このプロトコルは、ますます普及しているが複雑なクライオ電子線トモグラフィーの世界への簡単なアクセスルートを提供します。6つの細胞標本を画像化することができる。ネイティブに近い状態で研究所。
微小分子は、CROW、ET、および亜原子平均化を使用して、天然の細胞環境で高解像度で分離できます。まずはTEMサーバPCからトモファイブソフトウェアを起動します。プリセットの下にある準備タブで画像取得パラメータを調整して、セッションのセットアップを開始します。
画像取得のパラメータを他のすべての高倍率プリセットにコピーします。[設定]を押して顕微鏡への露出を設定し、[取得]を押して、個別に選択した後、他のすべての高倍率への露出設定を取得します。アトラスを収集するには、をクリックします新しいセッション「アトラス内」タブ。
セッション設定を行います。ストレージパスと出力形式を入力し、適用を押します。スクリーニング」を選択し、取得するすべてのアトラスにチェックマークを付けます。
「コールバルブを閉じる」を選択します」顕微鏡が教師なしの場合、カラムバルブを閉じます。次に、スクリーニングを開始するには、開始ボタンを押します。[セッション設定]の下の左側のパネルのグリッドをクリックして、単一または複数のアトラスでターゲットを調べます「次に、マウスを左クリックしてドラッグし、中央スクロールしてズームインおよびズームアウトします。
ターゲット設定のグリッドを選択します。それを選択し、をクリックします サンプルをロードする」ソフトウェア内から。画像シフトキャリブレーションを実行するには、自動機能「タブプリセットをユーセントリック高さに設定する」ステージチルトで自動ユーセントリックにナビゲートし、スタートを押します。
ターゲティング中に特徴量が中央に配置されたままの場合は、画像シフトの調整をスキップします。それ以外の場合は、準備「画像シフトを調整するためのタブ選択画像シフトの調整」と開始を押します。これにより、露出倍率を中心としたフィーチャに低倍率が整列します。
トモグラフィーの設定については、生物学的サンプル用の「セッション設定」で新しいセッションを開始します。のようなスラブを選択してください」サンプルタイプとしてバッチを選択します」と低用量「次に、出力形式とストレージ「フォルダ。オプションで、電子メール受信者を追加してを押します申し込み「ターゲットを設定するには、アトラス矢印に移動し、関心のある領域を見つけて、マウスの右クリックでポップアップするオプションを選択して移動します。
概観画像を撮影して、ユーセントリックの高さ調整に適した位置を確認します。次に、オートユーセントリック」を押して、ステージチルトルーチンでユーセントリックを実行し、新しいオーバービュー画像を再取得してユーセントリック高さを更新します。正方形の概観または取得した検索マップを調べます。
関心のある領域に移動し、[検索の取得]を押します。次に、関心領域が中央に配置されていない場合は検索画像を調べ、目的の位置を右クリックして、 ステージをここに移動」を繰り返して画像を取得します。フォーカス領域とトラッキング領域を調整します。
左クリックして、トラッキング領域とフォーカス領域をドラッグします。すべてのパラメータが設定されたら、を押します位置を追加「自動機能を実行するには、アトラスを炭素の領域に移動して、自動機能を介して位置合わせを実行するための設定を確認します」タブ。その領域をユーセントリックの高さにし、テキスト原稿に記載されている位置合わせの順序に従います。
次に、断層撮影タブの自動取得を開始します。データ収集のスラブアウトを選択し、必要なパラメータを設定します。データ収集パラメータを設定します:チルトステップ、最大正角、最大負角度、追跡スキーム。
次に、ユーセントリック高さスキームの「コラムバルブを閉じる」を選択します。入力ファイルとディレクトリの準備から始めます。プロジェクト」フォルダの下にプロジェクトフォルダを設定します。
別の新しいフォルダーを固定スタックにし、入力ファイルを準備します。チルトシリーズ1固定チルトシリーズ1。XFおよびチルトシリーズ1.tlt。
焦点ぼけを計算するには、顕微鏡とイメージングのパラメータでパラメータファイルを更新します。パラメーター ファイルをプロジェクト フォルダーにコピーします。名前を param_CTF に変更します。
M を実行し、示されたコマンドを実行します。次に、CTF推定結果を確認します。スタックごとに、3D modを使用して位置合わせされたスタックをチェックし、基準ビーズが正しく消去されていることを確認します。
示されたコマンドを実行して、利き手が正しいことを確認します。次に、焦点ぼけの値を確認し、理論上のCTF推定値と一致することを確認します。サブ領域を定義するには、ベンドトモグラムを生成します。
プロジェクト フォルダーで、指定されたコマンドを実行します。Xmin Xmax Ymin、Ymax、Zmin、およびZmaxの6つのポイントを選択して境界を決定し、フォルダーbin10の下に1つのサブ領域を作成するには、指定されたコマンドを実行します。次に、各サブ領域に対してパーティクル ピッキングを実行します。
アポフェリチンデータセットについては、ビン6でテンプレート検索を実行します。テンプレートの下線の角度を変更します。検索パラメータを使用して、平面内または平面外検索の角度、範囲、および間隔を度単位で決定します。
プロジェクト フォルダーで、指定されたコマンドを実行します。フォルダの下の3D modを使用して、誤ったパーティクルを削除します。Convmap_wedge_Type2_bin6。示されたコマンドを実行します。
次に、プロジェクトを初期化します。プロジェクト フォルダーで、指定されたコマンドを実行して、EM を明確にするためのデータベース AppoF.mat を作成します。サブトモ平均化とアライメントの前にトモグラム再構成を実行して、bin4でCTF補正されたサブ領域トモグラムを生成し、指定されたコマンドを実行します。
次に、サブトモ平均化とアライメントを実行するために、bin4から始まるCTF補正サブテレグラムを使用して平均化を実行します。プロジェクト フォルダーで、指定されたコマンドを実行します。位置合わせを続行し、コマンドを実行します。
指定されたコマンドを実行して、重なり合ったパーティクルをクリーンアップします。2 つのハーフ データ セットを組み合わせて最終的な再構成を実行します。プロジェクトフォルダで、指定されたコマンドを実行します。
細胞および分子断層撮影のための断層撮影ワークフローの概要は、細胞およびラメラサンプルについてここに示されており、データ収集戦略は、サンプルおよびイメージング研究の目標に大きく依存する。いくつかのクライオET研究の収集パラメータがここに示されています。ここでは、アポフェリチンなどの分子サンプルの代表的な断層撮影、薄い細胞プロセス、および厚い細胞標本の集束イオンビーム粉砕ラメラを示します。
高分解能構造解析は、薬物標的の結合部位を明らかにするのに役立ち、断層撮影とサブトモグラール平均化もSARS-CoV-2に対するワクチン開発を支援しています。
