The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Ab&#250;ndez, Jes&#250;s Padilla-Calder&#243;n, Jaime M. Uribe-Wiechers, N&#233;stor O. P&#233;rez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.

1. Herstellung der Lösungen <ol><li> Bereiten Sie die BGE - Lösung. <ol><li> Herstellung von 100 ml einer Lösung, bestehend aus 0,05% (m / v) Hydroxypropyl Methylcellulose (HPMC), 200 mM ε-Amino-n-Capronsäure (EACA) und 30 mM Lithiumacetat. HINWEIS: HPMC ein viskoelastisches Polymer ist, gießen Sie das Pulver in ein Becherglas, fügen Sie 80 ml Wasser und schließlich den Rührstab hinzufügen. Weiter zu den übrigen Reagenzien, wie sie normalerweise die Zugabe. Schutzbrille tragen beim Umgang mit Lithium-Acetat, wie es zu Augenreizungen führen kann. </li><li> Passen Sie auf einen pH-Wert 4,8 ± 0,1 mit 50% (v / v) Essigsäure. Lassen Sie die Lösung für 5 min zur Stabilisierung und ggf. korrigieren. </li><li> Fügen Sie Wasser, um bis zu einem endgültigen Volumen von 100 ml in Messkolben. </li><li> Filter durch eine hydrophile Membran mit einer 0,2 &amp; mgr; m Porengröße. </li><li> Lagerung bei 2-8 ° C für bis zu 7 Tage. </li></ol></li><li> Bereiten Sie den internen Standard. <ol><li> Bereiten Sie 1 mleiner Lösung von 1% (m / v) Histamin besteht. </li><li> Filter durch eine hydrophile Membran mit einer 0,2 &amp; mgr; m Porengröße. </li><li> Lagerung bei 2-8 ° C für bis zu 1 Tag. </li></ol></li></ol> 2. Probenvorbereitung <ol><li> Bereiten 180 ul mAb Probe mit Tris-Puffer verdünnt (50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan, pH 8,0) auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml. </li><li> Geben Sie 20 &amp; mgr; l von 1% (m / v) Histamin. </li><li> Mischen und Zentrifugieren bei 1000 × g für 5 Sek. </li><li> Legen Sie ein Mikro Fläschchen in einem Universal-Fläschchen. </li><li> Übertragen Sie die Probe in die Mikro Fläschchen und die Kappe des Universal Fläschchen. Dispense die Probe nach oben, um alle Blasen zu vermeiden einzuführen. </li><li> Lagerung bei 2-8 ° C für bis zu 1 Tag. </li><li> Legen Sie die Universal-Fläschchen (mit Mikrofläschchen, die Probenlösung enthält) in der Probeneinlassfach. </li></ol> 3. Herstellung von CE-System. <ol><li> CE Systemreinigung. HINWEIS: Verhalten thist Verfahren mindestens einmal pro Woche, um elektrischen Strom Leckage aus Ansammlung von Staub und Schmutz abgeleitet zu vermeiden. Jedoch abhängig von der Anwendung (zB Verwendung eines BGE mit erhöhter Viskosität oder mit hoher Salzkonzentration, Proben mit erhöhter Viskosität) Elektroden und Öffnungshebel erfordern häufig gereinigt mehr zu Kreuzkontamination und Probenverschleppung zu vermeiden. <ol><li> Schalten Sie den Netzschalter des CE-Gerät aus und öffnen Sie die vordere Tür. </li><li> Reinigen Sie die Oberfläche der Probe Abdeckung, Probenhaltesystem (Probe und Puffer Tabletts), Patronenabdeckung, Klemmleiste, Schnittstellenblock und Elektroden mit einem mit Wasser angefeuchteten Vlies wischen. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem Ethanol angefeuchteten wischen und trocken vor dem Gebrauch. </li><li> Spülen Sie die Öffnungshebel gründlich mit Wasser. Reinigen Sie die Oberfläche mit einem Vlies wischen. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem Ethanol angefeuchteten wischen und trocken vor der Installation. </li><li> Reinigen Sie die beiden Enden des Glasfaserkabels vorsichtigly mit einem mit Wasser angefeuchteten Mikrofasertuch. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem Ethanol angefeuchteten Tuch. </li></ol></li><li> Kassetteneinheit. <ol><li> Nehmen Sie eine neue neutrale Kapillare (50 &amp; mgr; m Innendurchmesser) aus der Verpackung. </li><li> Band nach unten ein Ende der Kapillare Schutzschlauch an der Werkbank. Abrollen, begradigen und die Kapillare aus dem Schlauch ziehen. </li><li> Kleben Sie ein Stück Klebeband oder Papier an der Werkbank und fügen Messmarken wie folgt: Länge zum Detektor (30 cm), Kapillar - Fenster (0,2 cm) und einer Länge zum Auslaufende (10 cm) (dh 40,2 cm Gesamtlänge, 30,0 cm effektive Länge). </li><li> Richten Sie die Kapillare Fenster auf die 0,2 cm Messmarke im Referenzpapier. Befestigen Sie die Kapillare mit Band und markieren Sie die Kapillare endet 2 mm außerhalb der Messmarken. </li><li> Schneiden Sie die Schutzkappe an der Kapillareinlass Ende (das Ende der am weitesten vom Fenster) in einer einzigen geraden Bewegung den Flush Rand des Abspaltungs Stein verwenden.<ol><li> Tauchen Sie die Kapillare Ende in einem verschlossenen Universal-Fläschchen mit Wasser gefüllt, um dauerhafte Schäden an der kapillaren Innenbeschichtung zu vermeiden. Wiederholen Sie jedes Mal, dieses Verfahren das kapillare Ende für mehr als 1 min der Umgebung ausgesetzt ist. </li></ol></li><li> Legen Sie die Kapillareinlass Ende in die Ausgangsseite der Patrone. </li><li> Schieben und die Kapillare durch die Patrone nach Bedarf ziehen, bis die Kapillare Fenster in die Kassette Fenster zentriert ist. </li><li> Legen Sie die Blende Stecker (100 &amp; mgr; m × 200 &amp; mgr; m) in das Kassettenfenster. HINWEIS: Bestätigen, dass weißes Licht durch das Fenster, wenn zu einer weißen Lichtquelle ausgesetzt wird. Wenn das Licht, das ein bräunliches Aussehen hat durchläuft, ggf. einstellen. </li><li> Legen Sie die Kapillare in die vorgeformten Kühlmittelrohrleitung für insgesamt Kapillarlänge von 40,2 cm (mit vorinstallierter Schlauchmutter, Zwinge und O-Ring an beiden Enden in dieser Reihenfolge). </li><li> Schieben Sie die Kapillare durch die coolant Schlauch wie nötig, bis die Kapillare an der anderen Seite des Schlauchs erscheint. </li><li> Führen Sie das Ende des Kühlmittelrohrleitung in die Ausgangsseite der Patrone und ziehen Sie die Schlauchmutter. </li><li> Legen Sie die Kapillareinlass Ende in die Einlassseite der Patrone. </li><li> Hub und die Kapillare durch die Patrone nach Bedarf ziehen, bis die Kapillare an der Einlassseite der Kassette angezeigt wird. </li><li> Führen Sie das Ende des Kühlmittelrohrleitung in die Einlassseite der Patrone und ziehen Sie die Schlauchmutter. </li><li> Schneiden Sie die Schutzkappe an der Kapillarauslass Ende (das Ende nächsten aus dem Fenster) in einer einzigen geraden Bewegung den Flush Rand des Abspaltungs Stein verwenden. </li><li> Legen Sie die Dichtung-Halteklammern über die Kapillare Enden und drücken Sie in die richtige Position zu schnappen. Sichtprüfung der Kapillare endet. Wenn sie nicht einmal sind, wiederholen Sie den Vorgang. </li><li> Legen Sie die Kapillare Länge Vorlage auf dem Rand der Werkbank. </li><li> Legen Sie die Patrone nach unten against die Kapillare Länge Schablone und richten Sie die Kapillare mit den Referenzlinien auf der Vorlage endet. Wenn die Kapillare Messmarken (siehe 3.2.4) nicht mit den Referenzlinien ausrichten, ggf. einstellen. </li><li> Halten Sie die Kapillare gegen die kapillare Länge Schablone und schneiden beide Enden der Kapillare auf der Vorlage die flush Kante des Abspalten Stein 2 mm unterhalb der Referenzlinien verwendet wird. </li><li> Sichtprüfung der Kapillare mit einem Vergrößerungsglas endet. Wenn Kapillarenden nicht glatt sind, polieren sie das weiche Gesicht des Abspaltungs Stein verwenden. </li><li> Legen Sie die Öffnung O-Ring in die Öffnung Zündkerzenloch den O-Ring Einsatzwerkzeug verwendet wird. </li><li> Installieren Sie mit einer Kappe bedeckt Universal gefüllt Fläschchen mit Wasser in das Kassettengehäuse und Platz Patrone in Fall sofort mit Kapillar-Enden in Ampullen eingesetzt. Für Kurz- und Langzeitlagerung halten bei 2-8 ° C. </li></ol></li><li> Herstellung von Puffer Tabletts. <ol><li> Füllen Sie und legen Sie mit einer Kappe bedeckt universal Phiolen in dem Puffer Eintritts- und Austrittswannen (Abbildung 1). Wiederholen Sie Fläschchen Positionen in den Spuren 2, 3, 4 und 5 gemäß der Anzahl der zu analysierenden Proben, eine Spur für alle sechs Probeninjektionen platzieren. HINWEIS: Vermeiden Sie die Fläschchen-Kappen, um Frittstrom Auslaufen zu verhindern. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig1.jpg" /> Abbildung 1: Lage und den Füllstand des Universalfläschchen in den Puffer Einlass und Auslass Tabletts. Füllstände: 1/1 = 1400 &amp; mgr; l, 3/4 = 1300 &amp; mgr; l und 1/2 = 1000 &amp; mgr; l. Abkürzungen: W = Wasser, HCl = 0,1 M Salzsäure. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="4"><li> CE Systemkomponenten Montage. <ol><li> Installieren Sie den UV-Detektor. </li><li> Installieren Sie die Öffnungshebelindem sie in den Schnittstellenblock nach oben drücken. </li><li> Installieren Sie das Glasfaserkabel. Legen Sie die entsprechende Ende mit der Klemmleiste und, während beide Enden halten, drehen im Uhrzeigersinn. Schließen Sie das andere Ende mit dem UV-Detektor. HINWEIS: Behandeln Sie das Glasfaserkabel mit Sorgfalt während dieses Verfahrens, da Biegen seiner Fraktur verursachen könnte. </li><li> Platz Probe und Puffer Tabletts in den Probenhaltesystem und einrasten. </li><li> Legen Sie die Kapillarpatrone in den Schnittstellenblock und, während Sie die Klemmleiste an beiden Enden, ziehen Sie die Knöpfe. </li></ol></li></ol> 4. Instrument Methoden Set-up <ol><li> Erstellen Sie die Anlage, Laufen und Shutdown-Instrument Methoden nach mit den folgenden Parametern und Tabelle 1: Spannung, max: 30,0 kV; Strom, max: 300,0 uA; Cartridge Temperatur: 20,0 ° C; Probenlagertemperatur: 10,0 ° C; UV-Detektor Anfangsbedingungen: Wellenlänge: 214 nm; Datenrate: 4 Hz; Filter: Normal; Peakbreite (Punkte): 16-25; Absorptions-Signal: Direct. HINWEIS: Datenerfassungsrate erhöht werden kann, bis zu 25 Hz, um die Abdeckung der schmalen Trennzonen zu verbessern. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="8"> Konditionierungsverfahren Zeitprogramm </td></tr><tr><td> Zeit (min) </td><td> Event </td><td> Wert </td><td> Dauer </td><td> Inlet Phiole </td><td> Outlet Phiole </td><td> Zusammenfassung </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 1,0 min </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> Vorwärts </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 2,0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Vorwärts </td> &lt;td&gt; Wasser </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 10,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Vorwärts </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 0.00 </td><td> Separate - Spannung </td><td> 15,0 KV </td><td> 10,0 min </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0,17 Min Rampe, normale Polarität </td><td> Getrennte </td></tr><tr><td> 10.00 </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2758 mbar </td><td> 10,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Vorwärts </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 20,01 </td><td> Warte ab </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> Rinse-Tipps </td></tr><tr><td colspan="8"> Laufende Verfahren Zeitprogramm </td></tr><tr><td> Zeit (min) </td><td> Event </td><td> Wert </td><td> Dauer </td><td> Inlet Phiole </td><td&gt; Outlet Phiole </td><td> Zusammenfassung </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 1,0 min </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> Nach vorne, In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 2,0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Nach vorne, In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> Wasser </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 4,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Nach vorne, In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> BGE </td></tr><tr><td> - </td><td> Spritzen - Druck </td><td> 34 mbar </td><td> 20,0 sec </td><td> SI: A1 </td><td> BO: B1 </td><td> Außer Kraft setzen, nach vorne </td><td> Probeninjektion </td></tr><tr><td> - </td><td> Warte ab </td><td> - </td><td> 0,4 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> Wash-Tipps </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Separate - Spannung </td><td> 15,0 KV </td><td> 30,0 min </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0,17 Min Rampe, normale Polarität, In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> Probentrenn </td></tr><tr><td> 0,5 </td><td> Auto Zero </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30,01 </td><td> Stopp-Daten </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30,02 </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 2,0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Nach vorne, In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> Wasser </td></tr><tr><td> 32,03 </td><td> Warte ab </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> Rinse-Tipps </td></tr><tr><td> 32,04 </td><td> Ende </td><td> -</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Ende </td></tr><tr><td colspan="8"> Shutdown-Methode Zeitprogramm </td></tr><tr><td> Zeit (min) </td><td> Event </td><td> Wert </td><td> Dauer </td><td> Inlet Phiole </td><td> Outlet Phiole </td><td> Zusammenfassung </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 1,0 min </td><td> BI: E6 </td><td> BO: E6 </td><td> Vorwärts </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 6,0 min </td><td> BI: F6 </td><td> BO: F6 </td><td> Vorwärts </td><td> Wasser </td></tr><tr><td> - </td><td> Lampe - Aus </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Warte ab </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> Rinse-Tipps </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Konditionierung, Laufen und Shutdown - Zeit - Programme. 5. Datenerfassung und -verarbeitung <ol><li> Programmieren Sie die Probe eingestellt. <ol><li> Programmieren Sie die Kapillare für die Konditionierung der Konditionierung Instrument Methode. Wenn die Kapillare zum ersten Mal verwendet wird, Programm vier Wiederholungen; programmieren sonst nur zwei Wiederholungen des Konditionierungsmethode. </li><li> Programm, um die Proben werden analysiert, um die ablaufenden Instrumenten-Methode. </li><li> Programmieren Sie die Kapillare zur Speicherung der Shutdown Instrument Methode und wiederholen Sie den in Abschnitt 3.2.22 Verfahren. </li></ol></li><li> Führen Sie das Experiment. </li><li> Exportieren Sie die Elektropherogramme. </li><li> Berechnen Sie die Migrationszeit und der Anteil an Grund-, Haupt-and sauren Isoformen vertikalen Falllinie Integration des Elektropherogramm-Profil. </li></ol>

<ol>
	<li>Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advent+of+monoclonal+antibodies+in+the+treatment+of+chronic+autoimmune+diseases.">The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases.</a> Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).</li><li>Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+monoclonal+antibodies.">Heterogeneity of monoclonal antibodies.</a> J. Pharm. Sci. 97 (7), 2426-2447 (2008).</li><li>Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+analysis+of+therapeutic+proteins+by+capillary+and+microchip+electrophoresis.">Recent advances in the analysis of therapeutic proteins by capillary and microchip electrophoresis.</a> Anal. Methods. 6 (15), 5427-5449 (2014).</li><li>Fekete, S., Guillarme, D., Sandra, P., Sandra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic,+Electrophoretic,+and+Mass+Spectrometric+Methods+for+the+Analytical+Characterization+of+Protein+Biopharmaceuticals.">Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals.</a> Anal. Chem. 88 (1), 480-507 (2016).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+identity,+charge+variants,+and+disulfide+isomers+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+an+uncoated+capillary+column.">Analysis of identity, charge variants, and disulfide isomers of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in an uncoated capillary column.</a> Anal. Chem. 82 (8), 3222-3230 (2010).</li><li>He, Y., Isele, C., Hu, W., Ruesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+charge+variants+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+dynamically+coated+fused-silica+capillary.">Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary.</a> J. Sep. Sci. 34 (5), 548-555 (2011).</li><li>Zhao, S. S., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+capillary+electrophoresis+in+characterizing+recombinant+protein+therapeutics.">Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics.</a> Electrophoresis. 35 (1), 96-108 (2014).</li><li>&#352;t&#283;p&#225;nov&#225;, S., Ka&#353;i&#269;ka, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+impurities+and+counterions+of+pharmaceuticals+by+capillary+electromigration+methods.">Determination of impurities and counterions of pharmaceuticals by capillary electromigration methods.</a> J. Sep. Sci. 37 (15), 2039-2055 (2014).</li><li>&#352;t&#283;p&#225;nov&#225;, S., Ka&#353;i&#269;ka, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+capillary+electromigration+methods+to+separation+and+analysis+of+proteins.">Recent applications of capillary electromigration methods to separation and analysis of proteins.</a> Anal. Chim. Acta. 933, 23-42 (2016).</li><li>Espinosa-de la Garza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+recombinant+monoclonal+antibodies+by+capillary+zone+electrophoresis.">Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis.</a> Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).</li><li>Staub, A., Guillarme, D., Schappler, J., Veuthey, J. 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Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation and Applications. , (1996).</li><li>Ma, S., Nashabeh, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+therapeutics+by+capillary+electrophoresis.">Analysis of protein therapeutics by capillary electrophoresis.</a> Chromatographia. 53 (5), 75-89 (2001).</li><li>Jaccoulet, E., Smadja, C., Prognon, P., Taverna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis+for+rapid+identification+of+monoclonal+antibodies+for+routine+application+in+hospital.">Capillary electrophoresis for rapid identification of monoclonal antibodies for routine application in hospital.</a> Electrophoresis. 36 (17), 2050-2056 (2015).</li></ol>

The authors Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, N&#233;stor O. P&#233;rez, Luis F. Flores-Ortiz and Emilio Medina-Rivero are employees of Probiomed S.A. de C.V., which is developing, manufacturing and marketing biosimilar products. All authors are involved in the development of biosimilar products for Probiomed.

In diesem Tutorial zeigen wir die Bedeutung der richtigen Praktiken bei der Durchführung von CZE von mAb analysiert, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, um erfolgreich zu sein. Wenn jedoch CZE auf einer Routinebasis verwendet wird, Probleme entstehen zwangsläufig 12. Für die besten Ergebnisse ist es wichtig, die Hinweise zu folgen, die das ganze Protokoll aufgenommen wurden, da sie den Analytiker schwierige Schritte zu überwinden und zu beheben helfen. Eine wichtige Überle...

Monoklonale Antikörper (mAb) sind Biotherapeutikum Proteine mit steigendem Interesse aufgrund ihrer Handlungsfähigkeit gegen mehrere chronische und degenerative Krankheiten 1. Wie andere Biomoleküle sind mAbs anfällig mehrere physikalisch - chemische Modifikationen in allen Phasen ihres Lebenszyklus zu unterziehen (dh von Biosynthese zum Endprodukt). Solche Modifikationen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf : Desamidierung, Glykosylierung, Oxidation, Cyclisierung, Isomerisierung, Aggregation und proteolytische Spaltung 2. Daher analytische Techniken der Lage intrinsische Isoformen zu lösen sind erforderlich mAbs Heterogenität und Stabilität, um zu überwachen, um Qualitätsanforderungen herzustellen. Kapillarelektrophorese (CE) ist ein Hochleistungstrenntechnik outinside eines schmalen Quarzglasröhre (&amp; mgr; m-Bereich) gefüllt durch mit einem Hintergrundelektrolyten (BGE). Bei Anlegen eines elektrischen Feldes (bis zu 30.000 V), geladenes Moleküls wandern in Richtung der Elektrode mit entgegengesetzter Ladung (dh elektrogetriebene Trennung). Die Verwendung von hohen Spannungen in CE ermöglicht schnelle Analysen und erhöhte Effizienz, die der Elektrophorese klassischen Gel überlegen sind. Die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) ist eine CE-basierte Technik routinemäßig in der biopharmazeutischen Industrie für die Produktqualität Beurteilung verwendet 3-9. Im Gegensatz zu anderen Formen der CE (zB Kapillar - Gel - Elektrophorese, Kapillar - isoelektrische Fokussierung) oder Chromatographie-basierte Methoden können CZE ohne Verwendung von Denaturierungsmitteln oder Festphasen - Schnittstellen durchgeführt werden, so dass die Analyse der inhärenten Heterogenität der mAbs nahe an ihrem nativen Zustand 10 . CZE Trennung von mAb - Isoformen auftritt innerhalb einer Fused-Silica - Kapillare mit einem hydrophilen Polymer (neutral Kapillare) abgedeckt und auf der Basis ihrer unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilität, die durch Ladung, Masse, Größe und Form (oder hydrodynamischen Volumen) 11 ausgeschlossen ist. mAb-Einheiten detektiert, wennsie mobilisiert und durch das Erfassungsfenster, das 4 durch ein Ultraviolett (UV) Absorptionsdetektor bei 214 nm gemessen wird. Die erfolgreiche Umsetzung dieser Analysetechnik wird vor und während des Experiments zu Details über angemessene Aufmerksamkeit abhängen. Acting sonst wird die Kosten und die Zeit erhöhen, um die Analyse durchzuführen, was letztlich zu konstanten Versagen und Frustration führen. Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, eine erfolgreiche Analyse von mAb Heterogenität durch CZE durch die detaillierte Erläuterung der Herstellung von Lösungen und Proben durchzuführen, die Herstellung von CE-System, das Instrument Verfahren einzurichten, die Datenerfassung und das Verarbeiten. Für die Zwecke dieses Tutorial, eine rekombinante vollständig humanen Anti-Tumor-Nekrose-Faktor alpha (anti-TNF) mAb als Proteinmodell verwendet wird; jedoch kann dieses Protokoll leicht für die Analyse von anderen Proteinen unter Berücksichtigung kurze Änderungen angepasst werden. EINußerdem, mehrere Empfehlungen zu mildern sind mögliche Probleme vorgeschlagen. Der Leser wird aufgefordert, zu streng, die vorgeschlagene Protokoll folgen, da die Wahrscheinlichkeit erhöhen, um erfolgreich zu sein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Tecsiquim</td>
			<td>AT0035-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACS grade hydrochloric acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>53300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Hydroxypropyl) methyl cellulose&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>09963</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>517992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,&#160; pH 8</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>477427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A66528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCAP Neutral capillary&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>477441</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, Micro, 200 &#181;l</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>144709</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Vial Caps</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A62250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Vials</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A62251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable, Optics, UV/Vis</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>144093</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis Detector Module</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>144733</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridge Assembly Kit, Blank</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>144738</td>
		</tr>
	</tbody>
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capillary electrophoresis separation of monoclonal antibody isoforms using a neutral capillary

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.

Figur 2 zeigt den typischen elektrischen Stromprofil eines 200 mM EACA, 30 mM Lithiumacetat, pH 4,8 BGE mit anti-TNF &amp; agr; mAb Probe mit Tris - Puffer (50 mM, pH 8,0). Wie beobachtet werden kann, ist der Strom in der gesamten Analyse stabil und zwischen Werten von 30 bis 35 &amp; mgr; A oszillieren kann. Abbildung 3 zeigt die CZE Elektropherogramm einer Blindprobe , wo der detektierte Peak, der dem Histamin interner Standard entspricht. Es ist für ...

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Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Kapillarelektrophorese Trennung des monoklonalen Antikörpers Isoformen eine Neutral Kapillare

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

capillary-electrophoresis-separation-monoclonal-antibody-isoforms

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.6K Aufrufe.  Unidad de Investigación y Desarrollo, Probiomed S.A. de C.V.. Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Serie: Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

Sheathless Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie zur metabolischen Profils von biologischen Proben

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Forschung

Biochemie

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

Charakterisierung von Multi-Untereinheit Proteinkomplexe der Menschen MxA Verwendung von nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel-Elektrophorese

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

Labormaßstab Herstellung und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the use of four routinely used biosensor platforms in our laboratory to evaluate the binding affinity and kinetics of ten high-affinity monoclonal antibodies (mAbs) against human proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9). While both Biacore T100 and ProteOn XPR36 are derived from the well-established Surface Plasmon Resonance (SPR) technology, the former has four flow cells connected by serial flow configuration, whereas the latter presents 36 reaction spots in parallel through an improvised 6 x 6 crisscross microfluidic channel configuration. The IBIS MX96 also operates based on the SPR sensor technology, with an additional imaging feature that provides detection in spatial orientation. This detection technique coupled with the Continuous Flow Microspotter (CFM) expands the throughput significantly by enabling multiplex array printing and detection of 96 reaction sports simultaneously. In contrast, the Octet RED384 is based on the BioLayer Interferometry (BLI) optical principle, with fiber-optic probes acting as the biosensor to detect interference pattern changes upon binding interactions at the tip surface. Unlike the SPR-based platforms, the BLI system does not rely on continuous flow fluidics; instead, the sensor tips collect readings while they are immersed in analyte solutions of a 384-well microplate during orbital agitation.
Each of these biosensor platforms has its own advantages and disadvantages. To provide a direct comparison of these instruments&#39; ability to provide quality kinetic data, the described protocols illustrate experiments that use the same assay format and the same high-quality reagents to characterize antibody-antigen kinetics that fit the simple 1:1 molecular interaction model.

We describe here protocols for the measurement of antibody-antigen binding affinity and kinetics using four commonly used biosensor platforms.

Bestimmung der hochaffine Antikörper-Antigen-Bindung Kinetics mit vier Biosensorplattformen

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides an alternative strategy, capillary isoelectric focusing (cIEF), with many advantages compared to conventional immunoblotting. This is an antibody-based, automated, rapid, and quantitative method in which a complete western blotting procedure takes place inside an ultrathin capillary. This technique does not require a gel to transfer to a membrane, stripping of blots, or x-ray films, which are typically required for conventional immunoblotting. Here, proteins are separated according to their charge (isoelectric point; pI), using less than a microliter (400 nL) of total protein lysate. After electrophoresis, proteins are immobilized onto the capillary walls by ultraviolet light treatment, followed by primary and secondary (horseradish peroxidase (HRP) conjugated) antibody incubation, whose binding is detected through enhanced chemiluminescence (ECL), generating a light signal that can be captured and recorded by a charge-coupled device (CCD) camera. The digital image can be analyzed and quantified (peak area) using software. This high throughput procedure can handle 96 samples at a time; is highly sensitive, with protein detection in the picogram range; and produces highly reproducible results because of automation. All of these aspects are extremely valuable when the quantity of samples (e.g., tissue samples and biopsies) is a limiting factor. The technique has wider applications as well, including screening of drugs or antibodies, biomarker discovery, and diagnostic purposes.

Capillary isoelectric focusing is an antibody-based, ultrasensitive, high throughput technique, enabling detailed characterization of proteins and their isoforms from extremely small biological samples. The following describes a protocol for detection and quantification of specific proteins and their isoforms in an automated and robotized manner.

Hochsensible und quantitativen Nachweis von Proteinen und deren Isoformen durch Kapillare isoelektrischen Fokussierung Methode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve classes of intrinsically disordered proteins (IDPs) to reduce oxidative and osmotic stress. This article uses a combination of capillary gel electrophoresis (CGE) and mobility shift affinity electrophoresis (ACE) in order to describe the binding behavior of different conformers of the IDP AtHIRD11 from Arabidopsis thaliana. CGE is used to confirm the purity of AtHIRD11 and to exclude fragments, posttranslational modifications, and other impurities as reasons for complex peak patterns. In this part of the experiment, the different sample components are separated by a viscous gel inside a capillary by their different masses and detected with a diode array detector. Afterward, the binding behavior of the sample towards various metal ions is investigated by ACE. In this case, the ligand is added to the buffer solution and the shift in migration time is measured in order to determine whether a binding event has occurred or not. One of the advantages of using the combination of CGE and ACE to determine the binding behavior of an IDP is the possibility to automate the gel electrophoresis and the binding assay. Furthermore, CGE shows a lower limit of detection than the classical gel electrophoresis and ACE is able to determine the manner of binding a ligand in a fast manner. In addition, ACE can also be applied to other charged species than metal ions. However, the use of this method for binding experiments is limited in its ability to determine the number of binding sites. Nevertheless, the combination of CGE and ACE can be adapted for characterizing the binding behavior of any protein sample towards numerous charged ligands.

This protocol combines the characterization of a protein sample by capillary gel electrophoresis and a fast-binding screening for charged ligands by affinity capillary electrophoresis. It is recommended for proteins with a flexible structure, such as intrinsically disordered proteins, to determine any differences in binding for different conformers.

Analyse der AtHIRD11 inneren Unordnung und Bindung in Richtung Metallionen durch Kapillare Gelelektrophorese und Affinität Kapillarelektrophorese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in understanding how such pathways are organized and how they function. There are many methods to detect protein-protein interactions in cells, but relatively few can be used to detect interactions between endogenous proteins. One such method, the proximity ligation assay (PLA), has several advantages to recommend its use. Compared to other common methods of protein-protein interaction analysis, PLA has relatively high sensitivity and specificity, can be performed with minimal cell manipulation, and, in the protocol described herein, requires only two target-specific antibodies derived from different species (e.g., from mouse and rabbit) and one specialized reagent: a set of secondary antibodies that are covalently linked to specific oligonucleotides that, when brought in close proximity of one another, create an amplifiable platform for in situ PCR or rolling circle amplification. In this presentation, we show how to apply the PLA technique to visualize changes in MST1 and MST2 proximity in fixed cells. The technique described in this manuscript is particularly applicable for the analysis of cell signaling studies.

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Here, we show how to use a Proximity Ligation Assay (PLA) to visualize MST1/MST2 heterodimerization in fixed cells with high sensitivity.

Erkennung von Heterodimerization Protein-Isoformen, die mit einem in Situ Nähe Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

Hybrid Clear/Blaue Elektrophorese für die Trennung und Analyse von Mitochondrialen Respiratory Chain Supercomplexen

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

DNA-Elektrophorese mit Thiazole Orange statt Interkalation Bromid oder Alternative Farbstoffe

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins of several nucleotide-derived secondary messengers (NSMs) have been systematically identified and studied in model organisms. These achievements are mainly due to the development of several new techniques including the capture compound technique and the differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA), which were used to systematically identify target proteins of these small molecules. This paper describes the use of the NSMs, guanosine penta- and tetraphosphates (p)ppGpp, as an example and video demonstration of the DRaCALA technique. Using DRaCALA, 9 out of 20 known and 12 new target proteins of (p)ppGpp were identified in the model organism, Escherichia coli K-12, demonstrating the power of this assay. In principle, DRaCALA could be used for studying small ligands that can be labeled by radioactive isotopes or fluorescent dyes. The critical steps, pros, and cons of DRaCALA are discussed here for further application of this technique.

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

The Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) can be used to identify small ligand binding proteins of an organism by using an ORFeome library.

Identifizierung der Bindungsproteine kleiner Liganden mit der differentiellen radialen Kapillarwirkung des Ligandenassays (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...