The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Ab&#250;ndez, Jes&#250;s Padilla-Calder&#243;n, Jaime M. Uribe-Wiechers, N&#233;stor O. P&#233;rez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.

ソリューションの調製<ol><li> BGE溶液を調製します。 <ol><li> 0.05％からなる溶液100mlを調製（M / V）のヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、200mMのεアミノ、N-アミノカプロン酸（EACA）および30ミリモルの酢酸リチウム。 注：HPMCは、粘弾性ポリマーであるため、ガラスビーカーに粉末を注ぎ、水80 mLを加え、最後に攪拌棒を加えます。通常のように残りの試薬の追加を続けます。それは、目に刺激を与える可能性として酢酸リチウムを取り扱うときは、保護眼鏡を着用してください。 </li><li> 50％（v / v）の酢酸でpHを4.8±0.1に調整します。溶液を5分間安定化し、必要に応じて調整することができます。 </li><li>メスフラスコで最終容量100mlまで作るために水を追加します。 </li><li> 0.2μmの孔サイズを有する親水性膜で濾過します。 </li><li> 7日間まで2〜8℃で保存します。 </li></ol></li><li> 内部標準を準備します。 <ol><li> 1ミリリットルを準備1％（M / V）ヒスタミン成る溶液。 </li><li> 0.2μmの孔サイズを有する親水性膜で濾過します。 </li><li>最大で1日2〜8℃で保存します。 </li></ol></li></ol> 2.試料の調製<ol><li> 1mg / mlの最終濃度にTris緩衝液（50mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、pH8.0）で希釈したmAb試料180μLを準備します。 </li><li> 1％（メートル/ v）のヒスタミンの20μLを加えます。 </li><li>混合し、5秒間千×gで遠心します。 </li><li>ユニバーサルバイアル内部のマイクロバイアルを置きます。 </li><li>マイクロバイアルに試料を移し、ユニバーサルバイアルをキャップ。任意の気泡を導入しないようにするために上向きにサンプルを分注します。 </li><li>最大で1日2〜8℃で保存します。 </li><li>サンプル入口トレイに（試料溶液を含むマイクロバイアルで）ユニバーサルバイアルを置きます。 </li></ol> CEシステムの調製。 <ol><li> CEシステムクリーニング。 注：行動番目ほこりやごみの蓄積から派生した電流リークを避けるために少なくとも週に一度の手順です。しかし、アプリケーションに応じて（ 例えば 、増加した粘度を持つまたは高塩濃度、粘度が増加した試料でBGEの使用）電極と開放レバーが交差汚染やサンプルのキャリーオーバーを防止するために、より頻繁に清掃する必要があります。 <ol><li> CE機器の電源スイッチをオフにし、フロントドアを開きます。 </li><li>水で湿らせた不織布で拭いて、試料保持システム（サンプルとバッファートレイ）、カートリッジカバー、クランプバー、インターフェースブロックおよび電極をサンプルカバーの表面を清掃してください。使用前にエタノールで湿らせたワイプとドライを使用して手順を繰り返します。 </li><li>水で十分に開くレバーをすすぎます。ワイプ不織布とその表面を清掃してください。インストールの前にエタノールで湿らせたワイプとドライを使用して手順を繰り返します。 </li><li>光ファイバケーブルの両端には注意清掃します水で湿らせマイクロファイバーの布でLY。エタノールで湿らせた布で手順を繰り返します。 </li></ol></li><li> カートリッジアセンブリ。 <ol><li>そのパッケージから新しいニュートラルキャピラリー（50μmの内径）を削除します。 </li><li>ワークベンチへの毛細血管の保護チューブの一端ダウンテープ。 、解かまっすぐとチューブ外キャピラリを引き出します。 </li><li>作業台にテープまたは一枚の紙を貼ると、次のように測定マークを追加します。長さを検出器（30センチメートル）、出口端に毛細管ウィンドウ（0.3センチ）、長さ（10センチメートル）（ すなわち 、40.2センチメートル全長に、 30.0センチメートル有効長）。 </li><li>参考論文に0.2cmの測定マークに毛細管ウィンドウを合わせます。テープで毛細血管を修正し、毛細血管が計測マーク外2ミリメートルを終了マーク。 </li><li>切断石のフラッシュエッジを使用して、単一の直線運動にキャピラリー入口端部（窓からの終了最も遠い）で保護キャップをカットします。<ol><li>キャピラリー内側のコーティングに恒久的な損傷を避けるために、水で満たされたキャップされたユニバーサルバイアル中に毛細管の端を浸し。この手順を、キャピラリー末端以上1分周囲に露出されるたびに繰り返します。 </li></ol></li><li>カートリッジの出口側にキャピラリー入口端部を挿入します。 </li><li>キャピラリーウィンドウがカートリッジウィンドウにセンタリングされるまで、必要に応じてカートリッジを通して毛細血管を押して引きます。 </li><li>カートリッジウィンドウに絞りプラグ（100ミクロン×200μm）を挿入します。 注：光の白色光源にさらされたときに、白色光が窓を通過することを確認してください。通過した光は、茶色がかった外観を持っている場合は、必要に応じて調整します。 </li><li> （そのために、両端にプリインストールされたチューブナット、フェルールとOリング付き）40.2センチメートルの総キャピラリー長のために予め形成された冷却水チューブ内に毛細管を挿入します。 </li><li> coolanを通して毛細血管を押してくださいキャピラリーチューブのもう一方の側に表示されるまで、必要に応じトンチューブ。 </li><li>カートリッジの出口側に冷却水チューブの先端を挿入し、チューブナットを締めます。 </li><li>カートリッジの入口側にキャピラリー入口端部を挿入します。 </li><li>キャピラリーカートリッジの入口側に表示されるまで、必要に応じてカートリッジを通して毛細血管を押して引きます。 </li><li>カートリッジの入口側に冷却水チューブの先端を挿入し、チューブナットを締めます。 </li><li>切断石のフラッシュエッジを使用して、単一の直線運動のキャピラリー出口端部（窓から最も近い端部）に保護キャップをカットします。 </li><li>キャピラリー端にあるシールリテーナクリップを挿入し、所定の位置にスナップするキーを押します。視覚的に毛細管の端部を点検します。彼らもない場合は、手順を繰り返します。 </li><li>ワークベンチの端にキャピラリーの長さのテンプレートを配置します。 </li><li> AGを下向きにカートリッジを置きますキャピラリーの長さのテンプレートをainstとキャピラリは、テンプレート上の基準線で終わる揃えます。毛細管計測マークは、（3.2.4を参照）の基準線と整列していない場合は、必要に応じて調整します。 </li><li>キャピラリー長のテンプレートに対する毛細血管を持ち、テンプレート上の基準線下の切断石2ミリメートルのフラッシュエッジを使用して、キャピラリーの両端をカット。 </li><li>視覚的に毛細血管が虫眼鏡で終わる検査。キャピラリー端が滑らかでない場合は、切断石のソフト面を使用してそれらを磨きます。 </li><li> Oリングの挿入工具を使用して、開口プラグ孔に絞りOリングを挿入します。 </li><li>バイアルに挿入されたキャピラリーの末端ですぐにケースにカートリッジケースと場所のカートリッジ内に水を満たしキャップされたユニバーサルバイアルをインストールします。短期および長期保存のために2〜8℃で保管してください。 </li></ol></li><li> バッファトレイの準備。 <ol><li>キャップされたユニバースを記入し、配置バッファ入口におけるAlバイアルおよび出口トレー（ 図1）。すべての6サンプルの注入のための1レーンを配置し、分析されるサンプルの数に応じて繰り返しバイアルレーン2における位置、3、4、5、。 注：現在の漏れを防止するために、バイアルキャップ湿潤避けます。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig1.jpg" /> 図1：位置とバッファ入口と出口トレイにユニバーサルバイアルのレベルを埋めます。レベルを入力します。= 1400年1月1日μL、3/4 = 1300μLと1/2 = 1000μL。略語：W =水、塩酸= 0.1 M塩酸。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="4"><li> CEシステムコンポーネントアセンブリ。 <ol><li> UV検出器を取り付けます。 </li><li>開放レバーをインストールインターフェイスブロックにまで押します。 </li><li>光ファイバケーブルを取り付けます。クランプバーに対応する端部を挿入し、両端を保持しながら、時計回りに回転させます。 UV検出器へのもう一方の端を接続します。 注：その破壊を引き起こす可能性が曲げため、この手順の間に注意して光ファイバケーブルを処理します。 </li><li>場所のサンプルとサンプル保持システムにバッファトレイとは、所定の位置にはめ込みます。 </li><li>インターフェイスブロックにキャピラリーカートリッジを置き、両端にクランプバーを押しながら、ノブを締めます。 </li></ol></li></ol> 4.機器のメソッドセットアップ<ol><li>電圧、最大：：次のパラメータと、表1によれば、コンディショニングを作成して実行し、シャットダウン楽器方法30.0 kVの。現在、最大：300.0μA。カートリッジの温度：20.0°C;サンプル保存温度：10.0°C。 UV検出器初期条件：波長：214nmで、データレート：4ヘルツ。フィルター：ノーマル;ピーク幅（ポイント）：16-25;吸光度信号：ダイレクト。 注：データ取得速度は、狭い分離ゾーンのカバレッジを向上させるために、25ヘルツまで増加させることができます。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="8">コンディショニング方式のタイムプログラム</td></tr><tr><td> 時間（分） </td><td> イベント </td><td> 値 </td><td> デュレーション </td><td> 入口バイアル </td><td> アウトレットバイアル </td><td> 概要 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 1.0分</td><td> BI：C1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード</td><td>塩酸0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 2.0分</td><td> BI：B1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード</td> &lt;TD&gt;水</td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 10.0分</td><td> BI：E1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード</td><td> BGE </td></tr><tr><td> 0.00 </td><td>セパレート - 電圧</td><td> 15.0 KV </td><td> 10.0分</td><td> BI：D1 </td><td> BO：D1 </td><td> 0.17分ランプ、通常の極性</td><td>別</td></tr><tr><td> 10.00 </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2758ミリバール</td><td> 10.0分</td><td> BI：E1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード</td><td> BGE </td></tr><tr><td> 20.01 </td><td>待つ</td><td> - </td><td> 0.0分</td><td> BI：A1 </td><td> BO：A1 </td><td> - </td><td>リンスのヒント</td></tr><tr><td colspan="8">方式のタイムプログラムを実行します</td></tr><tr><td> 時間（分） </td><td> イベント </td><td> 値 </td><td> デュレーション </td><td> 入口バイアル </td><tD&gt; アウトレットバイアル </td><td> 概要 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 1.0分</td><td> BI：C1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード、イン/アウトバイアル株式会社6 </td><td>塩酸0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 2.0分</td><td> BI：B1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード、イン/アウトバイアル株式会社6 </td><td>水</td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 4.0分</td><td> BI：E1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード、イン/アウトバイアル株式会社6 </td><td> BGE </td></tr><tr><td> - </td><td>注入 - 圧力を</td><td> 34ミリバール</td><td> 20.0秒</td><td> SI：A1 </td><td> BO：B1 </td><td>フォワード、オーバーライド</td><td>試料注入</td></tr><tr><td> - </td><td>待つ</td><td> - </td><td> 0.4分</td><td> BI：A1 </td><td> BO：A1 </td><td>アウト/インバイアル株式会社6 </td><td>ウォッシュのヒント</td></tr><tr><td> 0 </td><td>セパレート - 電圧</td><td> 15.0 KV </td><td> 30.0分</td><td> BI：D1 </td><td> BO：D1 </td><td> 0.17分ランプ、通常の極性、イン/アウトバイアル株式会社6 </td><td>サンプル分離</td></tr><tr><td> 0.5 </td><td>オートゼロ</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.01 </td><td>データを停止します</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.02 </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 2.0分</td><td> BI：B1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード、イン/アウトバイアル株式会社6 </td><td>水</td></tr><tr><td> 32.03 </td><td>待つ</td><td> - </td><td> 0.0分</td><td> BI：A1 </td><td> BO：A1 </td><td>アウト/インバイアル株式会社6 </td><td>リンスのヒント</td></tr><tr><td> 32.04 </td><td>終わり</td><td> -</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td>終わり</td></tr><tr><td colspan="8">シャットダウン方式のタイムプログラム</td></tr><tr><td> 時間（分） </td><td> イベント </td><td> 値 </td><td> デュレーション </td><td> 入口バイアル </td><td> アウトレットバイアル </td><td> 概要 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 1.0分</td><td> BI：E6 </td><td> BO：E6 </td><td>フォワード</td><td>塩酸0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 6.0分</td><td> BI：F6 </td><td> BO：F6 </td><td>フォワード</td><td>水</td></tr><tr><td> - </td><td>ランプ - オフ</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td>待つ</td><td> - </td><td> 0.0分</td><td> BI：A1 </td><td> BO：A1 </td><td> - </td><td>リンスのヒント</td></tr></tbody></table> 表1：エアコン、実行し、シャットダウン時間のプログラム。 5.データ収集と処理<ol><li> サンプルセットをプログラムします。 <ol><li>空調機器のメソッドを使用して調整するためのキャピラリーをプログラムします。毛細管が初めて使用されるとき、プログラム4回繰り返し、そうでなければコンディショニング方法の2つだけの反復をプログラムします。 </li><li>プログラム実行中の機器法を用いて分析されるサンプル。 </li><li>シャットダウン装置メソッドを使用してストレージ用のキャピラリーをプログラムし、セクション3.2.22に示されている手順を繰り返します。 </li></ol></li><li>実験を実行します。 </li><li>電気泳動図をエクスポートします。 </li><li>移動時間を計算し、基本的な、メインAの含有率電気泳動プロファイルの垂直ドロップラインの統合を使用して酸性のアイソフォームND。 </li></ol>

<ol>
	<li>Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advent+of+monoclonal+antibodies+in+the+treatment+of+chronic+autoimmune+diseases.">The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases.</a> Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).</li><li>Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+monoclonal+antibodies.">Heterogeneity of monoclonal antibodies.</a> J. Pharm. Sci. 97 (7), 2426-2447 (2008).</li><li>Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+analysis+of+therapeutic+proteins+by+capillary+and+microchip+electrophoresis.">Recent advances in the analysis of therapeutic proteins by capillary and microchip electrophoresis.</a> Anal. Methods. 6 (15), 5427-5449 (2014).</li><li>Fekete, S., Guillarme, D., Sandra, P., Sandra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic,+Electrophoretic,+and+Mass+Spectrometric+Methods+for+the+Analytical+Characterization+of+Protein+Biopharmaceuticals.">Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals.</a> Anal. Chem. 88 (1), 480-507 (2016).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+identity,+charge+variants,+and+disulfide+isomers+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+an+uncoated+capillary+column.">Analysis of identity, charge variants, and disulfide isomers of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in an uncoated capillary column.</a> Anal. Chem. 82 (8), 3222-3230 (2010).</li><li>He, Y., Isele, C., Hu, W., Ruesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+charge+variants+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+dynamically+coated+fused-silica+capillary.">Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary.</a> J. Sep. Sci. 34 (5), 548-555 (2011).</li><li>Zhao, S. S., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+capillary+electrophoresis+in+characterizing+recombinant+protein+therapeutics.">Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics.</a> Electrophoresis. 35 (1), 96-108 (2014).</li><li>&#352;t&#283;p&#225;nov&#225;, S., Ka&#353;i&#269;ka, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+impurities+and+counterions+of+pharmaceuticals+by+capillary+electromigration+methods.">Determination of impurities and counterions of pharmaceuticals by capillary electromigration methods.</a> J. Sep. Sci. 37 (15), 2039-2055 (2014).</li><li>&#352;t&#283;p&#225;nov&#225;, S., Ka&#353;i&#269;ka, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+capillary+electromigration+methods+to+separation+and+analysis+of+proteins.">Recent applications of capillary electromigration methods to separation and analysis of proteins.</a> Anal. Chim. Acta. 933, 23-42 (2016).</li><li>Espinosa-de la Garza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+recombinant+monoclonal+antibodies+by+capillary+zone+electrophoresis.">Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis.</a> Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).</li><li>Staub, A., Guillarme, D., Schappler, J., Veuthey, J. L., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+protein+analysis+in+the+biopharmaceutical+field.">Intact protein analysis in the biopharmaceutical field.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 55 (4), 810-822 (2011).</li><li>Altria, K. D., Altria, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting.">Troubleshooting.</a> Methods in Molecular Biology, Vol 52. Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation and Applications. , (1996).</li><li>Ma, S., Nashabeh, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+therapeutics+by+capillary+electrophoresis.">Analysis of protein therapeutics by capillary electrophoresis.</a> Chromatographia. 53 (5), 75-89 (2001).</li><li>Jaccoulet, E., Smadja, C., Prognon, P., Taverna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis+for+rapid+identification+of+monoclonal+antibodies+for+routine+application+in+hospital.">Capillary electrophoresis for rapid identification of monoclonal antibodies for routine application in hospital.</a> Electrophoresis. 36 (17), 2050-2056 (2015).</li></ol>

The authors Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, N&#233;stor O. P&#233;rez, Luis F. Flores-Ortiz and Emilio Medina-Rivero are employees of Probiomed S.A. de C.V., which is developing, manufacturing and marketing biosimilar products. All authors are involved in the development of biosimilar products for Probiomed.

CZEが成功する確率を高めるために、mAbの分析を行う際に、このチュートリアルでは、適切な実践の重要性を強調しています。 CZEが日常的に使用されている場合しかし、問題は必然的に12生じます。 最良の結果を得るために、彼らが困難なステップを克服し、トラブルシューティングするためのアナリストを助けるように、プロトコル全体に含まれていたノート?...

モノクローナル抗体（mAb）は原因でいくつかの慢性および変性疾患1に対して作用する能力に関心の増加に伴ってバイオ治療タンパク質です。他の生体分子と同様に、mAbは（生合成から最終製品まで、 すなわち ）そのライフサイクルのすべての段階でいくつかの物理化学的修飾を受けるする傾向があります。このような修飾としては、限定されるものではないが：脱アミド化、グリコシル化、酸化、環化、異性化、凝集およびタンパク質分解性切断2。したがって、内因性のイソ型を解決することが可能な分析技術は、品質規格を確立するために、モノクローナル抗体の不均一性と安定性を監視するために必要とされます。 キャピラリー電気泳動（CE）は、バックグラウンド電解液（BGE）を充填した狭い溶融シリカチューブ（μmの範囲）の高性能分離技術行っoutinsideあります。電界を印加すると、荷電分子（3万Vまで）sが反対の電荷（ すなわち 、電気駆動の分離）を有する電極に向かって移動します。 CEでの高電圧の使用は、古典的なゲル電気泳動に優れており、高速分析と効率の向上を可能にします。キャピラリーゾーン電気泳動（CZE）は、定期的に製品の品質評価3-9ためにバイオ医薬品産業で使用されるCEベースの技術です。 CE（ 例えば 、キャピラリーゲル電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動）またはクロマトグラフィーをベースとする方法の他のモードとは異なり、CZEは、その天然の状態10に近いmAbの固有の不均一性の解析を可能にする、変性剤または固相界面を用いることなく実施することができます。モノクローナル抗体アイソフォームのCZE分離は、親水性ポリマー（中性毛細血管）で覆われた溶融シリカキャピラリーの内部で発生した電荷、質量、大きさや形状（または流体力学的体積）11によって支配されているそれらの異なる電気泳動移動度に基づいています。モノクローナル抗体部分は、ときに検出されますそれらは、動員および214 nmの4の紫外線（UV）吸光度検出器によって検出される検出窓を通過しています。 この分析技術の実装を成功させるには、前と実験中に詳細に適切な配慮に依存することになります。そうでなければ作用し、最終的に一定の障害や不満につながる、分析を行うためのコストと時間を増加します。 ここでは、ソリューションやサンプル、CEシステム、設定機器方法、データ収集の準備の準備の詳細な説明を通じてCZEによりモノクローナル抗体の異質性の成功した分析を行うためにステップバイステップのガイドを提示し、処理。このチュートリアルの目的のために、組換え完全ヒト抗腫瘍壊死因子アルファ（抗TNFα）モノクローナル抗体は、タンパク質モデルとして使用されます。しかしながら、このプロトコルは、簡単に短時間の変更を考慮し、他のタンパク質の分析のためにカスタマイズすることができます。 Additionally、潜在的な問題を軽減するためのいくつかの推奨事項が提案されています。読者が成功する確率が増加するように厳密に、提案されたプロトコルに従うことが奨励されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Tecsiquim</td>
			<td>AT0035-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACS grade hydrochloric acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>53300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Hydroxypropyl) methyl cellulose&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>09963</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>517992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,&#160; pH 8</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>477427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A66528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCAP Neutral capillary&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>477441</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, Micro, 200 &#181;l</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>144709</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Vial Caps</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A62250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Vials</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A62251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable, Optics, UV/Vis</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>144093</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis Detector Module</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>144733</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridge Assembly Kit, Blank</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>144738</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis separation of monoclonal antibody isoforms using a neutral capillary

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.

図2は、200mMのEACA、30ミリモルの酢酸リチウムの典型的な電流プロファイルを示し、トリス緩衝液（50mM、pH8.0）で希釈した抗TNFαモノクローナル抗体の試料を用いてpHを4.8 BGE。観察されるように、現在の分析を通して安定であり、30〜35μAの値の間で振動することができます。 図3は、検出されたピークは、ヒスタミン内部標準に対?...

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Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

ニュートラルキャピラリーを使用したモノクローナル抗体アイソフォームのキャピラリー電気泳動分離

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

capillary-electrophoresis-separation-monoclonal-antibody-isoforms

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.6K ビュー.  Unidad de Investigación y Desarrollo, Probiomed S.A. de C.V.. Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

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Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

生体試料の代謝プロファイリングのためのSheathlessキャピラリー電気泳動 - 質量分析法

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

生化学

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

治療用抗体の実験室規模の産生および精製

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the use of four routinely used biosensor platforms in our laboratory to evaluate the binding affinity and kinetics of ten high-affinity monoclonal antibodies (mAbs) against human proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9). While both Biacore T100 and ProteOn XPR36 are derived from the well-established Surface Plasmon Resonance (SPR) technology, the former has four flow cells connected by serial flow configuration, whereas the latter presents 36 reaction spots in parallel through an improvised 6 x 6 crisscross microfluidic channel configuration. The IBIS MX96 also operates based on the SPR sensor technology, with an additional imaging feature that provides detection in spatial orientation. This detection technique coupled with the Continuous Flow Microspotter (CFM) expands the throughput significantly by enabling multiplex array printing and detection of 96 reaction sports simultaneously. In contrast, the Octet RED384 is based on the BioLayer Interferometry (BLI) optical principle, with fiber-optic probes acting as the biosensor to detect interference pattern changes upon binding interactions at the tip surface. Unlike the SPR-based platforms, the BLI system does not rely on continuous flow fluidics; instead, the sensor tips collect readings while they are immersed in analyte solutions of a 384-well microplate during orbital agitation.
Each of these biosensor platforms has its own advantages and disadvantages. To provide a direct comparison of these instruments&#39; ability to provide quality kinetic data, the described protocols illustrate experiments that use the same assay format and the same high-quality reagents to characterize antibody-antigen kinetics that fit the simple 1:1 molecular interaction model.

We describe here protocols for the measurement of antibody-antigen binding affinity and kinetics using four commonly used biosensor platforms.

四バイオセンサープラットフォームを用いた高親和性抗体の抗原結合速度の決意

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides an alternative strategy, capillary isoelectric focusing (cIEF), with many advantages compared to conventional immunoblotting. This is an antibody-based, automated, rapid, and quantitative method in which a complete western blotting procedure takes place inside an ultrathin capillary. This technique does not require a gel to transfer to a membrane, stripping of blots, or x-ray films, which are typically required for conventional immunoblotting. Here, proteins are separated according to their charge (isoelectric point; pI), using less than a microliter (400 nL) of total protein lysate. After electrophoresis, proteins are immobilized onto the capillary walls by ultraviolet light treatment, followed by primary and secondary (horseradish peroxidase (HRP) conjugated) antibody incubation, whose binding is detected through enhanced chemiluminescence (ECL), generating a light signal that can be captured and recorded by a charge-coupled device (CCD) camera. The digital image can be analyzed and quantified (peak area) using software. This high throughput procedure can handle 96 samples at a time; is highly sensitive, with protein detection in the picogram range; and produces highly reproducible results because of automation. All of these aspects are extremely valuable when the quantity of samples (e.g., tissue samples and biopsies) is a limiting factor. The technique has wider applications as well, including screening of drugs or antibodies, biomarker discovery, and diagnostic purposes.

Capillary isoelectric focusing is an antibody-based, ultrasensitive, high throughput technique, enabling detailed characterization of proteins and their isoforms from extremely small biological samples. The following describes a protocol for detection and quantification of specific proteins and their isoforms in an automated and robotized manner.

タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソ フォームの高感度・定量的検出

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve classes of intrinsically disordered proteins (IDPs) to reduce oxidative and osmotic stress. This article uses a combination of capillary gel electrophoresis (CGE) and mobility shift affinity electrophoresis (ACE) in order to describe the binding behavior of different conformers of the IDP AtHIRD11 from Arabidopsis thaliana. CGE is used to confirm the purity of AtHIRD11 and to exclude fragments, posttranslational modifications, and other impurities as reasons for complex peak patterns. In this part of the experiment, the different sample components are separated by a viscous gel inside a capillary by their different masses and detected with a diode array detector. Afterward, the binding behavior of the sample towards various metal ions is investigated by ACE. In this case, the ligand is added to the buffer solution and the shift in migration time is measured in order to determine whether a binding event has occurred or not. One of the advantages of using the combination of CGE and ACE to determine the binding behavior of an IDP is the possibility to automate the gel electrophoresis and the binding assay. Furthermore, CGE shows a lower limit of detection than the classical gel electrophoresis and ACE is able to determine the manner of binding a ligand in a fast manner. In addition, ACE can also be applied to other charged species than metal ions. However, the use of this method for binding experiments is limited in its ability to determine the number of binding sites. Nevertheless, the combination of CGE and ACE can be adapted for characterizing the binding behavior of any protein sample towards numerous charged ligands.

This protocol combines the characterization of a protein sample by capillary gel electrophoresis and a fast-binding screening for charged ligands by affinity capillary electrophoresis. It is recommended for proteins with a flexible structure, such as intrinsically disordered proteins, to determine any differences in binding for different conformers.

AtHIRD11 本質的な障害とキャピラリー電気泳動と親和性キャピラリー電気泳動による金属イオンへの結合の解析

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in understanding how such pathways are organized and how they function. There are many methods to detect protein-protein interactions in cells, but relatively few can be used to detect interactions between endogenous proteins. One such method, the proximity ligation assay (PLA), has several advantages to recommend its use. Compared to other common methods of protein-protein interaction analysis, PLA has relatively high sensitivity and specificity, can be performed with minimal cell manipulation, and, in the protocol described herein, requires only two target-specific antibodies derived from different species (e.g., from mouse and rabbit) and one specialized reagent: a set of secondary antibodies that are covalently linked to specific oligonucleotides that, when brought in close proximity of one another, create an amplifiable platform for in situ PCR or rolling circle amplification. In this presentation, we show how to apply the PLA technique to visualize changes in MST1 and MST2 proximity in fixed cells. The technique described in this manuscript is particularly applicable for the analysis of cell signaling studies.

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Here, we show how to use a Proximity Ligation Assay (PLA) to visualize MST1/MST2 heterodimerization in fixed cells with high sensitivity.

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

ミトコンドリアの呼吸鎖 Supercomplexes の分離と分析のためのハイブリッドクリア/ブルーネイティブ電気泳動

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

エチジウム ブロマイドや代替染料ではなくチアゾール オレンジを用いた DNA 電気泳動

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins of several nucleotide-derived secondary messengers (NSMs) have been systematically identified and studied in model organisms. These achievements are mainly due to the development of several new techniques including the capture compound technique and the differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA), which were used to systematically identify target proteins of these small molecules. This paper describes the use of the NSMs, guanosine penta- and tetraphosphates (p)ppGpp, as an example and video demonstration of the DRaCALA technique. Using DRaCALA, 9 out of 20 known and 12 new target proteins of (p)ppGpp were identified in the model organism, Escherichia coli K-12, demonstrating the power of this assay. In principle, DRaCALA could be used for studying small ligands that can be labeled by radioactive isotopes or fluorescent dyes. The critical steps, pros, and cons of DRaCALA are discussed here for further application of this technique.

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

The Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) can be used to identify small ligand binding proteins of an organism by using an ORFeome library.

リガンドアッセイの微小径毛管作用による小リガンドの結合タンパク質の同定(DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...