Name: capillary electrophoresis separation of monoclonal antibody isoforms using a neutral capillary
Uploaded: 2017-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
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The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Ab&#250;ndez, Jes&#250;s Padilla-Calder&#243;n, Jaime M. Uribe-Wiechers, N&#233;stor O. P&#233;rez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.

1. preparazione di soluzioni <ol><li> Preparare la soluzione BGE. <ol><li> Preparare 100 ml di una soluzione costituita da 0,05% (m / v) di cellulosa idrossi propil metil (HPMC), 200 mM ε-ammino n-caproico (EACA) e 30 mM acetato di litio. NOTA: Come HPMC è un polimero viscoelastico, versare la polvere in un bicchiere di vetro, aggiungere 80 ml di acqua ed infine aggiungere la barra di agitazione. Continuare ad aggiungere i restanti reagenti come normalmente. Indossare occhiali di sicurezza durante la manipolazione di acetato di litio in quanto può causare irritazione agli occhi. </li><li> Regolare pH 4,8 ± 0,1 con 50% (v / v) di acido acetico. Lasciare che la soluzione si stabilizzi per 5 minuti e regolare, se necessario. </li><li> Aggiungere acqua fino ad un volume finale di 100 ml in pallone tarato. </li><li> Filtrare attraverso una membrana idrofila con dimensione dei pori 0,2 micron. </li><li> Conservare a 2-8 ° C per un massimo di 7 giorni. </li></ol></li><li> Preparare lo standard interno. <ol><li> Preparare 1 mLdi una soluzione composta da 1% (m / v) di istamina. </li><li> Filtrare attraverso una membrana idrofila con dimensione dei pori 0,2 micron. </li><li> Conservare a 2-8 ° C per un massimo di 1 giorno. </li></ol></li></ol> Preparazione 2. campione <ol><li> Preparare 180 microlitri di campione mAb diluito con tampone Tris (50 mM tris (idrossimetil) amminometano, pH 8,0) ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. </li><li> Aggiungere 20 ml di 1% (m / v) di istamina. </li><li> Mescolare e centrifugare a 1000 xg per 5 sec. </li><li> Posizionare un micro fiala all&#39;interno di una fiala universale. </li><li> Trasferire il campione nel micro fiala e tappare la fiala universale. Versare il campione verso l&#39;alto per non introdurre bolle. </li><li> Conservare a 2-8 ° C per un massimo di 1 giorno. </li><li> Posizionare la fiala universale (con micro flacone contenente la soluzione di esempio) nel vassoio di ingresso del campione. </li></ol> 3. Preparazione del sistema CE. <ol><li> Sistema CE di pulizia. NOTA: Comportamento °è operazione almeno una volta alla settimana per evitare perdite di corrente elettrica derivata da accumulo di polvere e detriti. Tuttavia, a seconda dell&#39;applicazione (per esempio, l&#39;uso di un BGE con maggiore viscosità o ad alta concentrazione salina, campioni con un aumento di viscosità) elettrodi e leve di apertura può richiedere di essere pulito più frequentemente per evitare la contaminazione incrociata e trascinamento del campione. <ol><li> Spegnere l&#39;interruttore di alimentazione dello strumento CE e aprire lo sportello anteriore. </li><li> Pulire la superficie della copertura del campione, campione tenendo sistema (campione e tampone vassoi), copertura della cartuccia, barra di bloccaggio, blocco dell&#39;interfaccia e gli elettrodi con un inumidito con acqua non tessuto wipe. Ripetere la procedura con un etanolo-inumidito pulire e asciutto prima dell&#39;uso. </li><li> Lavare le leve di apertura a fondo con acqua. Pulire la superficie con un tessuto non tessuto pulire. Ripetere la procedura con un etanolo-inumidito pulire ed asciugare prima dell&#39;installazione. </li><li> Pulire le due estremità del cavo in fibra ottica attentamente con un panno in microfibra inumidito con acqua. Ripetere la procedura con un panno inumidito etanolo. </li></ol></li><li> Cartuccia. <ol><li> Rimuovere un nuovo capillare neutra (50 micron di diametro interno) dalla confezione. </li><li> Nastro giù una estremità del capillare tubo protettivo al banco da lavoro. Srotolare, raddrizzare e tirare il capillare fuori il tubo. </li><li> Attaccare un pezzo di nastro o di carta al banco da lavoro e aggiungere contrassegni di misura come segue: lunghezza al rivelatore (30 cm), la finestra capillare (0,2 cm) e lunghezza all&#39;estremità di uscita (10 cm) (cioè, lunghezza 40,2 cm totale, 30.0 cm di lunghezza efficace). </li><li> Allineare la finestra capillare per il marchio di misura 0,2 centimetri nel documento di riferimento. Fissare il capillare con nastro e segnare l&#39;estremità del capillare 2 mm al di fuori delle marche di stazza. </li><li> Tagliare il cappuccio protettivo all&#39;estremità di entrata capillare (l&#39;estremità più lontana dalla finestra) in un unico movimento rettilineo utilizzando il bordo a filo della pietra scissione.<ol><li> Immergere l&#39;estremità capillare in una fiala universale ricoperto riempita con acqua al fine di evitare danni permanenti al rivestimento interno capillare. Ripetere questa procedura ogni volta che l&#39;estremità capillare è esposto al ambiente per più di 1 min. </li></ol></li><li> Inserire l&#39;estremità di ingresso capillare sul lato di uscita della cartuccia. </li><li> Premere e tirare il capillare attraverso la cartuccia necessaria fino a quando la finestra capillare è centrato alla finestra cartuccia. </li><li> Inserire la spina di apertura (100 micron x 200 micron) nella finestra cartuccia. NOTA: Verificare che la luce bianca passa attraverso la finestra quando esposti ad una sorgente di luce bianca. Se la luce che passa attraverso ha un aspetto brunastro, regolare come necessario. </li><li> Inserire il capillare nel tubo del liquido di raffreddamento preformato per una lunghezza totale capillare di 40,2 cm (con dado tubi pre-installato, puntale e O-ring ad entrambe le estremità in questo ordine). </li><li> Spingere il capillare attraverso il coolantubazione t necessaria fino a quando il capillare appare all&#39;altro lato del tubo. </li><li> Inserire l&#39;estremità del tubo refrigerante nel lato di uscita della cartuccia e serrare il dado tubo. </li><li> Inserire l&#39;estremità di ingresso capillare nel lato di ingresso della cartuccia. </li><li> Premere e tirare il capillare attraverso la cartuccia necessaria fino a quando il capillare appare al lato ingresso della cartuccia. </li><li> Inserire l&#39;estremità del tubo del refrigerante nel lato di entrata della cartuccia e serrare il dado tubo. </li><li> Tagliare il cappuccio protettivo sulla estremità di uscita capillare (l&#39;estremità più vicina dalla finestra) in un unico movimento rettilineo utilizzando il bordo a filo della pietra scissione. </li><li> Inserire le clip di tenuta-fermo sulle estremità dei capillari e premere per scattare in posizione. Effettuare il controllo visivo termina la capillare. Se non lo sono nemmeno, ripetere la procedura. </li><li> Posizionare il modello capillare lunghezza sul bordo del banco di lavoro. </li><li> Posizionare la cartuccia rivolta verso il basso against il modello capillare di lunghezza e allineare l&#39;estremità del capillare con le linee di riferimento sul modello. Se i segni di misura capillare (vedi 3.2.4) non si allineano con le linee di riferimento, regolare come necessario. </li><li> Mantenere il capillare contro il modello capillare di lunghezza e tagliare entrambe le estremità del capillare utilizzando il bordo a filo della scissione pietre 2 mm al di sotto delle linee di riferimento del modello. </li><li> Controllare visivamente il capillare si conclude con una lente di ingrandimento. Se estremità capillari non sono uniformi, lustrare utilizzando il volto morbido della pietra scissione. </li><li> Inserire l&#39;O-ring di apertura nel foro del tappo apertura utilizzando lo strumento di inserimento O-ring. </li><li> Installare fiale universali ricoperti pieni d&#39;acqua nel bossolo e la cartuccia posto in caso immediatamente con le estremità dei capillari inserite in fiale. Per la conservazione a breve e lungo termine, tenere a 2-8 ° C. </li></ol></li><li> Preparazione dei vassoi tampone. <ol><li> Riempire e mettere univers innevateAl fiale in ingresso del buffer e vassoi di uscita (figura 1). le posizioni delle fiale si ripetono in corsie 2, 3, 4 e 5 secondo con il numero di campioni da analizzare, ponendo una corsia per ogni sei iniezioni di campione. NOTA: evitare di bagnare i tappi dei flaconi al fine di evitare la dispersione di corrente. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig1.jpg" /> Figura 1: Posizione e livello di riempimento di fiale universali nei vassoi di entrata e uscita del buffer. Riempire i livelli: 1/1 = 1400 ml, 3/4 = 1300 ml e 1/2 = 1000 ml. Abbreviazioni: W = acqua, HCl = 0,1 M di acido cloridrico. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="4"><li> Sistema CE componenti di assemblaggio. <ol><li> Installare il rivelatore UV. </li><li> Installare le leve di aperturapremendo fino al blocco di interfaccia. </li><li> Installare il cavo in fibra ottica. Inserire l&#39;estremità corrispondente alla barra di bloccaggio e, tenendo entrambe le estremità, ruotare in senso orario. Collegare l&#39;altra estremità al rivelatore UV. NOTA: Maneggiare il cavo in fibra ottica con cura durante questa procedura poiché flessione potrebbe causare la sua frattura. </li><li> Collocare il campione e vassoi di buffer nel sistema di campionamento detenzione e scattano in posizione. </li><li> Posizionare la cartuccia capillare nel blocco di interfaccia e, mentre premendo la barra di serraggio a entrambe le estremità, serrare le manopole. </li></ol></li></ol> 4. Metodi Instrument Set-up <ol><li> Creare il condizionamento, esecuzione e metodi strumentali arresto secondo i seguenti parametri e Tabella 1: Tensione, max: 30,0 kV; Corrente, max: 300.0 μA; Temperatura di cartuccia: 20.0 ° C; temperatura di conservazione del campione: 10,0 ° C; rivelatore UV condizioni iniziali: Lunghezza d&#39;onda: 214 nm; Velocità dati: 4 Hz; Filtro: Normal; Larghezza di picco (punti): 16-25; Segnale di assorbanza: Direct. NOTA: tasso di acquisizione dei dati può essere aumentata fino a 25 Hz per migliorare la copertura di zone di separazione strette. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="8"> Condizionata programma orario metodo </td></tr><tr><td> Tempo (min) </td><td> Evento </td><td> Valore </td><td> Durata </td><td> fiala di ingresso </td><td> fiala outlet </td><td> sommario </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> - </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 1.0 min </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> Inoltrare </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 2.0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Inoltrare </td> &lt;td&gt; Acqua </td></tr><tr><td> - </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 10.0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Inoltrare </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 0.00 </td><td> Indipendente - Tensione </td><td> 15,0 KV </td><td> 10.0 min </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0,17 rampa Min, polarità normale </td><td> Separato </td></tr><tr><td> 10.00 </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2758 mbar </td><td> 10.0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Inoltrare </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 20.01 </td><td> Aspetta </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> punte di risciacquo </td></tr><tr><td colspan="8"> L&#39;esecuzione del programma di tempo metodo </td></tr><tr><td> Tempo (min) </td><td> Evento </td><td> Valore </td><td> Durata </td><td> fiala di ingresso </td><td&gt; fiala di uscita </td><td> sommario </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> - </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 1.0 min </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> Avanti, In / Out inc vial 6 </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 2.0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Avanti, In / Out inc vial 6 </td><td> acqua </td></tr><tr><td> - </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 4,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Avanti, In / Out inc vial 6 </td><td> BGE </td></tr><tr><td> - </td><td> Iniettare - Pressione </td><td> 34 mbar </td><td> 20,0 sec </td><td> SI: A1 </td><td> BO: B1 </td><td> Override, Forward </td><td> iniezione del campione </td></tr><tr><td> - </td><td> Aspetta </td><td> - </td><td> 0,4 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> In / Out inc vial 6 </td><td> LAVAGGIO </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Indipendente - Tensione </td><td> 15,0 KV </td><td> 30.0 min </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0,17 rampa Min, polarità normale, In / Out inc vial 6 </td><td> Separazione del campione </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> Autozero </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.01 </td><td> smettere di dati </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.02 </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 2.0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Avanti, In / Out inc vial 6 </td><td> acqua </td></tr><tr><td> 32.03 </td><td> Aspetta </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> In / Out inc vial 6 </td><td> punte di risciacquo </td></tr><tr><td> 32.04 </td><td> Fine </td><td> -</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Fine </td></tr><tr><td colspan="8"> Shutdown programma orario metodo </td></tr><tr><td> Tempo (min) </td><td> Evento </td><td> Valore </td><td> Durata </td><td> fiala di ingresso </td><td> fiala outlet </td><td> sommario </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> - </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 1.0 min </td><td> BI: E6 </td><td> BO: E6 </td><td> Inoltrare </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 6.0 min </td><td> BI: F6 </td><td> BO: F6 </td><td> Inoltrare </td><td> acqua </td></tr><tr><td> - </td><td> Lamp - Spento </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Aspetta </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> punte di risciacquo </td></tr></tbody></table> Tabella 1: condizionamento, esecuzione e programmi orari di spegnimento. 5. acquisizione ed elaborazione dati <ol><li> Programmare il campionario. <ol><li> Programmare il capillare per condizionare utilizzando il metodo dello strumento condizionata. Quando si utilizza il capillare per la prima volta, il programma quattro ripetizioni; altrimenti programmare solo due ripetizioni del metodo di condizionamento. </li><li> Programmare i campioni da analizzare con il metodo dello strumento in esecuzione. </li><li> Programmare il capillare per la memorizzazione utilizzando il metodo dello strumento di arresto e ripetere la procedura indicata nella sezione 3.2.22. </li></ol></li><li> Simula. </li><li> Esportare i elettroferogrammi. </li><li> Calcolare il tempo di migrazione ed il contenuto percentuale di base, un principaleisoforme acidi nd utilizzando l&#39;integrazione linea dislivello del profilo dell&#39;elettroferogramma. </li></ol>

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The authors Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, N&#233;stor O. P&#233;rez, Luis F. Flores-Ortiz and Emilio Medina-Rivero are employees of Probiomed S.A. de C.V., which is developing, manufacturing and marketing biosimilar products. All authors are involved in the development of biosimilar products for Probiomed.

In questo tutorial, si evidenzia l&#39;importanza di pratiche corrette per lo svolgimento di analisi CZE di anticorpi monoclonali, al fine di aumentare la probabilità di avere successo. Tuttavia, quando CZE viene utilizzato su una base di routine, i problemi sorgono inevitabilmente 12. Per ottenere i migliori risultati, è importante seguire le note che sono stati inclusi in tutto il protocollo, in quanto vi aiuterà l&#39;analista a superare e risolvere i problemi passaggi diffi...

Gli anticorpi monoclonali (MAK, MAB) sono proteine bioterapeutici con crescente interesse a causa della loro capacità di agire contro diverse malattie croniche e degenerative 1. Come altre biomolecole, mAbs sono inclini a subire numerose modifiche fisico in tutte le fasi del ciclo di vita (cioè dal biosintesi al prodotto finale). Tali modifiche includono, ma non sono limitati a: deamidation, glicosilazione, ossidazione, ciclizzazione, isomerizzazione, aggregazione e taglio proteolitico 2. Quindi, sono necessarie tecniche analitiche in grado di risolvere isoforme intrinseche per monitorare mAbs eterogeneità e stabilità per stabilire specifiche di qualità. Elettroforesi capillare (CE) è una tecnologia di separazione ad elevate prestazioni realizzato OutInside di un tubo di silice fusa stretto (gamma micron) riempita con uno sfondo elettrolita (DTF). In seguito all&#39;applicazione di un campo elettrico (fino a 30.000 V), molecola caricas migrano verso l&#39;elettrodo con carica opposta (cioè la separazione elettro-driven). L&#39;uso di alte tensioni in CE permette analisi veloci e maggiore efficienza, che sono superiori a elettroforesi su gel classica. Zona di elettroforesi capillare (CZE) è una tecnica basata CE-abitualmente utilizzati nel settore biofarmaceutico per la valutazione della qualità del prodotto 3-9. A differenza di altri modi di CE (ad esempio, gel elettroforesi capillare, capillare focalizzazione isoelettrica) o metodi di cromatografia basati, CZE può essere condotta senza utilizzare denaturanti o interfacce fase solida, permettendo l&#39;analisi della eterogeneità dei mAbs vicino al loro stato nativo 10 . CZE separazione delle isoforme mAb verifica all&#39;interno di un capillare in silice fusa coperta con un polimero idrofilo (capillare neutro) e si basa sulla diversa mobilità elettroforetica, che è governato dalla carica, massa, dimensioni e forma (o volume idrodinamico) 11. frazioni mAb vengono rilevati quandosono mobilizzati e passano attraverso la finestra di rilevamento, che è rilevato da un rivelatore ultravioletto (UV) assorbanza a 214 nm 4. Il successo di questa tecnica analitica dipenderà la giusta attenzione ai dettagli, prima e durante l&#39;esperimento. Agire altrimenti aumenterà il costo e il tempo per condurre l&#39;analisi, in ultima analisi, che porta al fallimento costante e frustrazione. Qui vi presentiamo una guida passo-passo per condurre un&#39;analisi di successo di mAb eterogeneità CZE attraverso la spiegazione dettagliata della preparazione di soluzioni e campioni, la preparazione del sistema CE, i metodi dello strumento istituito, l&#39;acquisizione dei dati, e l&#39;elaborazione. Ai fini di questa esercitazione, un anti-fattore di necrosi tumorale alfa ricombinante completamente umano (anti-TNF) mAb è usato come proteina modello; Tuttavia, questo protocollo può essere facilmente adattato per l&#39;analisi di altre proteine ​​considerando brevi modifiche. UNdditionally, diverse raccomandazioni per mitigare sono proposti potenziali problemi. Il lettore è incoraggiato a seguire rigorosamente il protocollo proposto, come la probabilità di successo aumenteranno.

<table><tbody><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Tecsiquim</td><td>AT0035-7</td><td></td></tr><tr><td>ACS grade hydrochloric acid</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-05</td><td></td></tr><tr><td>Histamine dihydrochloride</td><td>Fluka</td><td>53300</td><td></td></tr><tr><td>(Hydroxypropyl) methyl cellulose&amp;nbsp;</td><td>Fluka</td><td>09963</td><td></td></tr><tr><td>Lithium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>6-Aminocaproic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,&amp;nbsp; pH 8</td><td>Beckman Coulter</td><td>477427</td><td></td></tr><tr><td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66528</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Neutral capillary&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>477441</td><td></td></tr><tr><td>Vial, Micro, 200 &amp;micro;l</td><td>Beckman Coulter</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>Universal Vial Caps</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62250</td><td></td></tr><tr><td>Universal Vials</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62251</td><td></td></tr><tr><td>Cable, Optics, UV/Vis</td><td>Beckman Coulter</td><td>144093</td><td></td></tr><tr><td>UV/Vis Detector Module</td><td>Beckman Coulter</td><td>144733</td><td></td></tr><tr><td>Cartridge Assembly Kit, Blank</td><td>Beckman Coulter</td><td>144738</td><td></td></tr></tbody></table>

capillary electrophoresis separation of monoclonal antibody isoforms using a neutral capillary

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.

La Figura 2 mostra il profilo corrente elettrica tipica di 200 mM EACA, 30 mM acetato di litio, pH 4.8 BGE con il campione anti-TNFa mAb diluito con tampone Tris (50 mM, pH 8,0). Come si può osservare, la corrente è stabile durante l&#39;analisi e può oscillare tra i valori di 30 a 35 μA. La Figura 3 mostra l&#39;elettroferogramma CZE di un campione in bianco dove il picco rilevato corrisponde allo standard interno istamina. Si prevede di istamina pe...

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Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Elettroforesi capillare Separazione di anticorpo monoclonale Isoforme Utilizzando un capillare Neutral

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.6K Views.  Unidad de Investigación y Desarrollo, Probiomed S.A. de C.V.. Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Video: Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides an alternative strategy, capillary isoelectric focusing (cIEF), with many advantages compared to conventional immunoblotting. This is an antibody-based, automated, rapid, and quantitative method in which a complete western blotting procedure takes place inside an ultrathin capillary. This technique does not require a gel to transfer to a membrane, stripping of blots, or x-ray films, which are typically required for conventional immunoblotting. Here, proteins are separated according to their charge (isoelectric point; pI), using less than a microliter (400 nL) of total protein lysate. After electrophoresis, proteins are immobilized onto the capillary walls by ultraviolet light treatment, followed by primary and secondary (horseradish peroxidase (HRP) conjugated) antibody incubation, whose binding is detected through enhanced chemiluminescence (ECL), generating a light signal that can be captured and recorded by a charge-coupled device (CCD) camera. The digital image can be analyzed and quantified (peak area) using software. This high throughput procedure can handle 96 samples at a time; is highly sensitive, with protein detection in the picogram range; and produces highly reproducible results because of automation. All of these aspects are extremely valuable when the quantity of samples (e.g., tissue samples and biopsies) is a limiting factor. The technique has wider applications as well, including screening of drugs or antibodies, biomarker discovery, and diagnostic purposes.

Capillary isoelectric focusing is an antibody-based, ultrasensitive, high throughput technique, enabling detailed characterization of proteins and their isoforms from extremely small biological samples. The following describes a protocol for detection and quantification of specific proteins and their isoforms in an automated and robotized manner.

Rilevamento altamente sensibile e quantitativo delle proteine e loro isoforme dal metodo di messa a fuoco isoelettrica capillare

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Ricerca

Biochimica

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using affinity chromatography.&#160;While affinity chromatography using porous protein A agarose beads packed in columns is arguably the most common method of laboratory scale isolation of antibodies and recombinant proteins expressing Fc fragments of IgG, it can be a time consuming and expensive process.&#160;Time and financial constraints are especially daunting in small basic science labs that must recover hundreds of micrograms to milligram quantities of protein from dilute solutions, yet lack access to high pressure liquid delivery systems and/or personnel with expertise in bioseparations. Moreover, product quantification and characterization may also excessively lengthen processing time over several workdays and inflate expenses (consumables, wages, etc.).&#160;Therefore, a fast, inexpensive, yet effective protocol is needed for laboratory scale isolation and characterization of antibodies and other proteins possessing an Fc fragment.&#160;To this end, we have devised a protocol that can be completed by limited-experience technical staff in less than 9 hr (roughly one workday) and as quickly as 4 hr, as opposed to traditional methods that demand 20+ work hours. Most required equipment is readily available in standard biomedical science, biochemistry, and (bio)chemical engineering labs, and all reagents are commercially available.&#160;To demonstrate this protocol, representative results are presented in which chimeric&#160;murine galectin-1 fused to human Fc (Gal-1hFc) from cell culture supernatant was isolated using a protein A membrane adsorber.&#160;Purified Gal-1hFc was quantified using an expedited Western blotting analysis procedure and characterized using flow cytometry. The streamlined workflow can be modified for other Fc-expressing proteins, such as antibodies, and/or altered to incorporate alternative quantification and characterization methods.

Compared with traditional affinity chromatography using protein A agarose bead-packed columns, protein A membrane adsorbers can significantly speed laboratory-scale isolation of antibodies and other Fc fragment-expressing proteins.&#160;Appropriate analysis and quantification methods can further accelerate protein processing, allowing isolation/characterization to be completed in one workday, instead of 20+ work hours.

Isolamento e caratterizzazione delle proteine chimeriche che esprimono fc umano utilizzando proteine A adsorbenti di membrana e un flusso di lavoro semplificato

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

Bioingegneria

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Immunologia e infezioni

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. However, similar to other antibody-based protein assays, optimization of capillary-based immunoassay parameters, such as protein concentration, antibody dilution, and exposure time is an important prerequisite to the generation of meaningful and reliable data. Measurements must fall within the linear range of the assay where changes in signal are directly proportional to changes in lysate concentration. The process of choosing appropriate lysate concentrations, antibody dilutions, and exposure times in the human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B, is demonstrated here. Assay linearity is shown over a range of whole cell extract protein concentrations with p53 and &#945;-tubulin antibodies. An example of signal burnout is seen at the highest concentrations with long exposure times, and an &#945;-tubulin antibody dilution curve is shown demonstrating saturation. In addition, example experimental results are reported for doxorubicin-treated cells using optimized parameters.

A capillary-based immunoassay using a commercial platform to measure target proteins from total protein preparations is demonstrated. In addition, assay parameters of exposure time, protein concentration, and antibody dilution are optimized for a cell culture model system.

Procedure e strategie di ottimizzazione chiave per un metodo automatizzato Immunoassay basati su elettroforetica capillare

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

Biologia

Capillary Electrophoresis (CE)

Source: Laboratory of Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Capillary electrophoresis (CE) is a separation technique that separates molecules in an electric field according to size and charge. CE is performed in a small glass tube called a capillary that is filled with an electrolyte solution. Analytes are separated due to differences in electrophoretic mobility, which varies with charge, solvent viscosity, and size. Traditional electrophoresis in gels is limited in the amount of voltage that can be applied because Joule heating effects will ruin the gel and the separation. Capillaries have a large surface area-to-volume ratio and thus dissipate heat better. Therefore, the voltages applied for a capillary electrophoresis experiment are quite large, often 10,000&#8211;20,000 V.
Capillary electrophoresis is useful for high-performance separations. Compared to liquid chromatography, CE separations are often faster and more efficient. However, capillary electrophoresis works best to separate charged molecules, which is not a limitation of liquid chromatography. CE has a greater peak capacity than high-performance liquid chromatography (HPLC), meaning the separations are more efficient and more peaks can be detected. The instrumentation can be very simple. However, HPLC is more versatile and many stationary and mobile phases have been developed for different types of molecules.

Capillary Electrophoresis: Principle, Procedure and Applications

Elettroforesi capillare

Source: Laboratory of Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Capillary electrophoresis (CE) is a separation technique that separates molecules in an ...

Didattica

JoVE Science Education

Chimica

Chimica analitica

An Affinity Chromatography Technique for the Purification of Monoclonal Antibodies

Source: Elgundi, Z., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55153">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique for purifying monoclonal antibodies from the culture supernatant obtained from an antibody-producing cell culture. The process involves using a matrix of crosslinked agarose beads with conjugated Protein A, which immobilizes the antibodies in the supernatant on the beads, allowing for effective separation from contaminants. By applying an elution buffer with low pH, the protein A-antibody interaction is loosened, facilitating the collection of antibody-containing fractions.

Una tecnica di cromatografia di affinità per la purificazione di anticorpi monoclonali

1. Antibody Purification by Affinity Chromatography Using an Automated Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System
NOTE: The following procedure can ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Production and Purification

DFE-Based Affinity Chromatography: A Technique for Purification of 2F5 Monoclonal Antibodies from a Crude Sample Using High Ionic Strength-Based Elution Conditions

Source: Kn&#246;dler, M. et al., <a href="https://www.jove.com/v/59933">Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes an affinity chromatography technique for purifying 2F5 monoclonal antibodies using the DsRed-2F5-Epitope or DFE ligands. The purified 2F5 monoclonal antibodies are essential drugs in immunotherapy.

Cromatografia di affinità basata su DFE: una tecnica per la purificazione di anticorpi monoclonali 2F5 da un campione grezzo utilizzando condizioni di eluizione basate su elevata forza ionica

Source: Kn&#246;dler, M. et al., Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case ...

Biological Techniques

Chromatography Techniques

A Capillary Electrophoresis Immunoassay for Protein Biomarker Detection

Source: Sage, J. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60638">Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates a capillary electrophoresis immunoassay protocol for detecting a protein biomarker associated with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human blood platelets. Confirmation of the presence of the ALS biomarker protein is achieved through size-based separation of the platelet proteins followed by chemiluminescent detection.

Un test immunologico per elettroforesi capillare per il rilevamento di biomarcatori proteici

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of buffers and ...

Characterization and Functional Analysis

Electrophoresis: Overview

Electrophoresis is a powerful analytical separation technique that relies on the differential migration of charged species when subjected to an electric field. The core strength of electrophoresis lies in its ability to separate high-molecular-weight species in complex mixtures. It has found widespread use in biochemistry, molecular biology, and analytical chemistry, allowing the separation of compounds like amino acids, nucleotides, carbohydrates, and proteins with excellent resolution.
There are two main formats for electrophoretic separations: slab electrophoresis and capillary electrophoresis. Slab Electrophoresis uses a gel matrix, such as agarose or polyacrylamide, which acts as a sieve, allowing molecules to move through the pores. Capillary electrophoresis employs a narrow capillary tube filled with a buffer solution, providing high-resolution separation with rapid analysis time and minimal sample requirements. Although slab electrophoresis is widely used in biochemistry and biology to separate high-molecular-mass species, capillary electrophoresis is a more recent development with several advantages.
Capillary electrophoresis is a separation technique used to analyze complex mixtures of analytes based on their differential migration rates in an applied electric field. In this method, a sample is injected into a narrow capillary tube filled with a buffered solution, and an electric field is applied to facilitate separation. The migration rate of the analyte depends on its charge and size. The smaller, more highly charged ions migrate faster than the larger, less charged ones. In capillary electrophoresis, the migration of sample components is influenced by two types of mobility: electrophoretic mobility and electroosmotic mobility. Electrophoretic mobility is the solute&#39;s response to the applied electric field, with cations moving toward the negatively charged cathode, anions moving toward the positively charged anode, and neutral species remaining stationary. Electroosmotic mobility occurs when the buffer solution moves through the capillary in response to the electric field, typically toward the cathode.
Under normal conditions, capillary electrophoresis separates cations first, followed by neutral species, and finally, the anions. This separation is based on their respective electrophoretic mobilities and electroosmotic flow velocities. Notably, all separated species are eluted from the same end of the capillary, allowing their detection using quantitative detectors. The detector signals produce an electropherogram resembling a chromatogram but feature narrower peaks.
Capillary electrophoresis is a powerful tool for qualitative and quantitative analysis of complex mixtures. It provides information similar to that obtained from other separation techniques, such as gas chromatography (GC) or high-performance liquid chromatography (HPLC).

Elettroforesi: Panoramica

Electrophoresis is a powerful analytical separation technique that relies on the differential migration of charged species when subjected to an electric ...