産

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

S. 酵母から Nsa1 の非構造化領域をモデル化する x 線小角散乱と x 線結晶解析を組み合わせること

インフルエンザポリメラーゼPB2サブユニットの遺伝子の構造決定のためのマルチターゲット並列処理アプローチ

NEMOのIKK結合ドメインの生産・結晶化・構造決定

X線結晶学は、熱利子マリティマ M42アミノペプチダーゼTmPepT050のオリゴマー状態推移を研究する

連続結晶構造解析実験のためのエンドチアペプシン結晶の成長の最適化

酵素の結晶化と構造決定:多用途マイクロ流体チップにおける連続結晶学による基質複合体

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

の生産、結晶化と構造決意

要約

さらに動画を探す

この動画の章

構造研究のためのジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体の生産

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

S. 酵母から Nsa1 の非構造化領域をモデル化する x 線小角散乱と x 線結晶解析を組み合わせること

インフルエンザポリメラーゼPB2サブユニットの遺伝子の構造決定のためのマルチターゲット並列処理アプローチ

NEMOのIKK結合ドメインの生産・結晶化・構造決定

X線結晶学は 、熱利子マリティマ M42アミノペプチダーゼTmPepT050のオリゴマー状態推移を研究する

連続結晶構造解析実験のためのエンドチアペプシン結晶の成長の最適化

酵素の結晶化と構造決定:多用途マイクロ流体チップにおける連続結晶学による基質複合体

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

X線結晶学は、熱利子マリティマ M42アミノペプチダーゼTmPepT050のオリゴマー状態推移を研究する