このプロトコルは、不活性二量体と活性ドーデカマーのバランスが取れた異なるオリゴマー状態およびオリゴマー化依存性活性を有するアミノペプチダーゼの研究を促進する。この従来の技術は、任意のラボで簡単に行うことができます。ビームラインやX線結晶学の設備へのアクセスを必要とすることには別として、特別な装置を必要としない。
何らかの適応によって、この方法は、そのオリゴマー化の程度に依存する活性または機能を有する他のタンパク質に適用され得る。X線データを処理するには、結晶学の理解を最小限に抑える必要があります。トレーニングを受講し、XDS Wikiにアクセスし、Phenixチュートリアルを見るようにユーザーを招待します。
活性アッセイを行うために、100mM L-ロイシンp-ニトロアニリドの25マイクロリットルを50ミリモルMOPSの965マイクロリットル、250マイクロモルコバルト2塩化物および10%メタノールプレインキュベートし、酵素を1マイクロモラの最終濃度に浸漬してから、さらに1マイクロモラ濃度に酵素を希釈する次に、1マイクロモル酵素10マイクロリットルを反応ミックスに加え、得られた溶液をボルテックスしてから、反応を摂氏75度の乾燥浴に1時間以下で戻します。溶液が黄色になったら、室温まで冷却する前に、20%の酸性酸と渦の1ミリリットルで反応を停止します。
次に、反応ミックスのアリコートを分光光度計細胞に移し、酵素を含まないインキュベート反応ミックスに対して410ナノメートルの吸収剤を陰性対照として読み取る。アポ酵素調製のために、10マイクロリットル、10フェナントロリンストック溶液を50ミリモルMOPSの890マイクロリットル、0.5モル硫酸アンモニウム、精製TmPep1050の100マイクロリットルに加えます。塩化コバルト2を添加することなく実証した活性アッセイを用いて活性損失を確認する。
アッセイ後、サンプルを透析管に移し、サンプルを摂氏4度で50ミリモルMOPSと0.5モル硫酸アンモニウムの200ミリリットルに対して透析します。48時間の透析中に3回新鮮なバッファーと透析液を交換し、透析管からサンプルを収集します。30キロダルトンカットオフの超濾過ユニットを使用して、サンプルを100マイクロリットルに濃縮し、280ナノメートルのナノボリューム分光光度計の濃度を確認します。
ダイマーを調製するには、50ミリモルMOPSおよび0.5モル硫酸アンモニウムで1マイクロモル濃度にアポホンを希釈し、75°C乾燥浴中に2時間の反応をインキュベートする。次に酵素試料を50マイクロリットル濃度以上の場合に濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィーにより分子量を確認する。タンパク質結晶の形状、大きさ、結晶性を改善するために、結晶の滴に最適化された結晶化溶液の適切な量を追加し、結晶液量を10マイクロリットルにします。
液滴を1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し、さらに90マイクロリットルの結晶化溶液を播種によく加えます。各種子希釈に対して、結晶化プレートの適切な数のウェルにウェルあたり500マイクロリットルの結晶化試薬を加え、2マイクロリットルのタンパク質サンプルを2マイクロリットルの結晶化試薬と0.2マイクロリットルの種子を井戸当たり1つの結晶化支持体で混合します。次に、結晶化試薬の各ウェルに支持体を固定します。
水晶摘みのために、液体窒素で浴を満たし、窒素にサンプル処理に使用される任意のバイアルまたはバスケットを突っ込む。液体窒素の取り扱いは、重度の凍傷を引き起こす可能性がある危険です。極低温手袋や保護眼ゴーグルのような適切な個々の保護を着用してください。
結晶サイズに応じて異なるサイズのサンプルピッキングループを設定し、双眼鏡を使用して結晶を含むドロップを選択します。その後、ループを使用して1つのウェルから孤立した結晶を穏やかに選択し、ループを適切なバイアルに入れる前に液体窒素ですぐにループを突き落とします。回折スポットの強度を測定するには、XDS を実行するフォルダーを作成し、画像へのパスを見つけます。
xdsme を実行するには、ターミナル ウィンドウにコマンドを入力します。XDS が終了した後、正しい lp ファイルをチェックし、スペース グループの決定、データの完全性、最高解像度、結晶のモザイク性とデータ品質の確率を確認します。XDS の無意味なログをチェックしてスペース グループの可能性を取得した後、前のプロセスを上書きしないように、XDS が提案する別のスペース グループ ソリューションを使用して xdsme を再実行します。
データ統計に基づいて最適なソリューションを選択した後、XSCALE および XDSCONV を実行するコマンドを入力します。異常散乱項目を含まない位相を決定するには、4P X、Y座標を使用し、分子置換の開始モデルを用意する。PDB ファイルから、Phenix PDB ファイル エディタを使用して A モノマーを抽出し、アラニン内のアミノ酸を切り捨てます。
XDSCONV によって生成されたリフレクション ファイルと入力としてシーケンスを使用して X トリアージを実行します。Xtriage からログ ファイルを確認します。完全性、非対称単位のサブユニット数、異方性、氷のリングの存在、およびツイニング発生に注意してください。
分子置換のためにフェニックスでPhaser-MRを実行するには、ポリアラニンで切り捨てられた反射ファイル、シーケンスおよび開始4P 6 Yモデルを選択し、[実行]をクリックします。完成したら、モデルが見つかったかどうかを確認し、分子置換のスコアを確認します。変換係数 Z スコアが 8 以上の場合、解が決定的に正しいことを示します。
分子置換によってフェーズを決定した後、[自動構築を実行]を選択して[実行]をクリックします。必要なファイルはすべて自動的に追加されます。完了したら、COOT でモデルを確認し、COOT の電子密度マップに従ってモデルを手動で構築および調整します。
このモデルを使用して、シーケンスと回折データを入力として、正しい戦略を選択するためにPhenixを参照して、Phenixで手動でキュレーションされたモデルを洗練します。結果を絞り込んだ後、絞り込み無料および絞り込み作業を減らす必要があります。MolProbity指標は尊重され、実際の空間相関が低い外れ値は制限されなければならない。
最適な洗練されたモデルが生成されたら、サーバー上でMolProbityを実行し、プログラムによって識別された外れ値を確認します。サイズ排除クロマトグラフィーは、精製タンパク質の見かけの分子量を決定するために使用することができる。ペプチドの結晶化条件は、ダイマーの条件の周りのPEG濃度に対してpHを変化させることによって最適化することができる。
例えば、最高のTmPep1050 H60A H307A結晶を、5.2および20%PEG3350濃度のpHを有する0.1モルクエン酸ナトリウムで得た、マイクロシーディングの1サイクル後にマイクロ結晶性を改善した。この分析では、データインデックス化は、TmPep1050 H60A H307A結晶の空間群がC2221であることを示したが、XDSは別の溶液、MP空間群を提案した。TmPep1050 H60A H307Aの構造は、自動化され、手動の洗練のいくつかのサイクルの後に完了することができます。
モノマー間の界面1,710平方オングストロームと、1モル当たりマイナス16.2キロカロリーの界面形成の自由エネルギーを有するオリゴマー状態を確認する。ここで、TmPep1050 H60A H307A活性部位のクローズアップは、TmPep1050ダイマーおよびドデカマーの活性部位と比較して観察することができる。モデルを構築する場合は、電子密度に見えるものだけを構築して、過度の解釈やデータを避け、時間をかけてモデルを磨くように注意してください。
ダイマーおよびドーデカメの分子量は、天然の質量分析法によっても決定することができる。そして、この方法は、遷移オリゴマーを検出するのに有用であり得る。
