Name: capillary electrophoresis separation of monoclonal antibody isoforms using a neutral capillary
Uploaded: 2017-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
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The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Ab&#250;ndez, Jes&#250;s Padilla-Calder&#243;n, Jaime M. Uribe-Wiechers, N&#233;stor O. P&#233;rez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.

ソリューションの調製<ol><li> BGE溶液を調製します。 <ol><li> 0.05％からなる溶液100mlを調製（M / V）のヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、200mMのεアミノ、N-アミノカプロン酸（EACA）および30ミリモルの酢酸リチウム。 注：HPMCは、粘弾性ポリマーであるため、ガラスビーカーに粉末を注ぎ、水80 mLを加え、最後に攪拌棒を加えます。通常のように残りの試薬の追加を続けます。それは、目に刺激を与える可能性として酢酸リチウムを取り扱うときは、保護眼鏡を着用してください。 </li><li> 50％（v / v）の酢酸でpHを4.8±0.1に調整します。溶液を5分間安定化し、必要に応じて調整することができます。 </li><li>メスフラスコで最終容量100mlまで作るために水を追加します。 </li><li> 0.2μmの孔サイズを有する親水性膜で濾過します。 </li><li> 7日間まで2〜8℃で保存します。 </li></ol></li><li> 内部標準を準備します。 <ol><li> 1ミリリットルを準備1％（M / V）ヒスタミン成る溶液。 </li><li> 0.2μmの孔サイズを有する親水性膜で濾過します。 </li><li>最大で1日2〜8℃で保存します。 </li></ol></li></ol> 2.試料の調製<ol><li> 1mg / mlの最終濃度にTris緩衝液（50mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、pH8.0）で希釈したmAb試料180μLを準備します。 </li><li> 1％（メートル/ v）のヒスタミンの20μLを加えます。 </li><li>混合し、5秒間千×gで遠心します。 </li><li>ユニバーサルバイアル内部のマイクロバイアルを置きます。 </li><li>マイクロバイアルに試料を移し、ユニバーサルバイアルをキャップ。任意の気泡を導入しないようにするために上向きにサンプルを分注します。 </li><li>最大で1日2〜8℃で保存します。 </li><li>サンプル入口トレイに（試料溶液を含むマイクロバイアルで）ユニバーサルバイアルを置きます。 </li></ol> CEシステムの調製。 <ol><li> CEシステムクリーニング。 注：行動番目ほこりやごみの蓄積から派生した電流リークを避けるために少なくとも週に一度の手順です。しかし、アプリケーションに応じて（ 例えば 、増加した粘度を持つまたは高塩濃度、粘度が増加した試料でBGEの使用）電極と開放レバーが交差汚染やサンプルのキャリーオーバーを防止するために、より頻繁に清掃する必要があります。 <ol><li> CE機器の電源スイッチをオフにし、フロントドアを開きます。 </li><li>水で湿らせた不織布で拭いて、試料保持システム（サンプルとバッファートレイ）、カートリッジカバー、クランプバー、インターフェースブロックおよび電極をサンプルカバーの表面を清掃してください。使用前にエタノールで湿らせたワイプとドライを使用して手順を繰り返します。 </li><li>水で十分に開くレバーをすすぎます。ワイプ不織布とその表面を清掃してください。インストールの前にエタノールで湿らせたワイプとドライを使用して手順を繰り返します。 </li><li>光ファイバケーブルの両端には注意清掃します水で湿らせマイクロファイバーの布でLY。エタノールで湿らせた布で手順を繰り返します。 </li></ol></li><li> カートリッジアセンブリ。 <ol><li>そのパッケージから新しいニュートラルキャピラリー（50μmの内径）を削除します。 </li><li>ワークベンチへの毛細血管の保護チューブの一端ダウンテープ。 、解かまっすぐとチューブ外キャピラリを引き出します。 </li><li>作業台にテープまたは一枚の紙を貼ると、次のように測定マークを追加します。長さを検出器（30センチメートル）、出口端に毛細管ウィンドウ（0.3センチ）、長さ（10センチメートル）（ すなわち 、40.2センチメートル全長に、 30.0センチメートル有効長）。 </li><li>参考論文に0.2cmの測定マークに毛細管ウィンドウを合わせます。テープで毛細血管を修正し、毛細血管が計測マーク外2ミリメートルを終了マーク。 </li><li>切断石のフラッシュエッジを使用して、単一の直線運動にキャピラリー入口端部（窓からの終了最も遠い）で保護キャップをカットします。<ol><li>キャピラリー内側のコーティングに恒久的な損傷を避けるために、水で満たされたキャップされたユニバーサルバイアル中に毛細管の端を浸し。この手順を、キャピラリー末端以上1分周囲に露出されるたびに繰り返します。 </li></ol></li><li>カートリッジの出口側にキャピラリー入口端部を挿入します。 </li><li>キャピラリーウィンドウがカートリッジウィンドウにセンタリングされるまで、必要に応じてカートリッジを通して毛細血管を押して引きます。 </li><li>カートリッジウィンドウに絞りプラグ（100ミクロン×200μm）を挿入します。 注：光の白色光源にさらされたときに、白色光が窓を通過することを確認してください。通過した光は、茶色がかった外観を持っている場合は、必要に応じて調整します。 </li><li> （そのために、両端にプリインストールされたチューブナット、フェルールとOリング付き）40.2センチメートルの総キャピラリー長のために予め形成された冷却水チューブ内に毛細管を挿入します。 </li><li> coolanを通して毛細血管を押してくださいキャピラリーチューブのもう一方の側に表示されるまで、必要に応じトンチューブ。 </li><li>カートリッジの出口側に冷却水チューブの先端を挿入し、チューブナットを締めます。 </li><li>カートリッジの入口側にキャピラリー入口端部を挿入します。 </li><li>キャピラリーカートリッジの入口側に表示されるまで、必要に応じてカートリッジを通して毛細血管を押して引きます。 </li><li>カートリッジの入口側に冷却水チューブの先端を挿入し、チューブナットを締めます。 </li><li>切断石のフラッシュエッジを使用して、単一の直線運動のキャピラリー出口端部（窓から最も近い端部）に保護キャップをカットします。 </li><li>キャピラリー端にあるシールリテーナクリップを挿入し、所定の位置にスナップするキーを押します。視覚的に毛細管の端部を点検します。彼らもない場合は、手順を繰り返します。 </li><li>ワークベンチの端にキャピラリーの長さのテンプレートを配置します。 </li><li> AGを下向きにカートリッジを置きますキャピラリーの長さのテンプレートをainstとキャピラリは、テンプレート上の基準線で終わる揃えます。毛細管計測マークは、（3.2.4を参照）の基準線と整列していない場合は、必要に応じて調整します。 </li><li>キャピラリー長のテンプレートに対する毛細血管を持ち、テンプレート上の基準線下の切断石2ミリメートルのフラッシュエッジを使用して、キャピラリーの両端をカット。 </li><li>視覚的に毛細血管が虫眼鏡で終わる検査。キャピラリー端が滑らかでない場合は、切断石のソフト面を使用してそれらを磨きます。 </li><li> Oリングの挿入工具を使用して、開口プラグ孔に絞りOリングを挿入します。 </li><li>バイアルに挿入されたキャピラリーの末端ですぐにケースにカートリッジケースと場所のカートリッジ内に水を満たしキャップされたユニバーサルバイアルをインストールします。短期および長期保存のために2〜8℃で保管してください。 </li></ol></li><li> バッファトレイの準備。 <ol><li>キャップされたユニバースを記入し、配置バッファ入口におけるAlバイアルおよび出口トレー（ 図1）。すべての6サンプルの注入のための1レーンを配置し、分析されるサンプルの数に応じて繰り返しバイアルレーン2における位置、3、4、5、。 注：現在の漏れを防止するために、バイアルキャップ湿潤避けます。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig1.jpg" /> 図1：位置とバッファ入口と出口トレイにユニバーサルバイアルのレベルを埋めます。レベルを入力します。= 1400年1月1日μL、3/4 = 1300μLと1/2 = 1000μL。略語：W =水、塩酸= 0.1 M塩酸。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="4"><li> CEシステムコンポーネントアセンブリ。 <ol><li> UV検出器を取り付けます。 </li><li>開放レバーをインストールインターフェイスブロックにまで押します。 </li><li>光ファイバケーブルを取り付けます。クランプバーに対応する端部を挿入し、両端を保持しながら、時計回りに回転させます。 UV検出器へのもう一方の端を接続します。 注：その破壊を引き起こす可能性が曲げため、この手順の間に注意して光ファイバケーブルを処理します。 </li><li>場所のサンプルとサンプル保持システムにバッファトレイとは、所定の位置にはめ込みます。 </li><li>インターフェイスブロックにキャピラリーカートリッジを置き、両端にクランプバーを押しながら、ノブを締めます。 </li></ol></li></ol> 4.機器のメソッドセットアップ<ol><li>電圧、最大：：次のパラメータと、表1によれば、コンディショニングを作成して実行し、シャットダウン楽器方法30.0 kVの。現在、最大：300.0μA。カートリッジの温度：20.0°C;サンプル保存温度：10.0°C。 UV検出器初期条件：波長：214nmで、データレート：4ヘルツ。フィルター：ノーマル;ピーク幅（ポイント）：16-25;吸光度信号：ダイレクト。 注：データ取得速度は、狭い分離ゾーンのカバレッジを向上させるために、25ヘルツまで増加させることができます。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="8">コンディショニング方式のタイムプログラム</td></tr><tr><td> 時間（分） </td><td> イベント </td><td> 値 </td><td> デュレーション </td><td> 入口バイアル </td><td> アウトレットバイアル </td><td> 概要 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 1.0分</td><td> BI：C1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード</td><td>塩酸0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 2.0分</td><td> BI：B1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード</td> &lt;TD&gt;水</td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 10.0分</td><td> BI：E1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード</td><td> BGE </td></tr><tr><td> 0.00 </td><td>セパレート - 電圧</td><td> 15.0 KV </td><td> 10.0分</td><td> BI：D1 </td><td> BO：D1 </td><td> 0.17分ランプ、通常の極性</td><td>別</td></tr><tr><td> 10.00 </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2758ミリバール</td><td> 10.0分</td><td> BI：E1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード</td><td> BGE </td></tr><tr><td> 20.01 </td><td>待つ</td><td> - </td><td> 0.0分</td><td> BI：A1 </td><td> BO：A1 </td><td> - </td><td>リンスのヒント</td></tr><tr><td colspan="8">方式のタイムプログラムを実行します</td></tr><tr><td> 時間（分） </td><td> イベント </td><td> 値 </td><td> デュレーション </td><td> 入口バイアル </td><tD&gt; アウトレットバイアル </td><td> 概要 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 1.0分</td><td> BI：C1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード、イン/アウトバイアル株式会社6 </td><td>塩酸0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 2.0分</td><td> BI：B1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード、イン/アウトバイアル株式会社6 </td><td>水</td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 4.0分</td><td> BI：E1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード、イン/アウトバイアル株式会社6 </td><td> BGE </td></tr><tr><td> - </td><td>注入 - 圧力を</td><td> 34ミリバール</td><td> 20.0秒</td><td> SI：A1 </td><td> BO：B1 </td><td>フォワード、オーバーライド</td><td>試料注入</td></tr><tr><td> - </td><td>待つ</td><td> - </td><td> 0.4分</td><td> BI：A1 </td><td> BO：A1 </td><td>アウト/インバイアル株式会社6 </td><td>ウォッシュのヒント</td></tr><tr><td> 0 </td><td>セパレート - 電圧</td><td> 15.0 KV </td><td> 30.0分</td><td> BI：D1 </td><td> BO：D1 </td><td> 0.17分ランプ、通常の極性、イン/アウトバイアル株式会社6 </td><td>サンプル分離</td></tr><tr><td> 0.5 </td><td>オートゼロ</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.01 </td><td>データを停止します</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.02 </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 2.0分</td><td> BI：B1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード、イン/アウトバイアル株式会社6 </td><td>水</td></tr><tr><td> 32.03 </td><td>待つ</td><td> - </td><td> 0.0分</td><td> BI：A1 </td><td> BO：A1 </td><td>アウト/インバイアル株式会社6 </td><td>リンスのヒント</td></tr><tr><td> 32.04 </td><td>終わり</td><td> -</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td>終わり</td></tr><tr><td colspan="8">シャットダウン方式のタイムプログラム</td></tr><tr><td> 時間（分） </td><td> イベント </td><td> 値 </td><td> デュレーション </td><td> 入口バイアル </td><td> アウトレットバイアル </td><td> 概要 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 1.0分</td><td> BI：E6 </td><td> BO：E6 </td><td>フォワード</td><td>塩酸0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 6.0分</td><td> BI：F6 </td><td> BO：F6 </td><td>フォワード</td><td>水</td></tr><tr><td> - </td><td>ランプ - オフ</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td>待つ</td><td> - </td><td> 0.0分</td><td> BI：A1 </td><td> BO：A1 </td><td> - </td><td>リンスのヒント</td></tr></tbody></table> 表1：エアコン、実行し、シャットダウン時間のプログラム。 5.データ収集と処理<ol><li> サンプルセットをプログラムします。 <ol><li>空調機器のメソッドを使用して調整するためのキャピラリーをプログラムします。毛細管が初めて使用されるとき、プログラム4回繰り返し、そうでなければコンディショニング方法の2つだけの反復をプログラムします。 </li><li>プログラム実行中の機器法を用いて分析されるサンプル。 </li><li>シャットダウン装置メソッドを使用してストレージ用のキャピラリーをプログラムし、セクション3.2.22に示されている手順を繰り返します。 </li></ol></li><li>実験を実行します。 </li><li>電気泳動図をエクスポートします。 </li><li>移動時間を計算し、基本的な、メインAの含有率電気泳動プロファイルの垂直ドロップラインの統合を使用して酸性のアイソフォームND。 </li></ol>

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	<li>Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advent+of+monoclonal+antibodies+in+the+treatment+of+chronic+autoimmune+diseases.">The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases.</a> Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).</li><li>Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+monoclonal+antibodies.">Heterogeneity of monoclonal antibodies.</a> J. Pharm. Sci. 97 (7), 2426-2447 (2008).</li><li>Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. 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Chem. 82 (8), 3222-3230 (2010).</li><li>He, Y., Isele, C., Hu, W., Ruesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+charge+variants+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+dynamically+coated+fused-silica+capillary.">Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary.</a> J. Sep. Sci. 34 (5), 548-555 (2011).</li><li>Zhao, S. S., Chen, D. D. 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The authors Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, N&#233;stor O. P&#233;rez, Luis F. Flores-Ortiz and Emilio Medina-Rivero are employees of Probiomed S.A. de C.V., which is developing, manufacturing and marketing biosimilar products. All authors are involved in the development of biosimilar products for Probiomed.

CZEが成功する確率を高めるために、mAbの分析を行う際に、このチュートリアルでは、適切な実践の重要性を強調しています。 CZEが日常的に使用されている場合しかし、問題は必然的に12生じます。 最良の結果を得るために、彼らが困難なステップを克服し、トラブルシューティングするためのアナリストを助けるように、プロトコル全体に含まれていたノート?...

モノクローナル抗体（mAb）は原因でいくつかの慢性および変性疾患1に対して作用する能力に関心の増加に伴ってバイオ治療タンパク質です。他の生体分子と同様に、mAbは（生合成から最終製品まで、 すなわち ）そのライフサイクルのすべての段階でいくつかの物理化学的修飾を受けるする傾向があります。このような修飾としては、限定されるものではないが：脱アミド化、グリコシル化、酸化、環化、異性化、凝集およびタンパク質分解性切断2。したがって、内因性のイソ型を解決することが可能な分析技術は、品質規格を確立するために、モノクローナル抗体の不均一性と安定性を監視するために必要とされます。 キャピラリー電気泳動（CE）は、バックグラウンド電解液（BGE）を充填した狭い溶融シリカチューブ（μmの範囲）の高性能分離技術行っoutinsideあります。電界を印加すると、荷電分子（3万Vまで）sが反対の電荷（ すなわち 、電気駆動の分離）を有する電極に向かって移動します。 CEでの高電圧の使用は、古典的なゲル電気泳動に優れており、高速分析と効率の向上を可能にします。キャピラリーゾーン電気泳動（CZE）は、定期的に製品の品質評価3-9ためにバイオ医薬品産業で使用されるCEベースの技術です。 CE（ 例えば 、キャピラリーゲル電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動）またはクロマトグラフィーをベースとする方法の他のモードとは異なり、CZEは、その天然の状態10に近いmAbの固有の不均一性の解析を可能にする、変性剤または固相界面を用いることなく実施することができます。モノクローナル抗体アイソフォームのCZE分離は、親水性ポリマー（中性毛細血管）で覆われた溶融シリカキャピラリーの内部で発生した電荷、質量、大きさや形状（または流体力学的体積）11によって支配されているそれらの異なる電気泳動移動度に基づいています。モノクローナル抗体部分は、ときに検出されますそれらは、動員および214 nmの4の紫外線（UV）吸光度検出器によって検出される検出窓を通過しています。 この分析技術の実装を成功させるには、前と実験中に詳細に適切な配慮に依存することになります。そうでなければ作用し、最終的に一定の障害や不満につながる、分析を行うためのコストと時間を増加します。 ここでは、ソリューションやサンプル、CEシステム、設定機器方法、データ収集の準備の準備の詳細な説明を通じてCZEによりモノクローナル抗体の異質性の成功した分析を行うためにステップバイステップのガイドを提示し、処理。このチュートリアルの目的のために、組換え完全ヒト抗腫瘍壊死因子アルファ（抗TNFα）モノクローナル抗体は、タンパク質モデルとして使用されます。しかしながら、このプロトコルは、簡単に短時間の変更を考慮し、他のタンパク質の分析のためにカスタマイズすることができます。 Additionally、潜在的な問題を軽減するためのいくつかの推奨事項が提案されています。読者が成功する確率が増加するように厳密に、提案されたプロトコルに従うことが奨励されています。

<table><tbody><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Tecsiquim</td><td>AT0035-7</td><td></td></tr><tr><td>ACS grade hydrochloric acid</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-05</td><td></td></tr><tr><td>Histamine dihydrochloride</td><td>Fluka</td><td>53300</td><td></td></tr><tr><td>(Hydroxypropyl) methyl cellulose&amp;nbsp;</td><td>Fluka</td><td>09963</td><td></td></tr><tr><td>Lithium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>6-Aminocaproic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,&amp;nbsp; pH 8</td><td>Beckman Coulter</td><td>477427</td><td></td></tr><tr><td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66528</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Neutral capillary&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>477441</td><td></td></tr><tr><td>Vial, Micro, 200 &amp;micro;l</td><td>Beckman Coulter</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>Universal Vial Caps</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62250</td><td></td></tr><tr><td>Universal Vials</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62251</td><td></td></tr><tr><td>Cable, Optics, UV/Vis</td><td>Beckman Coulter</td><td>144093</td><td></td></tr><tr><td>UV/Vis Detector Module</td><td>Beckman Coulter</td><td>144733</td><td></td></tr><tr><td>Cartridge Assembly Kit, Blank</td><td>Beckman Coulter</td><td>144738</td><td></td></tr></tbody></table>

capillary electrophoresis separation of monoclonal antibody isoforms using a neutral capillary

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.

図2は、200mMのEACA、30ミリモルの酢酸リチウムの典型的な電流プロファイルを示し、トリス緩衝液（50mM、pH8.0）で希釈した抗TNFαモノクローナル抗体の試料を用いてpHを4.8 BGE。観察されるように、現在の分析を通して安定であり、30〜35μAの値の間で振動することができます。 図3は、検出されたピークは、ヒスタミン内部標準に対?...

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Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

ニュートラルキャピラリーを使用したモノクローナル抗体アイソフォームのキャピラリー電気泳動分離

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

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Biochemistry

12.6K ビュー.  Unidad de Investigación y Desarrollo, Probiomed S.A. de C.V.. Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

ビデオ: Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides an alternative strategy, capillary isoelectric focusing (cIEF), with many advantages compared to conventional immunoblotting. This is an antibody-based, automated, rapid, and quantitative method in which a complete western blotting procedure takes place inside an ultrathin capillary. This technique does not require a gel to transfer to a membrane, stripping of blots, or x-ray films, which are typically required for conventional immunoblotting. Here, proteins are separated according to their charge (isoelectric point; pI), using less than a microliter (400 nL) of total protein lysate. After electrophoresis, proteins are immobilized onto the capillary walls by ultraviolet light treatment, followed by primary and secondary (horseradish peroxidase (HRP) conjugated) antibody incubation, whose binding is detected through enhanced chemiluminescence (ECL), generating a light signal that can be captured and recorded by a charge-coupled device (CCD) camera. The digital image can be analyzed and quantified (peak area) using software. This high throughput procedure can handle 96 samples at a time; is highly sensitive, with protein detection in the picogram range; and produces highly reproducible results because of automation. All of these aspects are extremely valuable when the quantity of samples (e.g., tissue samples and biopsies) is a limiting factor. The technique has wider applications as well, including screening of drugs or antibodies, biomarker discovery, and diagnostic purposes.

Capillary isoelectric focusing is an antibody-based, ultrasensitive, high throughput technique, enabling detailed characterization of proteins and their isoforms from extremely small biological samples. The following describes a protocol for detection and quantification of specific proteins and their isoforms in an automated and robotized manner.

タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソ フォームの高感度・定量的検出

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

生化学

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using affinity chromatography.&#160;While affinity chromatography using porous protein A agarose beads packed in columns is arguably the most common method of laboratory scale isolation of antibodies and recombinant proteins expressing Fc fragments of IgG, it can be a time consuming and expensive process.&#160;Time and financial constraints are especially daunting in small basic science labs that must recover hundreds of micrograms to milligram quantities of protein from dilute solutions, yet lack access to high pressure liquid delivery systems and/or personnel with expertise in bioseparations. Moreover, product quantification and characterization may also excessively lengthen processing time over several workdays and inflate expenses (consumables, wages, etc.).&#160;Therefore, a fast, inexpensive, yet effective protocol is needed for laboratory scale isolation and characterization of antibodies and other proteins possessing an Fc fragment.&#160;To this end, we have devised a protocol that can be completed by limited-experience technical staff in less than 9 hr (roughly one workday) and as quickly as 4 hr, as opposed to traditional methods that demand 20+ work hours. Most required equipment is readily available in standard biomedical science, biochemistry, and (bio)chemical engineering labs, and all reagents are commercially available.&#160;To demonstrate this protocol, representative results are presented in which chimeric&#160;murine galectin-1 fused to human Fc (Gal-1hFc) from cell culture supernatant was isolated using a protein A membrane adsorber.&#160;Purified Gal-1hFc was quantified using an expedited Western blotting analysis procedure and characterized using flow cytometry. The streamlined workflow can be modified for other Fc-expressing proteins, such as antibodies, and/or altered to incorporate alternative quantification and characterization methods.

Compared with traditional affinity chromatography using protein A agarose bead-packed columns, protein A membrane adsorbers can significantly speed laboratory-scale isolation of antibodies and other Fc fragment-expressing proteins.&#160;Appropriate analysis and quantification methods can further accelerate protein processing, allowing isolation/characterization to be completed in one workday, instead of 20+ work hours.

タンパク質A膜吸着体と合理化されたワークフローを用いたキメラヒトFc発現タンパク質の単離と特性評価

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

生物工学

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

免疫・感染学

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

自動化された微生物叢システムを用いた中国ハムスター卵巣細胞からのモノクローナル抗体の精製と分析

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. However, similar to other antibody-based protein assays, optimization of capillary-based immunoassay parameters, such as protein concentration, antibody dilution, and exposure time is an important prerequisite to the generation of meaningful and reliable data. Measurements must fall within the linear range of the assay where changes in signal are directly proportional to changes in lysate concentration. The process of choosing appropriate lysate concentrations, antibody dilutions, and exposure times in the human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B, is demonstrated here. Assay linearity is shown over a range of whole cell extract protein concentrations with p53 and &#945;-tubulin antibodies. An example of signal burnout is seen at the highest concentrations with long exposure times, and an &#945;-tubulin antibody dilution curve is shown demonstrating saturation. In addition, example experimental results are reported for doxorubicin-treated cells using optimized parameters.

A capillary-based immunoassay using a commercial platform to measure target proteins from total protein preparations is demonstrated. In addition, assay parameters of exposure time, protein concentration, and antibody dilution are optimized for a cell culture model system.

プロシージャおよび自動キャピラリー電気泳動を用いた免疫測定法のためのキーの最適化戦略

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

生物学

Capillary Electrophoresis (CE)

Source: Laboratory of Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Capillary electrophoresis (CE) is a separation technique that separates molecules in an electric field according to size and charge. CE is performed in a small glass tube called a capillary that is filled with an electrolyte solution. Analytes are separated due to differences in electrophoretic mobility, which varies with charge, solvent viscosity, and size. Traditional electrophoresis in gels is limited in the amount of voltage that can be applied because Joule heating effects will ruin the gel and the separation. Capillaries have a large surface area-to-volume ratio and thus dissipate heat better. Therefore, the voltages applied for a capillary electrophoresis experiment are quite large, often 10,000&#8211;20,000 V.
Capillary electrophoresis is useful for high-performance separations. Compared to liquid chromatography, CE separations are often faster and more efficient. However, capillary electrophoresis works best to separate charged molecules, which is not a limitation of liquid chromatography. CE has a greater peak capacity than high-performance liquid chromatography (HPLC), meaning the separations are more efficient and more peaks can be detected. The instrumentation can be very simple. However, HPLC is more versatile and many stationary and mobile phases have been developed for different types of molecules.

Capillary Electrophoresis: Principle, Procedure and Applications

キャピラリー電気泳動 (CE)

Source: Laboratory of Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Capillary electrophoresis (CE) is a separation technique that separates molecules in an ...

Education

JoVE Science Education

化学

分析化学

An Affinity Chromatography Technique for the Purification of Monoclonal Antibodies

Source: Elgundi, Z., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55153">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique for purifying monoclonal antibodies from the culture supernatant obtained from an antibody-producing cell culture. The process involves using a matrix of crosslinked agarose beads with conjugated Protein A, which immobilizes the antibodies in the supernatant on the beads, allowing for effective separation from contaminants. By applying an elution buffer with low pH, the protein A-antibody interaction is loosened, facilitating the collection of antibody-containing fractions.

モノクローナル抗体の精製のためのアフィニティークロマトグラフィー技術

1. Antibody Purification by Affinity Chromatography Using an Automated Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System
NOTE: The following procedure can ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

抗体ベースの技術

製造と精製

DFE-Based Affinity Chromatography: A Technique for Purification of 2F5 Monoclonal Antibodies from a Crude Sample Using High Ionic Strength-Based Elution Conditions

Source: Kn&#246;dler, M. et al., <a href="https://www.jove.com/v/59933">Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes an affinity chromatography technique for purifying 2F5 monoclonal antibodies using the DsRed-2F5-Epitope or DFE ligands. The purified 2F5 monoclonal antibodies are essential drugs in immunotherapy.

DFEベースのアフィニティークロマトグラフィー:高イオン強度ベースの溶出条件を使用して粗サンプルから2F5モノクローナル抗体を精製する技術

Source: Kn&#246;dler, M. et al., Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case ...

生物学的手法

クロマトグラフィー技術

A Capillary Electrophoresis Immunoassay for Protein Biomarker Detection

Source: Sage, J. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60638">Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates a capillary electrophoresis immunoassay protocol for detecting a protein biomarker associated with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human blood platelets. Confirmation of the presence of the ALS biomarker protein is achieved through size-based separation of the platelet proteins followed by chemiluminescent detection.

タンパク質バイオマーカー検出のためのキャピラリー電気泳動イムノアッセイ

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of buffers and ...

特性評価と機能分析

Electrophoresis: Overview

Electrophoresis is a powerful analytical separation technique that relies on the differential migration of charged species when subjected to an electric field. The core strength of electrophoresis lies in its ability to separate high-molecular-weight species in complex mixtures. It has found widespread use in biochemistry, molecular biology, and analytical chemistry, allowing the separation of compounds like amino acids, nucleotides, carbohydrates, and proteins with excellent resolution.
There are two main formats for electrophoretic separations: slab electrophoresis and capillary electrophoresis. Slab Electrophoresis uses a gel matrix, such as agarose or polyacrylamide, which acts as a sieve, allowing molecules to move through the pores. Capillary electrophoresis employs a narrow capillary tube filled with a buffer solution, providing high-resolution separation with rapid analysis time and minimal sample requirements. Although slab electrophoresis is widely used in biochemistry and biology to separate high-molecular-mass species, capillary electrophoresis is a more recent development with several advantages.
Capillary electrophoresis is a separation technique used to analyze complex mixtures of analytes based on their differential migration rates in an applied electric field. In this method, a sample is injected into a narrow capillary tube filled with a buffered solution, and an electric field is applied to facilitate separation. The migration rate of the analyte depends on its charge and size. The smaller, more highly charged ions migrate faster than the larger, less charged ones. In capillary electrophoresis, the migration of sample components is influenced by two types of mobility: electrophoretic mobility and electroosmotic mobility. Electrophoretic mobility is the solute&#39;s response to the applied electric field, with cations moving toward the negatively charged cathode, anions moving toward the positively charged anode, and neutral species remaining stationary. Electroosmotic mobility occurs when the buffer solution moves through the capillary in response to the electric field, typically toward the cathode.
Under normal conditions, capillary electrophoresis separates cations first, followed by neutral species, and finally, the anions. This separation is based on their respective electrophoretic mobilities and electroosmotic flow velocities. Notably, all separated species are eluted from the same end of the capillary, allowing their detection using quantitative detectors. The detector signals produce an electropherogram resembling a chromatogram but feature narrower peaks.
Capillary electrophoresis is a powerful tool for qualitative and quantitative analysis of complex mixtures. It provides information similar to that obtained from other separation techniques, such as gas chromatography (GC) or high-performance liquid chromatography (HPLC).

電気泳動:概要

Electrophoresis is a powerful analytical separation technique that relies on the differential migration of charged species when subjected to an electric ...

ニュートラルキャピラリーを使用したモノクローナル抗体アイソフォームのキャピラリー電気泳動分離

要約

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タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソフォームの高感度・定量的検出

タンパク質A膜吸着体と合理化されたワークフローを用いたキメラヒトFc発現タンパク質の単離と特性評価

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

自動化された微生物叢システムを用いた中国ハムスター卵巣細胞からのモノクローナル抗体の精製と分析

プロシージャおよび自動キャピラリー電気泳動を用いた免疫測定法のためのキーの最適化戦略

キャピラリー電気泳動 (CE)

モノクローナル抗体の精製のためのアフィニティークロマトグラフィー技術

DFEベースのアフィニティークロマトグラフィー:高イオン強度ベースの溶出条件を使用して粗サンプルから2F5モノクローナル抗体を精製する技術

タンパク質バイオマーカー検出のためのキャピラリー電気泳動イムノアッセイ

電気泳動:概要

ニュートラルキャピラリーを使用したモノクローナル抗体アイソフォームのキャピラリー電気泳動分離

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キャピラリー電気泳動 (CE)

モノクローナル抗体の精製のためのアフィニティークロマトグラフィー技術

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タンパク質バイオマーカー検出のためのキャピラリー電気泳動イムノアッセイ

電気泳動:概要

タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソフォームの高感度・定量的検出