We would like to gratefully acknowledge Dr. Milan N Stojanovic from Columbia University, New York, NY for valuable scientific input. This work is supported by funding from the California State University East Bay (CSUEB) and the CSUEB Faculty Support Grant-Individual Researcher. O.E., T.C., and A.L. were supported by the CSUEB Center for Student Research (CSR) Fellowship.

注：分子生物学グレードの水は、すべての緩衝液および溶液製剤で使用されます。すべて使い捨てチューブ（微量とPCR）およびピペットチップはDNase-とRNaseフリーです。使用前に、すべての化学物質のための材料安全データシート（MSDS）を参照してください。適切な個人保護具（PPE）の使用を強くお勧めします。 アプタマーストック溶液の調製<ol><li>商業的にポリデオキシヌクレオチドの2本鎖を購入します。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による精製との両方の鎖を注文します。 ストランド1（GD-アプタマー）： 5 &#39; - / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3&#39; ストランド2（QS）： 5&#39;-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 &#39; </li><li> Gd-アプタマーとQSの100μMの個々の原液を作るために水の中に各鎖を溶かします。 </li><li> -20℃でこれらのソリューションを保管してください。ソリューションはこれまで、3年間安定です。 </li><li> freezを最小限に抑えるために、電子融解サイクル、10μLのアリコートで原液を格納します。 </li></ol> 2倍のGd-センサーソリューションの調製<ol><li>アッセイ緩衝液を調製し（20mMのHEPES、2mMのMgCl 2を、150mMのNaCl、5mMのKClを）。 NaOHおよびHClでpHに〜7.4に調整し、0.2μmのPES膜で滅菌使い捨てボトルトップフィルターでろ過します。滅菌瓶に保管してください。濾過し、（室温で）適切に保存されている場合、バッファはこれまで、2年間安定です。 </li><li> （ステップ1.2から）のGd-アプタマー原液の1μLおよびアッセイ緩​​衝液497μL（ステップ1.2から）QS原液の2μLに希釈します。ボルテックスを用いてよく混ぜます。 2XのGdセンサ液中の濃度は、それぞれ、200 nmおよび400 nMです。 注： -検量線造影剤溶液のためのGd 3+の7様々な濃度のこの工程で調製したGd 2×センサー溶液の体積は、6をテストするのに十分である500μL、あります（ステップ3）。各サンプルは、384ウェルプレートに二連のウェルを与えます。 <ol><li>テストする必要のGd 3+ソリューションの数に応じて2倍のGd-センサーソリューションの音量を調整します。 </li></ol></li><li>各チューブに50μLで、9 PCRチューブに2倍のGd-センサー・ソリューションを転送します。サーマルサイクラーにチューブを入れます。 </li><li> 95°Cまでのチューブ内の溶液を加熱するサーマルサイクラーにプログラムを設定し、5分間保持し、その後、ゆっくりの速度で（15分〜かけて25℃にソリューションを冷却〜0.05から0.1℃/秒）。加熱と冷却のサイクルは、GdのアプタマーとQS間の最適なハイブリダイゼーションを確実にすることです。不完全焼入れとセンサーの高いバックグラウンド蛍光の部分的なハイブリダイゼーションの結果。サーマルサイクラーを使用できない場合は、代わりに、湯浴を用いてこの処理を行います。 </li><li>一度25℃に冷却し、直ちに解決策を使用するか、またはこと準備ができるまで（約2時間まで）サーマルサイクラーに保ちます中古。水浴を加熱するために使用される場合、水がゆっくりと室温まで冷却するように、浴中でチューブを残します。 </li></ol> 3.蛍光検量線の構築及びGd造影剤の溶液に非キレート化のGd 3+の存在を検出します<ol><li>アッセイ緩衝液中の固体のGdCl 3（ステップ2.1と同じバッファ）を溶解します。 </li><li>連続希釈によって、検量線（2回ソリューション）の最終的な所望の濃度の二重で100μLマイクロ遠心チューブ内の6異なるのGd 3+の溶液のそれぞれを準備します。 <ol><li>たとえば、0の校正（NOのGdCl 3と緩衝液のみ）、50、100、200、400、及びGd 3+の800 nMのを構築0、100、200、400、800を含有する溶液を調製し、1,600 nmのイオンの。常にネガティブコントロールとして0 nMでのGd 3+との「空白」を必ず含めてください。 </li></ol></li><li>試験であることが造影剤を溶解アッセイ緩​​衝液中で編。連続希釈を介して造影剤溶液の2または3種の異なる濃度を準備します。 注：造影剤溶液の3種の異なる濃度のテストをお勧めします。これは、これらの濃度は線形の範囲内にあることを保証することです。試験した試料は直線関係が表示されない場合は、使用する造影剤の濃度を低下させます。 </li><li>サーマルサイクラーのうちステップ2.5から2倍のGd-センサー溶液を含むPCRチューブを取ります。 </li><li> 2倍のGd-センサー・ソリューションを含む9 PCRチューブの6にステップ3.2からそれぞれのGd 3+溶液50μLを追加します。ピペッティングにより混和します。各PCRチューブは今のGd 3+テストされる、100 nMのGdの-アプタマー、および200 nMのQSの所望の濃度が含まれています。 </li><li> 2倍のGd-センサー・ソリューションを含む残りのPCRチューブに、ステップ3.3からの造影剤溶液の50μLを追加します。ピペッティングにより、数回上下よく混ぜます。 </li><li>秒をインキュベート室温で約5分間のPCRチューブ内olutions。彼らは、最大30分間放置してもよいです。 </li><li> 384ウェルプレートに各チューブの45μLを転送します。各PCRチューブは、二連のウェルが得られます。 </li><li>プレートリーダーで各ウェルの蛍光を記録します。供給業者のウェブサイトに掲載されているとしてのGd-センサ設計で使用されるフルオロフォア（FAM）は、それぞれ495および520 nmでの励起および発光極大を有しています。プレートリーダーはmonochromator-またはフィルタベースであるかどうかに応じて、適切な励起波長および発光波長やフィルタを選択してください。 </li><li> Gd 3+の濃度に対する任意の蛍光単位（AFU）における蛍光のグラフをプロットします。 </li><li> Gd 3+の濃度に対する蛍光倍率変化としてグラフをプロットします。 （GD 3+の0 nMので）「ブランク」ソリューションのAFUにより各濃度のAFUを分割することにより、蛍光倍率変化を計算します。蛍光倍数変化は、nが可能になります結果のormalization、AFU表示いくつかの定期的な（異なる日、 等 ） が変動する必要があります。 </li><li> 0 nMでのGdCl 3（緩衝液のみ）を含む溶液で造影剤を含む溶液と、「ブランク」の蛍光発光を比較します。 注：GBCA溶液の高い蛍光は、造影剤の更なる精製を必要とすることができる非キレート化のGd 3+の存在を意味します。非キレート化のGd 3+の量は、工程3.10または3.11で作成した検量線を用いて推定することができます。 </li></ol>

<ol><li>Shen, C., New, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promising+strategies+for+Gd-based+responsive+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).</li>
<li>Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrogenic+systemic+fibrosis%3A+a+concise+review+for+cardiologists%5BTitle%5D)+AND+%22Tex.+Heart+Inst.+J%22%5BJournal%5D)">Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists.</a> Tex. Heart Inst. J. 37 (5), 508-515 (2010).</li>
<li>Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. M., Tweedle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+contrast+agents%3A+basic+chemistry+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">MRI contrast agents: basic chemistry and safety.</a> J Magn. Reson. Imaging. 36 (5), 1060-1071 (2012).</li>
<li>Telgmann, L., Sperling, M., Karst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+gadolinium-based+MRI+contrast+agents+in+biological+and+environmental+samples%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Determination of gadolinium-based MRI contrast agents in biological and environmental samples: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 764, 1-16 (2013).</li>
<li>Frenzel, T., Lengsfeld, P., Schirmer, H., Hütter, J., Weinmann, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+gadolinium-based+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents+in+human+serum+at+37+degrees+C%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Stability of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents in human serum at 37 degrees C.</a> Invest. Radiol. 43 (12), 817-828 (2008).</li>
<li>Loreti, V., Bettmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+MRI+contrast+agent+Gd-DTPA+by+SEC-ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of the MRI contrast agent Gd-DTPA by SEC-ICP-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 1050-1054 (2004).</li>
<li>Telgmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+and+isotope+dilution+analysis+of+gadolinium-based+contrast+agents+in+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (21), 11929-11936 (2012).</li>
<li>Cleveland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+methods+for+the+quantification+of+free+and+chelated+gadolinium+species+in+MRI+contrast+agent+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations.</a> Anal. Bioanal. Chem. 398 (7), 2987-2995 (2010).</li>
<li>Edogun, O., Nguyen, N. H., Halim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+single-stranded+DNA-based+assay+for+detecting+unchelated+gadolinium%28III%29+ions+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent single-stranded DNA-based assay for detecting unchelated gadolinium(III) ions in aqueous solution.</a> Anal. Bioanal. Chem. 408 (15), 4121-4131 (2016).</li>
<li>Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+free+Gd+and+free+ligand+in+solution+of+Gd+chelates.+A+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note.</a> Contrast Med. Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).</li>
<li>Johansson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+reporter-quencher+pairs+for+efficient+quenching+through+formation+of+intramolecular+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers.</a> Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).</li>
<li>Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+gadolinium+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">A primer on gadolinium chemistry.</a> J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).</li>
<li>Shakhverdov, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-relaxation+mechanism+of+fluorescence+quenching+in+complexes+of+lanthanide+ions+with+organic+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands.</a> Opt. Spectrosc. 95 (4), 571-580 (2003).</li>
<li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicrogram+determination+of+lanthanides+through+quenching+of+calcein+blue+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence.</a> Anal. Chem. 59 (8), 1122-1125 (1987).</li>
</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

アプタマーベースのGd-センサを用いて、非キレート化のGd 3+の濃度に比例する蛍光発光の増加が観察されます。使用されるサンプルの量を最小にするために、アッセイは、ウェル当たり45μLの全試料体積で384ウェルマイクロプレートで実行されてもよいです。この設計では、フルオレセイン（FAM）およびダブシル（DAB）の選択は、主に、試薬のコストに基づいていました。発光波長、蛍光体の異なるペアを変更すると消光剤11を使用することができます。 重要なステップの一つは、GdのアプタマーとQS間の最適なハイブリダイゼーションを達成するために、アッセイ緩​​衝液中で95℃、徐冷（ステップ2.4）に加熱され、センサーで最良の結果を得るために、それを注意することが重要ですストランド。以前のプロトコルで述べたようにサーマルサイクラーを使用できない場合は、95℃でのインキュベーションは、水浴中で行ってもよいです。制御するためのもう一つの重要なパラメータはtです彼は、緩衝液の組成物。造影剤を溶解するために、ステップ2.1に記載されているアッセイ緩​​衝液の使用が推奨され、または脱イオン水を使用してもよいです。しかし、潜在的な干渉を含む溶液は避けるべきです。そのような緩衝剤の例としては、不溶性リン酸ガドリニウム12を形成するために非キレート化のGd 3+に配位することができ、リン酸アニオンを、含有するものです。沈殿物は、偽陰性の結果が得られ、センサーに反応しません。 実験のいくつかのステップは、結果に影響を与えずに修正することができます。まず、分析及び計算を単純化するために、2倍の濃度の検量線用のGdセンサ水溶液とのGdCl 3の両方を準備します。所望であれば、他の希釈係数は、Gdを、アプタマーの最終アッセイ濃度とQSは、それぞれ、100 nmおよび200 nmで維持されていれば、（例えば、10倍溶液）を使用してもよいです。第二に、アッセイバッファーDOES正確にpHが7.4である必要はありません。 7の間の任意の値 - 7.4であれば同一の緩衝液を、実験の全体にわたって使用されるように、所望の蛍光増加を生じます。蛍光発光の読み取りが得られると第三に、データ点は、任意の単位での生の蛍光（AFU）として、または蛍光倍数変化のいずれかをプロットすることができます。蛍光の倍率変化を計算するために、各濃度の未加工の蛍光読み取りは、陰性対照（0 nMでのGd 3+）の読み取り（分周）に正規化されます。 図2AおよびBに示すように、両方のグラフにおいて蛍光発光の傾向はほぼ同じです。倍数変化を、プレートリーダーは、異なる時間に記録された生の読みでいくつかのバリエーションが表示されている場合、データを分析するためのより便利な方法であり得ます。実験室は蛍光ではなく、プレートリーダーが装備されている場合、最終的に、各データポイントではなく、マイクロプレート、キュベットを用いて測定することができます。サイズOに応じて、利用可能なキュベットfは、アッセイで調製した溶液のボリュームを調整する必要があります。 本明細書で報告された方法は、chromatographic-する代替手段を提供し、および/または水性のGd 3+を検出するための分析に基づく技術。後者に比べて、Gdのセンサーアッセイは、複数種の同時検出のための感度、精度、および能力の点で、より制限されています。一方、分光ベースのセンサは、おそらくより容易に入手できる、より短い時間内に行ってもよいとすることができる機器を必要とし、試料調製は最小です。造影剤は、単にのGdセンサー溶液と混合し、緩衝液に溶解してもよいし、蛍光発光を直接測定します。さらに、センサは、キシレノールオレンジ指示薬（2つの方法の間の大きさの差の約2オーダー）より非キレート化のGd 3+の非常に低い濃度を検出することができるとありいくつかの他の生物学的に重要と遷移金属イオン9オーバーのGd 3+のためのより高い選択。 いくつかの実験条件の下でその使用が制限される可能性があり、このアッセイの2つの欠点があります。 1つの制限は、センサーが3+のGdに特異的ではないということです。それは、9（などのEu 3+とTbの3+などの ）他のランタニドイオンに対する応答が表示されます。しかし、これらは、一般に造影剤または生物学的システムに見出されるイオンはなく、従って、それらの干渉は最小です。注意すべき第二の点はのGd 3+、Gdのセンサー蛍光発光の漸減の（〜10μM以上の）高濃度で観察されることです。ランタニドイオンによる消光の効果も検出し、それらに14を定量化するための技術として使用されてきた十分に立証された現象で13です。これは、Gdの高濃度を測定するためのセンサの有用性を制限しながら、3+ </s&gt;まで、この設計の目的は、造影剤の高純度を保証するために、溶液中の遊離イオンの少量を検出することです。 この研究では、水溶液中で毒性非キレート化のGd 3+を検出するための便利な蛍光ベースの技術の使用が記載されています。このアッセイは、特にin vitro実験のための合成および製剤中に、ガドリニウムベースの造影剤純度の初期段階の評価のために意図されています。診断、磁気共鳴イメージングの現在の成長と、新規の造影剤の増加は、継続的に設計され、試験されています。アプタマーベースのGdセンサは、急速に、未反応のまたは周囲のpHの水溶液中でのGd 3+を解離のサブマイクロモル濃度の存在を検出するための手段を提供することによって、この開発を促進します。センサーは、他の三価のランタニドイオンとの交差反応性を表示するため、また、そのアプリケーションであってもよいです研究のこれらの領域に拡張。

技術固有の感度によって制限され、臨床診断、磁気共鳴イメージング（MRI）の重要性の高まりは、新規ガドリニウムベースの造影剤（GBCAs）1の開発の研究の急速な成長をもたらしました。 GBCAsは、画像品質を改善するために投与される分子であり、それらは、典型的には、多座配位子に配位価のガドリニウムイオン（Gdの3+）の化学構造を有します。非キレートのGd 3+は有毒であるように、この複合体形成は極めて重要です。それは、腎疾患または障害2と一部の患者における腎性全身性線維症の発症に関与しています。その結果、水性の遊離イオンを検出することがGBCAsの安全性を確保することに尽力しています。 GBCAソリューションの非キレート化のGd 3+の存在は、多くの場合、リガンドとイオン、複合体の解離、またはdisplacemen間の不完全な反応の結果であります他の生物学的金属カチオン3によってトン。 現在のGd 3+、汎用性および適用4の観点で最も高いクロマトグラフィーおよび/または分析のランクに依存するそれらの存在を決定するために使用されるいくつかの技術のうち。それらの長所の中でも、高感度および精度、（リストを、複数のGd 3+複合体の同時定量（ヒト血清5、尿及び毛髪6、廃水7、及び造影剤配合物8を含む） は 、種々のサンプルマトリックスを分析する能力であります研究の2013年前にはTelgmann ら ）4により包括的なレビューに記載されています。唯一の欠点は、これらの方法のいくつかは、いくつかの研究室がアクセス権を持っていないかもしれません（そのような誘導結合プラズマ質量分析など）計測器4を必要とすることです。研究や概念実証レベルでの新たなGBCA発見の文脈の中で、ARelativelyより、便利で迅速、かつ費用対効果の高い分光ベースの方法は、（例えば、UV-可視吸収または蛍光のような）価値のある代替物として機能することができます。心の中でこれらのアプリケーションでは、水のGd 3+のための蛍光アプタマーベースのセンサは9を開発しました。 アプタマー（GD-アプタマー）が指数関数的濃縮（SELEX）9によるリガンドの系統的進化の過程を経て単離した塩基の特定の配列を有する44塩基長の一本鎖DNA分子です。蛍光センサーにアプタマーを適応させるために、フルオロフォアは、その後13相補的塩基（ 図1）を介して急冷ストランド（QS）とハイブリダイズされた鎖の5 &#39;末端に結合しています。 QSは、3 &#39;末端ダーククエンチャー分子でタグ付けされています。 Gd 3+の非存在下では、1からなるセンサ（GD-センサー）：それぞれのGd-アプタマーとQSの2モル比は、最小の蛍光発光によるTを有していますクエンチャーへのフルオロフォアからOエネルギー移動。水性のGd 3+を添加すると、蛍光発光の増加をもたらす、のGd-アプタマーからQSを置換します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55216/55216fig1.jpg" /> フルオレセイン（蛍光団）とダブシルでタグ付けされた13塩基長の消光ストランド（QS）でタグ付けされた44塩基長のアプタマー（GD-アプタマー）（ダーククエンチャー）で構成され 、図1 のセンサ（GD-センサー） 。非キレート化のGd 3+の非存在下では、センサの蛍光は最小です。 Gd 3+を添加し、QSの変位が発生し、蛍光発光の増加が観察されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55216/55216fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 検出のための1つの一般的に使用される分光ベースの方法は、現在ではあり水性のGd 3+をる。このアッセイは、イオン10にキレート化時に433から573 nmの最大吸収波長のシフトを起こす分子キシレノールオレンジを使用しています。これら二つの吸光度最大値の比率は、非キレート化のGd 3+の量を定量するために使用することができます。 2つの方法は、標的選択性、定量の線形範囲は、検出様式（例えば、pH及び使用する緩衝液の組成など）は、異なる反応条件を有するようにアプタマーセンサーは、キシレノールオレンジアッセイに代わるもの（これも相補的であってもよい）であります9。

<table><tbody><tr><td>Gd-aptamer</td><td>IDTDNA</td><td>Input sequence and fluorophore modification in the order form</td><td>A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.</td></tr><tr><td>Quenching strand</td><td>IDTDNA</td><td>Input sequence and quencher modification in the order form</td><td>A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.</td></tr><tr><td>Molecular biology grade water</td><td></td><td></td><td>No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well</td></tr><tr><td>Gadolinium(III) chloride anhydrous</td><td>Strem</td><td>936416</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride anhydrous</td><td>MP Biomedicals</td><td>0520984480 - 100 g</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Acros Organics</td><td>327300025</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide, pellets</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359</td><td>Corrosive</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>Toxic and corrosive</td></tr><tr><td>384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates</td><td>Corning</td><td>3575</td><td>Plates which are suitable for fluorescence reading are required.</td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter</td><td>Thermo Scientific</td><td>5680020</td><td>The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane</td></tr><tr><td>Disposable sterile bottles 250 mL</td><td>Corning</td><td>430281</td><td>A larger or smaller bottle may be used</td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td></td><td></td><td>No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tubes</td><td></td><td></td><td>No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free</td></tr><tr><td>Micropipets</td><td></td><td></td><td>No specific manufacturer</td></tr><tr><td>Pipet tips (non filter) of appropriate sizes</td><td></td><td></td><td>No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Biotek Synergy H1</td><td></td><td>Plate readers from other manufacturers would work equally well</td></tr></tbody></table>

an aptamer-based sensor for unchelated gadolinium(iii)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd3+ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 - 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd3+ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd3+ in aqueous conditions.

非キレート化のGd 3+の存在下でのGdセンサ液の典型的な蛍光変化を、 図2に示されています。発光は、任意の単位（AFU）における蛍光倍数変化（ 図2A）又は読み出しの生の蛍光（ 図2B）としてプロットすることができます。両方のプロットは、1μMおよび&gt; 3μMでの信号の飽和以下のGd 3+の濃度について線形範囲で非常に類似した検量線が得られます。検出限界は、3つの信号対雑音比を有する〜100nmです。 関心のGBCAを含有する溶液において、非キレート化のGd 3+の存在は、「ブランク」溶液と比較して、センサの蛍光増加に変換されます。 Gd-DOTA複合体の2つの異なるバッチ、他よりも高い純度の1の溶液中の蛍光変化は、ショーです代表的な結果（ 図3）の例としては、N。 GD-DOTA（ガドテル酸）のGdガドリニウム錯体3+商業造影剤に見られる有機リガンドDOTAで囲まれています。より高純度のバッチのGd-DOTAの20 mmの放出までの有意な増加を表示しません。非キレート化のGd 3+が存在する場合、さらには5 mMの以下のGd-DOTA濃度で顕著に変化が観察されます。データ点は、センサの蛍光の倍率変化としてプロットされているこの例では、非キレート化のGd 3+の量の定量化は、 図2Aの較正曲線を用いて推定することができます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55216/55216fig2.jpg" /> 図2 の代表のGdセンサ蛍光較正曲線プロット。すべてのデータポイントは重複し、少なくとも行い、平均値をプロット値エラーバーとして標準偏差テッド。 （A）校正曲線は100nmでのGd-アプタマー200 nMのQSを用いて得られました。グラフはy軸として蛍光倍数変化でプロットされています。 （B）y軸として任意の単位（AFU）で生の蛍光を有する（A）と同一の検量線。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55216/55216fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55216/55216fig3.jpg" /> 図3. 代表のGd-センサーの蛍光変化 のGd-DOTA分子のサンプル中の 非キレート化のGd 3+ の存在をテストします 。 Gd-DOTA複雑なソリューションの二つの異なるバッチがこのプロットに示されているが、より高純度（円マーカー）およびその他を含む非キレート化のGd 3+の1（青trianglEマーカー）。各データ点は、エラーバーとしての標準偏差を有する2つの測定値の平均です。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55216/55216fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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An Aptamer-based Sensor for Unchelated GadoliniumIII

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

非キレート化ガドリニウム（III）のためのアプタマーベースのセンサー

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

an-aptamer-based-sensor-for-unchelated-gadolinium-iii

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

7.2K ビュー.  California State University, East Bay. The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor. 

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Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) complex and protocols for the preparation of its novel non-radioactive, i.e., natural Ga(III) as well as radioactive 68Ga complex. The ligand as well as the Ga(III) complex were characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, mass spectrometry and elemental analysis. 68Ga was obtained by a standard elution method from a 68Ge/68Ga generator. Experiments to evaluate the 68Ga-labeling efficiency of EOB-DTPA at pH 3.8&#8211;4.0 were performed. Established analysis techniques radio TLC (thin layer chromatography) and radio HPLC (high performance liquid chromatography) were used to determine the radiochemical purity of the tracer. As a first investigation of the 68Ga tracers&#39; lipophilicity the n-octanol/water distribution coefficient of 68Ga species present in a pH 7.4 solution was determined by an extraction method. In vitro stability measurements of the tracer in various media at physiological pH were performed, revealing different rates of decomposition.

Investigations on the GaIII Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

A procedure for the isolation of EOB-DTPA and subsequent complexation with natural Ga(III) and 68Ga is presented herein, as well as a thorough analysis of all compounds and investigations on labeling efficiency, in vitro stability and the n-octanol/water distribution coefficient of the radiolabeled complex.

EOB-DTPAとそのののGa（III）錯体に関する研究<sup&gt; 68</sup&gt; Gaの放射性標識アナログ

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

化学

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance imaging (MRI). Their purpose is to enhance the relaxation rate of water protons in tissue, thus increasing the MR image contrast and the specificity of the MRI measurements. Current clinically approved contrast agents are low molecular weight molecules that are rapidly cleared from the body. The use of dendrimers as carriers of paramagnetic chelators can play an important role in the future development of more efficient MRI contrast agents. Specifically, the increase in local concentration of the paramagnetic species results in a higher signal contrast. Furthermore, this CA provides a longer tissue retention time due to its high molecular weight and size. Here, we demonstrate a convenient procedure for the preparation of macromolecular MRI contrast agents based on poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers with monomacrocyclic DOTA-type chelators (DOTA &#8211; 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate). The chelating unit was appended by exploiting the reactivity of the isothiocyanate (NCS) group towards the amine surface groups of the PAMAM dendrimer to form thiourea bridges. Dendrimeric products were purified and analyzed by means of nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectrometry, and elemental analysis. Finally, high resolution MR images were recorded and the signal contrasts obtained from the prepared dendrimeric and the commercially available monomeric agents were compared.

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

This protocol describes the preparation and characterization of a dendrimeric magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent that carries cyclen-based macrocyclic chelates coordinating paramagnetic gadolinium ions. In a series of MRI experiments in vitro, this agent produced an amplified MRI signal when compared to the commercially available monomeric analogue.

調製と<em&gt;インビトロ</em&gt;磁気共鳴イメージングのためのデンドリマーベースの造影剤のキャラクタリゼーション

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance ...

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

低分子CLT1ペプチド標的造影剤を用いて前立腺がんの分子イメージングのMR

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

医学

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

マルチモーダル分子イメージングアプリケーションのためのBiofunctionalizedプルシアンブルーナノ粒子

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

生物工学

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect resulting in significant reductions in systemic toxicity. Nonetheless, insufficient release of encapsulated drug from liposomes has limited their clinical efficacy. Temperature-sensitive liposomes have been engineered to provide site-specific release of drug in order to overcome the problem of limited tumor drug bioavailability. Our lab has designed and developed a heat-activated thermosensitive liposome formulation of cisplatin (CDDP), known as HTLC, to provide triggered release of CDDP at solid tumors. Heat-activated delivery in vivo was achieved in murine models using a custom-built laser-based heating apparatus that provides a conformal heating pattern at the tumor site as confirmed by MR thermometry (MRT). A fiber optic temperature monitoring device was used to measure the temperature in real-time during the entire heating period with online adjustment of heat delivery by alternating the laser power. Drug delivery was optimized under magnetic resonance (MR) image guidance by co-encapsulation of an MR contrast agent (i.e.,&#160;gadoteridol) along with CDDP into the thermosensitive liposomes as a means to validate the heating protocol and to assess tumor accumulation. The heating protocol consisted of a preheating period of 5 min prior to administration of HTLC and 20 min heating post-injection. This heating protocol resulted in effective release of the encapsulated agents with the highest MR signal change observed in the heated tumor in comparison to the unheated tumor and muscle. This study demonstrated the successful application of the laser-based heating apparatus for preclinical thermosensitive liposome development and the importance of MR-guided validation of the heating protocol for optimization of drug delivery.

AN MRI-compatible&#160;custom-designed laser-based heating apparatus has been developed to provide local heating of subcutaneous tumors in order to activate release of agents from thermosensitive liposomes specifically at the tumor region.

磁気共鳴画像誘導による感熱リポソームからのシスプラチンのトリガリリースのためのカスタム設計されたレーザーベースの加熱装置

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient's cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

病の診断のためのポータブルイメージングおよび分析と相まって磁気浮上

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

<meta charset="utf8"></head><body>新規鉄キレート剤の検出のための蛍光アッセイ

Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target for anti-cancer approaches. The development of novel compounds and the identification of leads for further modification requires that proof of mechanism assays be carried out. There are many assays to evaluate the impact on proliferation; however, the ability to chelate iron is an important and sometimes overlooked end-point measure due to the high costs of equipment and the challenge to quickly and reproducibly quantify the strength of chelation. Here, we describe a quantifiable and inexpensive cell-free fluorescent method to confirm the ability of novel compounds to chelate iron. Our assay relies on the commercially available inexpensive fluorescent dye Calcein, whose fluorescence can be quantified on most fluorescent microtiter plate readers. Calcein is a weak iron chelator, and its fluorescence is quenched when it binds Fe2+/3+; fluorescence is restored when a novel chelator outcompetes Calcein for bound Fe2+/3+. The removal of fluorescent quenching and the resulting increase in fluorescence allows the chelation ability of a novel putative chelator to be determined. Therefore, we offer an inexpensive, high-throughput assay that allows the rapid screening of novel candidate chelator compounds.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:新規鉄キレート剤ががん細胞代謝に与える影響の評価

We describe a fluorescent assay that can quickly and inexpensively confirm the ability of novel compounds to chelate iron. The assay measures the ability of compounds to outcompete the iron binding activity of the weak iron chelating fluorescent probe Calcein, resulting in a quantifiable increase in fluorescence when chelation occurs.

新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法 

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target ...

がん研究

Automated Preparation of [68Ga]Ga-3BP-3940 on a Synthesis Module for PET Imaging of the Tumor Microenvironment

A fast, efficient method has been developed on the GAIA synthesis module for automated gallium-68 radiolabeling of 3BP-3940, a molecular imaging probe targeting the fibroblast activation protein for positron emission tomography imaging of the tumor microenvironment. The reaction conditions involved acetate buffer (final concentration: 0.1 M), methionine as an anti-radiolysis agent (final concentration: 5.4 mg/mL), and 30 &#181;g of 3BP-3940, with heating for 8 min at 98 &#176;C. A final purification step on a C18 cartridge was necessary to obtain a radiolabeled product of high purity. In contrast, the generator-produced 68Ga was used directly without a concentration step on a cation exchange cartridge. The production of three validation batches confirmed the method&#39;s reliability, allowing the synthesis of [68Ga]Ga-3BP-3940 in 22.3 &#177; 0.6 min with high radiochemical purity (RCP), as determined by both radio-HPLC (99.1% &#177; 0.1%) and radio-TLC (99.2% &#177; 0.1%). The average radiochemical yield, based on RCP values measured by radio-HPLC, was 74.4% &#177; 3.3%. The stability of the radiolabeled product was demonstrated for up to 4 h after preparation. This protocol provides a reliable, rapid, and efficient methodology for the preparation of [68Ga]Ga-3BP-3940, which can easily be transposed to a clinical setting.

This research describes the automated process for [68Ga]Ga-3BP-3940 production with the GAIA V2 synthesizer, for PET imaging of fibroblast activation protein. The results of quality control tests performed on three test batches are also presented.

腫瘍微小環境PETイメージングのための合成モジュール上の[68Ga]Ga-3BP-3940の自動調製

A fast, efficient method has been developed on the GAIA synthesis module for automated gallium-68 radiolabeling of 3BP-3940, a molecular imaging probe ...

非キレート化ガドリニウム（III）のためのアプタマーベースのセンサー

要約

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EOB-DTPAとそのののGa（III）錯体に関する研究

調製と

低分子CLT1ペプチド標的造影剤を用いて前立腺がんの分子イメージングのMR

マルチモーダル分子イメージングアプリケーションのためのBiofunctionalizedプルシアンブルーナノ粒子

磁気共鳴画像誘導による感熱リポソームからのシスプラチンのトリガリリースのためのカスタム設計されたレーザーベースの加熱装置

病の診断のためのポータブルイメージングおよび分析と相まって磁気浮上

新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法

新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法

新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法

腫瘍微小環境PETイメージングのための合成モジュール上の[⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940の自動調製