この方法は、マウスにおける迅速なインビボスクリーニングを可能にし、トランスジーンの効果を、機能のゲインまたは喪失の研究、ならびに回答およびDNA動機マッピングを行うように特異的に適合される。この技術の主な利点は、トランスジェニック動物の予測使用が新生児の70%を超え、トランスジェニック動物を含む任意のマウス株に適用できることである。マウスを安楽死させた後、卵管を収集します。
手術を開始するには、はさみを使用して腹腔に大きな水平切開を行います。次に、子宮と卵巣の間の卵管を見つける。次に、湾曲した鉗子を使用して、顕著な血管を有するメソームトリウムおよび膜を除去する。
次いで、卵巣から卵管を分離し、卵巣から卵管を解剖する。その後、卵管を引っ張り、子宮から切り離します。収集した卵管をすべて室温でM2培地に移します。
卵管を扱うときは、受精卵を積んだ腫れたアンペアに触れないように注意してください。次に、10センチメートルの皿にヒアルロンジダーゼの働く溶液の100マイクロリットルの滴を加えます。次に卵から卵細胞を取り除いて、2つの卵性を移します。
実体顕微鏡では、アンペアを引き裂き、受精卵を分散させながら、インスリン注射器を使用して卵性を確保します。次に、準備したガラスピペットとチューブとマウスピースを使用して、すべての卵を吸引します。このツールを使用して、M2培地の6滴の間でそれらを転送し、周囲の積雲細胞を洗い流します。
次いで、洗浄した卵を10ミリメートルウェルに移し、4つのウェルプレートに、M16で予熱して充填した。その後、加湿37度のインキュベーターに皿を移します。調製のため、160gで調製したレンチウイルスベクター懸濁液を2分間遠心分離し、レンチウイルスストックにしばしば存在する破片をペレット化する。
クラス2の安全キャビネットで、上清を新しい0.5ミリリットルチューブに移します。次に、1マイクロリットルの上清を注入ピペットにロードする。次に、射出ピペットを右側のマイクロプロイターに取り付けます。
そして、左側のマイクロマニピュレータに保持ピペットを取り付けます。今、うつ病スライドの中央にM2培地の8マイクロリットルを分配します。そして、蒸発を避けるために軽いパラフィン油で覆います。
その後、泡を作成することなく、ドロップ内の浅い場所に20個の卵を置きます。次に、注入ピペットの先端が開いていることを確認します。それがない場合は、それを開くために保持ピペットで注入ピペットをタップします。
次に、マイクロインジェクターを20秒間注射に設定する。さて、保持ピペットと手動圧力吸引を使用して、2つの前核と2つの極体を含む受精卵。次に、卵のペリビテリン空間を注入する注入ピペットを使用する。
プラズマ膜に触れないでください。ペリビテリン空間が溶液で満たされるように圧力を調整します。圧力は600ヘクトパスカルを超えてはなりません。
20個の卵を注入した直後に、予熱したM16培地の浴にバッチを移す。そして、それらを移植する前に、少なくとも30分間インキュベートします。精管切除術を伴う男性に正常な女性を交配してから16時間後、交尾プラグを確認してください。
移植のためにこれらの女性を使用してください。次に、約150ミクロンの内径で注入ピペットを作ります。そして、約4〜5ミリメートルの長さである炎で磨かれた先端を持つ。
テストした胚でピペットをロードし、軽いパラフィンオイルを肩のポイントのすぐ上にします。次いで、小さな気泡を吸引し、さらにM2培地でピペットをロードする。次に、第2の気泡を吸引する。
さて、胚をピペットの1つをもう一方の後ろに引き出し、胚間の媒体の体積を最小限に抑える。仕上げ、ちょうど1つの胚幅のパラフィン油の非常に小さな滴を吸引することによって。再着床ピペットの調製は重要であり、多くの練習が必要です。
ピペットの卵は、その間に実質的に媒体なしで整列する必要があります。次に、マウスを麻酔し、つま先のピンチで麻酔を確認した後、最後の肋骨のレベルで脊髄に沿って2センチメートルの髪のストリップを剃る。今、無菌フィールドの加熱パッドの上にマウスを置き、露出した皮膚に窓を残して、それをドレープします。
次に、ヨドプロビトンと70%エタノールの交互スクラブで露出した皮膚を消毒する。移植の場合は、まず1センチメートルの横切り切開を行い、オレンジ色の卵巣が体壁を通って見えるまで皮膚を横方向にスライドさせます。次に、細かいはさみで5ミリメートルの切開を行い、外傷性ブルドッグクランプで脂肪パッドを拾います。
パッドがつかまれたら、卵巣、卵管、子宮の上部を引き出します。次に、アンペアを見つけ、卵巣をアンペアにリンクする卵管セグメント上に、バンナシサミでヘミセクションを作ります。次いで、移入胚ピペットを導入し、卵を排出する。
卵が放出された後、最初の気泡で停止します。第2の卵管上の手順を繰り返すために準備する必要な材料を持っています。そして、完成したら、傷ついたクリップで皮膚を閉じます。
皮膚を閉じた直後に、腹腔内に鎮痛薬を注入し、39度の摂氏発熱体を備えた回復室に動物を入れる。完全に起きるまで監視します。トランスジェニック動物は、提示された方法を用いて生成した。
高力素レンチウイルスベクターは、eGFPを駆動するためにニューロゲニン-3のための2.3キロベースエンハンサーを使用して生成されました。またはコントロールとして、eGFPを駆動する染色体6の断片である。胚への統合はかなり成功した。
胚から、膵臓芽を切除し、免疫染色してeGFPの局所的発現を探す。ベクターの90%以上は、ニューロゲニン-3エンハンサーを用いて、Neurog3発現細胞においてeGFPを発現した。しかし、膵臓芽においてeGFPを発現する統合制御ベクターはいずれもない。
トランスジーン集積部位を定量PCRにより評価し、CDX2遺伝子をコントロールとして用いた。統合部位の平均数は、ニューロゲニン-3構成体を用いて約20個、または対照構造を使用して10であった。不思議なことに、ニューロゲニン-3構築物に使用されるウイルス伝達用のトイターは、対照ベクターの約2倍であった。
伝達価器と積分数との関係を示唆する。このビデオを見た後, 高い有効性を持つレンチウイルスベクターのペリビテルリン注射を使用して創始者トランスジェニック胚の多数を生成する方法をよく理解する必要があります。.一度習得すると、この技術は、それが適切に実行されている場合、マイクロインジェクションの1日以内に最大50の創設者動物を生成することができます。
この手順に従って、細胞間プロ核DNA注入のような他の方法を、トランスジェニックマウスラインを確立するために行うことができる。レンチウイルスベクターの操作は、地元のGMO委員会からの承認を受けることを忘れないでください。これらのベクトルは非常に危険であり、この手順を実行する間は常に予防措置を講じる必要があります。
