私たちは、TLR2をご提供するための教授マルクスSchnareに感謝- / -およびTLR2 / 4 - / -マウスおよびTRIF / MyD88のための教授カルステンKirschning - / -マウス。 、ドイツ学術協会（SFB / TR-84; BundesministeriumがビルドゥングウントForschung（：： - - http://www.bmbf.de/メッドCAPSYS FKZ 01X1304E FKZ 0316175B、電子バイオmiRSys e）をFURことで、この作業の一部は資金を供給されましたhttp://www.sfb-tr84.de/）、およびHessisches MinisteriumのfürWissenschaftウントクン（LOEWE医療RNomics - FKZ 519/03 / 00.001-（0003）; http://www.proloewe.de/medicalrnomics）、すべてのBSへ。

1.培地および寒天プレートを準備します<ol><li>ブロス培地（YEB）の1 Lを用意。 ACES 10gと蒸留水900mL中で酵母エキス10gを溶解させます。 KOH（5 N）で6.9にpHを調整します。 L-システイン（蒸留水10mLの0.4 g）を10 mLを加え、Feの10ミリリットル（NO 3）3 x9H 2 O（蒸留水10mLの0.25 g）を得ました。蒸留水で1Lに埋めるとソリューション（孔径：0.22μm）を滅菌ろ過します。 4℃で保存。 </li><li>寒天プレートの緩衝木炭酵母エキス（BCYE）を準備します。 ACES 10gと蒸留水900mL中で酵母エキス10gを溶解させます。 KOH（5 N）で6.9にpHを調整します。寒天の15グラム、活性炭の2.5グラムを追加します。蒸留水、オートクレーブで1Lに埋めます。 <ol><li> L-システイン（10mLの蒸留水で0.4グラム）の10 mLを加え、Feの10ミリリットル（NO 3）3 x9H 2 O（10mLの蒸留水で0.25グラム、0.22μmの濾過滅菌の両方BCYE（約50℃）を冷却するための孔）。 4℃でプレートや店舗を注ぎます。 </li></ol></li></ol> 2. L.ニューモフィラの育成<ol><li> BCYE寒天プレート上L.ニューモ株コービー（野生型、WT）を広げ、3日間37℃でそれらをインキュベートします。前培養プレートからL.ニューモでOD 0.3の600でYEB 10mLのを接種します。 6時間、回転シェーカー（150rpmで）上で37℃で細菌を培養します。 </li><li>血液寒天プレート上に懸濁液100μLを拡散することにより液体培養物の純度を確認してください。 37℃で一晩インキュベートします。 </li><li>新鮮なYEB培地の90 mLに残りの液体培養を追加し、約16〜20時間を要しOD 3.0から3.5の600に到達するために、回転シェーカー（37℃、回転数150rpm）上でインキュベートします。 </li></ol> 3.準備とL.ニューモのOMVを定量化注：以下の遠心分離工程のすべてを行って無菌条件下で4℃で秒。 <ol><li>細菌をペレット化し、20分間4000×gで液体培養を遠心。 、新たな遠心チューブに上清を移し細菌ペレットを廃棄し、遠心分離（20分間4,000×gで）を繰り返します。一度、この手順を繰り返します。 </li><li>滅菌フィルタ残りの上清は二回（孔径：0.22μmで）。 3時間、100,000×gで超遠心管と超遠心分離機に細菌を含まない上清を移します。 </li><li>上清を除去し、それを捨てます。汚染タンパク質およびLPSを除去するために、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）および超遠心機（3時間100,000×gで）にOMVペレットを再懸濁します。 </li><li>上清を捨て、滅菌PBSの500μLにOMVペレットを再懸濁します。準備された小胞の細菌汚染を排除するストリーク血液寒天プレート上とBCYE寒天プレート上で20μL。両方とも37℃（3日間終夜血液寒天プレートおよびBCYE寒天プレートをインキュベート6; C）。 </li><li>製造業者の指示に従ってビシンコニン酸アッセイを用いOMV調製物から得られたタンパク質の量を定量します。 注：100mLのL.のニューモ文化の濃度は、通常を1μg/μLです。 -20℃で調製し、定量化のOMVを保管してください。 </li></ol> 4.前処理マクロファージ<ol><li> THP-1細胞を準備します。 注：THP-1白血病患者由来の単球細胞株です。 <ol><li> 24ウェルあたり2×10 5 THP-1細胞を添加し、マクロファージ様細胞に20 nmのホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）を加えることにより、それらを区別します。 37℃で24時間インキュベートします。 </li><li>新鮮な培地の500μLで培地を交換し、さらに24時間インキュベート。 THP-1細胞のための最適な培地を、10％ウシ胎児血清を補充したRPMI1640高グルコースで構成されています。 </li></ol></li><li>参照ので説明したように、マウス骨髄由来マクロファージ（mBMDM）を単離しますレンス20。 </li><li> OMVを用いたTHP-1由来マクロファージやmBMDMを扱います。 <ol><li>ステップ3で調製したOMVを解凍し、ヒトまたはマウスのマクロファージへのタンパク量（0.1、1、および10μg/ mL）をに従ってそれらを追加します。少なくとも20時間、37℃でのOMVとマクロファージをインキュベートします。 ELISAのために上清を使用するか、手順5に進みます。 </li></ol></li></ol> 5.マクロファージに感染し、コロニー形成単位（CFU）アッセイで細菌の複製を評価します<ol><li>ステップ2.1からL.ニューモを使用して 、ステップ4.3からTHP-1細胞またはmBMDMを前処理された、およびコントロール（2×10 5月24日のウェル）としてマクロファージを事前に処理されていません。培地を交換しないでください。 </li><li> L.ニューモコービー（0.5の感染多重度（MOI）との両方; 1×10 5 L.ニューモ / 24ウエル）のフラジェリン欠いた変異体とL.ニューモコービーWTとmBMDMとTHP-1細胞に感染し、24インキュベートそれぞれ48時間、。 BOを準備第L.ニューモコービー（WTまたはフラジェリン欠いている変異体）ステップ2.1で説明したように。 </li><li>溶解サポニンを添加することにより、それらの培地中の細胞（最終濃度：0.1％）、5分間37℃でインキュベートします。 </li><li>ピペッティングにより細菌を再懸濁し、反応容器に懸濁液を移します。滅菌PBSでメディアを含有L.ニューモの連続希釈液を調製します。 </li><li>ストリークBCYE寒天プレート上で必要な希釈液50μL、37℃で3日間インキュベートします。 </li><li>視覚的に形成されたコロニーを数えます。 CFUを計算<img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/55146/55146eq1.jpg" />前処理が、100％に設定されたマクロファージを、感染していないためCFUカウント結果を正規化します。 </li></ol>

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Novartis.com Available from: <a target="_blank" href="https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause">https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause</a> (2016)</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

細菌性病原体およびそれらの標的細胞上のこれらの膜小胞の影響のOMVは、現在集中的に研究されています。例えば、 クロストリジウム・パーフリンジェンスののOMVが、マクロファージにおけるサイトカインの分泌を誘導由来、Bリンパ球は、 ボレリアブルグドルフェリからのOMVによって活性化され、およびヘリコバクター・ピロリは、膜小胞は、胃上皮細胞21、22、23に作用することができる-releasedできます。 L.ニューモ 、非定型肺炎の重症型を誘導することができる細胞内病原体は、また、肺上皮細胞とマクロファージ16、19を活性化することができるのOMVを解放します。ここでは、肺炎でのOMVの潜在的な役割を研究するための培養液からL.ニューモのOMVの小規模単離するための詳細なプロトコルを提示します。無菌コンディット下で作業することが重要ですイオンおよび純粋L.・ニューモフィラを得るために、他の細菌からの汚染を排除するためには、OMV調製物が由来しました。 OMVを単離は、最大のOMVは、この濾過工程で失われるので、これは、OMVの収率を低下させるにもかかわらず、L。ニューモで得られるOMVペレットの汚染を防止するために、0.22ミクロンの細孔を介して濾過するステップを含みます。 さらに、我々はより密接のOMVが細胞外細菌15でLCVの内側にリリースされたレジオネラ肺炎、の状況に近づけるために、これらの単離された小胞およびL.ニューモで感染した細胞にヒトおよびマウスマクロファージの応答をテストしました。採用OMVの用量は、インキュベーションの24時間後のヒトマクロファージのインビトロ感染における自由OMV量に応じて推定されている（参考文献20に記載）。他のレシピエント細胞の刺激のために、またはin vivo実験において 、他のOMV投与量が必要になるかもしれませんし、確立されなければなりません。 L.ニューモフィラのOMVの効果の分析はイェーガーとシュタイナー24によって記述されたプロトコルに進歩を表しています。 ここでは、PMA分化THP-1細胞は、初代​​ヒト材料の限られた在庫状況により、肺胞マクロファージのモデルとして役立ちます。 PMAの添加は、マクロファージ様細胞25への単球THP-1細胞を区別する。さらに、それらは、L。ニューモ研究 26のための周知のモデル細胞株です。このヒト単球細胞株のほか、mBMDM細胞が使用されます。 mBMDMは広くL.ニューモ 27、28、29の効果の研究のために受理されています。異なるのTLRまたは他のタンパク質のための遺伝子ノックアウトを使用する可能性は、それらのOMV効果を研究するための貴重なツールとなっています。 ORDで実験あたりのマウスの量を低下させるために、ERは、mBMDMではなく、マクロファージの制限による肺胞マクロファージから使用されています。主な実験は、検証のために肺胞マクロファージを必要とするかもしれません。 OMVを精製するための超遠心分離の本明細書に記載のプロトコルに加えて、Chutkan らのプロトコルに含まれている密度勾配遠心分離を行うことができます。 30。これは、得られたOMV調製物の純度を向上させると共精製されたタンパク質の凝集、フラジェリン、およびLPSの量を減らすことができます。得られたOMV調製物の純度は、品質管理における補助ステップとして、透過型電子顕微鏡法によって、またはナノ粒子追跡分析によって分析することができます。これは、ここで提示タンパク質の測定手順を超えて、定量化の追加の手段を提供することができます。任意に、LPS濃度はリムルス変形細胞溶解物の試験によって分析することができます。 OMV収率が低い場合、遠心フィルターを経由して、追加の濃縮工程は、ここで行われなかった、実行することができます。収量が予想より低かった場合は、OMVを廃棄しました。 OMVを背後にある生物学的メカニズムと機能を解明するための継続的な取り組みの一環として、OMVの生産に異なるストレス条件の影響を試験することができます。栄養欠乏、インキュベーション温度の変化、または有害な薬剤への曝露は、OMV分泌31に影響を与える可能性があります。可能性のあるストレス条件はKlimentovaとStulik 32によってプロトコルで説明されています。また、ハイパーまたはhypovesiculating L.・ニューモ変異体が生成することができます。異なるOMV調製物は、その後、（文献17に記載）、ヒト肺組織外植片、あるいはin vivoモデルにおけるマクロファージの感染実験で分析することができました。細菌の通信における自然免疫シグナル伝達におけるのOMVの役割、彼らの影響力のほかに実験的に対処することができます。さらに、様々な自然免疫シグナル伝達カスケードの影響は、マウスノックアウト細胞の使用またはヒト細胞株におけるCRISPR / Cas9ノックアウトの生成によって分析されることがあります。 OMVのこの基礎研究はすでに髄膜炎菌 33によって送信された髄膜炎Bのために存在する新たなワクチン戦略の開発を支援します。 OMVの単離および特徴上のプロトコルから始めて、1は、他のグラム陰性菌および他の宿主細胞にこれを適用することができます。それは、液体培養における細菌の増殖を調整する必要があります。 Chutkan らによって発表されたプロトコル。 大腸菌や緑膿菌 30からのOMVの生成に関する詳細な情報を提供しています。文化を溶解し、細菌の増加と汚染タンパク質とMEMを避けるために、後期定常期に達するべきではありませんブレーン。さらに、宿主細胞の刺激のために使用されるOMV用量は依然として細胞毒性の低い速度を確保しながら、 インビボでの感染の間のOMVの存在量に応じて決定する必要があります。このように、OMVをの病理学的役割は、種間の通信、およびホスト病原体相互作用に及ぼす影響を調べることができました。 さらに肺炎でL.ニューモのOMVの役割を研究するために、十分な収量と同等の感染実験で標準化されたOMV調製物が必要とされています。このプロトコルは、分離手順を標準化し、他のグラム陰性菌および他の宿主細胞へのOMVの研究を拡張するのに役立ちます。さらに、研究は、 インビボでの設定に実験を拡張するために使用することができる、 インビトロ知識に詳細恩恵を受ける。今後は、このプロトコルは、血清又は気管支LAVとして、主要な生物学的材料からのOMVの単離に拡張することができ年齢流体は、生理学的条件の下でリリースするOMVの組成への洞察を得るために。これは、OMV組成物の重要なパラメータを決定し、in vitroで -generatedのOMVの性質を理解するのに役立ちます。

<html>細菌は異なるメカニズム1を介して病原性因子を分泌することができます。よく知られている分泌システムのほかに、グラム陰性細菌は、情報を交換することができ、直径及び二層状膜構造を持つ小さな、回転楕円体小胞10〜300nmである外膜小胞（OMVを）を介して病原性因子を提供します。彼らは、成長環境（液体培養、固体培養、およびバイオフィルム）の様々な、すべての成長段階2、3に分泌されます。 OMVを輸送する重要な手段である（ 例えば、OMVの表面上に見出されるタンパク質、アドヘシン、毒素、酵素、ならびにためのLPSのための）4。管腔内の貨物は、タンパク質分解から保護されたので、長い距離にわたって作用することができる、と小胞は、体液や遠隔臓器5、6で見つけることができますされています「外部参照」&gt; 7、8。彼らは認識し、真核細胞9,10によって取り込まが、さらに、それらは、宿主細胞4に細菌およびそれらの浸潤の結合を促進することが可能であることはできません。 レジオネラ・ニューモフィラ （L.ニューモは ）のOMVを解放することができ、グラム陰性細菌です。ヒトの肺では、それは主に、その天然の宿主は淡水アメーバ11であっても、肺胞マクロファージに感染します。 L.・ニューモフィラ感染はレジオネラ症、肺炎12の重症型を引き起こす可能性があります。また、宿主細胞内のブロックファゴソーム - リソソーム融合を。複製ニッチ、 レジオネラ -含有小胞（LCV）は、13、14を形成することも、ホスト細胞内小器官を動員します。リソソーム分解だけでなく、エフェクタータンパク質TRAによって阻害されますIV型分泌システムを介して、だけでなく、OMVを15のリリースによりnslocation。 細菌培養物からのOMVの精製は、レシピエント細胞に対する効果を分析するために必要とされます。 L.ニューモフィラのOMVのタンパク質含有量に及び肺胞上皮細胞16が、ヒト肺組織移植とその後の研究に小胞の影響に焦点を当てた初期の研究はL.ニューモフィラのOMVは肺胞マクロファージ17によって取り込まれることを実証しました。 OMVを、本病原体関連分子パターン（PAMP）および他の細菌抗原として、それらは、真核細胞の感染に影響を与えると宿主免疫応答18を調節するかもしれません。 L.ニューモフィラのOMVが急速さらに、それらは、膜TLR2 19を活性化する 、宿主細胞膜と融合し、。それはL. pneumophことが知られているようILAのOMVは、炎症誘発性の様式16、17にマクロファージおよび上皮細胞を刺激し、我々は、ヒトおよびマウスのマクロファージにおける感染プロセスに対するのOMVの影響を分析しました。 ここでは、直接、または感染後、差動超遠心分離により分泌のOMVを分離し、真核生物の宿主細胞に小胞の影響を評価するために、液体培養中でL.・ニューモフィラの栽培のためのプロトコルを説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1938">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 cm petridish</td>
			<td style="width:475px;">Sarstedt AG &#38; Co KG (Nuembrecht, Germany)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">82.1473</td>
			<td style="width:1128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70 Ti rotor</td>
			<td style="width:475px;">Beckman Coulter Incorporation (California, USA)</td>
			<td align="right">337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACES</td>
			<td style="width:475px;">Carl Roth GmbH &#38; Co KG (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td align="right">9138.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">activated charcoal</td>
			<td style="width:475px;">Carl Roth GmbH &#38; Co KG (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td style="width:119px;">X865.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">agar-agar, Kobe I</td>
			<td style="width:475px;">Carl Roth GmbH &#38; Co KG (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td align="right">5210.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Columbia agar with 5 % sheep blood</td>
			<td style="width:475px;">Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">254005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cuvettes</td>
			<td style="width:475px;">Sarstedt AG &#38; Co KG (Nuembrecht, Germany)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">67.742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ELISA (human)</td>
			<td style="width:475px;">BD OptEIA&#8482;; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany)</td>
			<td style="width:119px;">IL-8: 555244 IL-6: 550799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ELISA (murine)</td>
			<td style="width:475px;">DuoSet, R&#38;D (Minneapolis, USA)</td>
			<td style="width:119px;">CXCL1: DY453-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Fe(NO3)3x9H2O</td>
			<td style="width:475px;">Carl Roth GmbH &#38; Co KG (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td align="right">5632.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Heracell 240i CO2 incubator</td>
			<td style="width:475px;">Thermo Fisher Scientific Germany BV &#38; Co KG (Braunschweig, Germany)</td>
			<td align="right">40830469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heraeus Multifuge X3R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Germany BV &#38; Co KG (Braunschweig, Germany)</td>
			<td align="right">75004515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inoculation loop&#160;</td>
			<td style="width:475px;">Sarstedt AG &#38; Co KG (Nuembrecht, Germany)</td>
			<td style="width:119px;">86.1567.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KOH</td>
			<td style="width:475px;">Carl Roth GmbH &#38; Co KG (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6751.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L. pneumophila Corby</td>
			<td style="width:475px;">---</td>
			<td style="width:119px;">---</td>
			<td>kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L. pneumophila Corby &#916;flaA</td>
			<td style="width:475px;">---</td>
			<td style="width:119px;">---</td>
			<td>kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-cystein</td>
			<td style="width:475px;">Carl Roth GmbH &#38; Co KG (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mBMDM</td>
			<td style="width:475px;">---</td>
			<td style="width:119px;">---</td>
			<td>kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td>Biochrom GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>L 1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:475px;">Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">rotating shaker (MaxQ 6000)</td>
			<td style="width:475px;">Thermo Fisher Scientific Germany BV &#38; Co KG (Braunschweig, Germany)</td>
			<td>SHKE6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640 high glucose</td>
			<td>Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">saponin</td>
			<td style="width:475px;">Carl Roth GmbH &#38; Co KG (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9622.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrospec 10</td>
			<td style="width:475px;">Biochrom Ltd (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;">80-2116-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sterile filter (pore size: 0.22 &#181;m)</td>
			<td style="width:475px;">Corning Incorporated (new York, USA)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">431096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">THP-1</td>
			<td style="width:475px;">Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>88081201-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sorvall Discovery 100 SE</td>
			<td style="width:475px;">Thermo Fisher Scientific Germany BV &#38; Co KG (Braunschweig, Germany)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">yeast extract</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td align="right">2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td style="width:475px;">Thermo Fisher Scientific Germany BV &#38; Co KG (Braunschweig, Germany)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

legionella pneumophila outer membrane vesicles: isolation and analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

L.ニューモのOMVを調製するための、および感染後のマクロファージの炎症誘発性応答に及ぼす影響を分析する実験は、図1に示されています。調製したOMVの炎症誘発電位は、 図2に示されているPMA分化THP-1細胞上で分析することができます。 THP-1細胞を、IL-8およびIL-6分泌の時間および用量依存的増加に応答します。 図3にCXCL1 ELISAによって提示されるように加え、L。ニューモ OMV認識の異なるTLRの影響は、異なる遺伝的背景からmBMDMを用いて分析することができます。 OMV刺激後CXCL1分泌WTマウスからmBMDM、しばらくmBMDM TLR2 / 4 - / -大幅に少ない分泌。 THP-1マクロファージにおける細菌の複製にL.ニューモのOMVの影響を研究するために、細胞は、OMVを用いてプレインキュベートし、次いで、さらに感染させましたL.ニューモフィラ （ 図4 A）で。 THP-1由来マクロファージの刺激前には、最初の感染の24時間後に細菌の複製を減少させるが、それは後の時点（48時間π）でCFU数の倍増につながります。 図4 Bに提示されるようなマクロファージの感染後のOMV認識にシグナリングToll様受容体（TLR）の影響は、mBMDMによって評価することができます。 OMVのプレインキュベーション後のWT動物からmBMDMで十倍による細菌の複製が増加し、TLR2ながら- / -およびTRIF / MyD88に- / -細胞はL.・ニューモフィラ複製におけるこの増加を示しません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig1.jpg" /> 図1：実験手順。 （A）L. ニューモコービーWT 10センチBCYE寒天プレートは、新鮮なYEBの90ミリリットルに移し、少量の液体培地（10ミリリットル）を、接種するために使用されているから6時間後の培地。少量はまた、純度を確認するために、血液寒天プレート上にプレーティングされます。細菌は、初期定常期（OD 600 = 3.0〜3.5）になるまで37℃でインキュベートします。細菌を除去するために、（B）液体培養物を遠心分離し、滅菌濾過しました。 レジオネラフリー次いで、上清をPBSに再懸濁し、再び超遠心分離されたOMVペレットを得るために超遠心分離されます。単離された小胞は、純度をチェックし、再懸濁し、およびタンパク質の量を定量します。スケールバーは2.5 cmで表します。 （C）ヒトまたはマウスのマクロファージを定量したOMVで刺激します。細胞培養上清をELISAに使用することができ、またはマクロファージは、10センチBCYE寒天プレート上のCFUアッセイによって細菌複製を決定するために、L・ニューモで感染させることができます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </A&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig2.jpg" /> 図2：L.ニューモフィラのOMVによるTHP-1細胞のプロ炎症活性化。 （A）ここで、単球THP-1細胞株は、肺胞マクロファージのモデルとして使用されます。 PMA分化THP-1細胞を、それぞれ、24および48時間L.ニューモのOMV（0.01〜25 / mlの）の漸増用量で処理しました。無細胞上清を、IL-8 ELISAのために使用しました。 SEM±3つの独立した実験の平均値が示されています。 THP-1細胞は、時間および用量依存的であった重要なIL-8分泌、とわずか0.01 / mlのL.ニューモのOMVに反応しました。 （B）L。ニューモフィラのOMV（0.1μgの/ mL）をPMA分化THP-1細胞を刺激するために使用しました。上清をインキュベーションの24および48時間後に収集し、そして放出されたIL-6はELISAにより上清中で測定しました。。 SEM±3つの独立した実験の平均値が示されています。偶数のOMVの最低用量（0.1μgの/ mL）で、IL-6の有意な量を分泌したTHP-1細胞。 IL-6の分泌は、OMV用量の増加に伴って延長し、インキュベーション時間と共に増加しました。統計：マンホイットニー検定。 * P &lt;対応0 / mlのOMVに比べ0.05および**はp &lt;0.01。リファレンス20からの許可を得て転載<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig2large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig3.jpg" /> 図3：マクロファージの炎症誘発性活性化はTLR2 / 4に依存します。 WTからmBMDM及びTLR2 / 4 - / -マウスはL.ニューモのOMV（0.1を1μg/ mL）でインキュベートしました。 CXCL1分泌は、それぞれ、24および48時間後にELISAによって分析しました。ザ3つの独立した実験の平均値±SEMが示されています。 WTマウスからmBMDMはL.ニューモ OMVのインキュベーション後に用量依存CXCL1の分泌と答えました。 TLR2 / 4 - / - mBMDMは、WT mBMDMと比較して有意に少ないCXCL1を分泌し、この分泌は用量依存的に増加しませんでした。統計：マンホイットニー検定。対応する0 / mlのOMVと比較して、*はp &lt;0.05; #P &lt;0.05は等しく扱わWTサンプルと比較します。リファレンス20からの許可を得て転載<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig3large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig4.jpg" /> 図4：マクロファージにおけるL.ニューモ OMVプレインキュベーション増加細菌複製。 （A）分化したTHP-1細胞のOMV（0.1、1、または10μと共にプレインキュベートしました。;グラム/ ml）またはLPS / IFN-γ（200 ngの/ mLの各）またはコントロールの未処理のままとしました。プレインキュベーション（20時間）後、THP-1細胞を、それぞれ、2、24、及び48時間L.ニューモコービーWT（MOI 0.5）で感染させました。 THP-1細胞は、サポニンを添加することによって溶解し、そして細菌をBCYE寒天プレート上にプレーティングしました。 CFUは、すべての時間点の後0 / mlのOMVと比較して計算しました。バーは、3つの独立した実験、技術的な二重に実行される各の平均値±SEMを表します。細菌の取り込みの差異は、前処理されていない細胞と比較して（2時間の感染後（PI））が存在しませんでした。細菌の複製の変化は、それぞれ、24および48時間後に測定しました。 LPS / IFN-γ前処理されたTHP-1細胞は、これはまた、L。ニューモ OMVプレ処理した細胞の用量依存的に観察された細菌負荷の24時間PIの減少を示しました。後の時点（48時間PI）では、OMVの前処理されたTHP-1細胞は、L。ニューモフィラ再で倍増を示しましたLPS / IFN-γ前処理されたマクロファージ一方ひだは、細菌負荷のさらなる低減を示しました。統計：マンホイットニー検定。 * P &lt;対応0 / mlのOMVに比べ0.05および**はp &lt;0.01。 20時間は0.1μg/ mLのL。ニューモフィラのOMVでプレインキュベートし、次いで、フラジェリンを感染させた（B）mBMDMは異なる遺伝的背景を有するマウス（WT、TLR2 - / - 、およびTRIF / MyD88の- / - ）から48時間L.ニューモコービー（MOI 0.5）の欠損変異体。 mBMDMは、サポニンを添加することによって溶解し、およびレジオネラを BCYE寒天プレート上にプレーティングしました。 CFUは、実線で示され、0 / mlのOMVに対して計算しました。バーは平均値±±3つの独立した実験のSEM、二重に行っそれぞれを表します。 WTマウスからmBMDMはOMV前処理後のL.・ニューモフィラの複製の増加を示しました。 TLR2 - / -マクロファージは、有意に減少を示しました<emTRIF / MyD88のに匹敵するものであった&gt;レジオネラ複製、 - / - mBMDM。統計：マンホイットニー検定。 WTサンプルと比較してp &lt;0.05。リファレンス20からの許可を得て転載<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig4large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

ここでは、 レジオネラ・ニューモフィラ （L.ニューモ ）液体培養物から外膜小胞（OMVを）の精製を記載しています。これらの精製された小胞は、次いで、それらのプロ炎症性の可能性を分析するために、マクロファージの治療のために使用されます。

レジオネラ・ニューモ外膜小胞：マクロファージ上における炎症誘発ポテンシャルの単離と解析

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

11.1K ビュー.  Philipps-University Marburg. ここでは、 レジオネラ・ニューモフィラ （L.ニューモ ）液体培養物から外膜小胞（OMVを）の精製を記載しています。これらの精製された小胞は、次いで、それらのプロ炎症性の可能性を分析するために、マクロファージの治療のために使用されます。 

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Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

使用<em&gt;ハチノスツヅリガ</em&gt;モデル生物として研究する<em&gt;レジオネラ·ニューモフィラ</em&gt;感染症

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

免疫・感染学

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Toll様受容体刺激時の遺伝子発現解析を行うためにマウス腹腔マクロファージの単離

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

ビリオンの抗原性スペクトルと細胞外ベシクルを分析するためのフローVirometry

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

分離と大人住血吸虫から細胞外小胞のキャラクタリゼーション

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

生体内における単球血球活性の定量化と血液単球由来マクロファージの特性化

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

マクロファージに貪食アポトーシス胸腺細胞の実験的解析

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...