We would like to gratefully acknowledge Dr. Milan N Stojanovic from Columbia University, New York, NY for valuable scientific input. This work is supported by funding from the California State University East Bay (CSUEB) and the CSUEB Faculty Support Grant-Individual Researcher. O.E., T.C., and A.L. were supported by the CSUEB Center for Student Research (CSR) Fellowship.

HINWEIS: die Molekularbiologie Wasser wird in allen Puffer und Lösungs-Präparate eingesetzt. Alle Einweg-Röhrchen (Mikro und PCR) und Pipettenspitzen sind DNase- und RNase-frei. Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblatt (MSDS) für alle Chemikalien vor der Verwendung. Einsatz einer persönlichen Schutzausrüstung (PSA) wird dringend empfohlen. 1. Herstellung der Stammlösungen Aptamer <ol><li> kommerziell Kauf 2 Stränge von Polydesoxynukleotid-. Um beide Stränge mit Reinigung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Strand 1 (Gd-Aptamer): 5 &#39;- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3&#39; Strand 2 (QS): 5&#39;-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 &#39; </li><li> Man löst jeder Strang in Wasser auf 100 &amp; mgr; M einzelnen Stammlösungen des Gd-Aptamer und dem QS machen. </li><li> Bewahren Sie diese Lösungen bei -20 ° C. Die Lösungen sind stabil bisher, für 3 Jahre. </li><li> Zur Minimierung der freeze-Auftau-Zyklen, speichern Sie die Stammlösungen in 10 &amp; mgr; l-Aliquots. </li></ol> 2. Herstellung des 2x Gd-Sensorlösung <ol><li> Vorbereitung der Testpuffer (20 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, 150 mM NaCl, 5 mM KCl). Stellen Sie den pH-Wert auf ~ 7,4 mit NaOH und HCl, und filtriert durch sterile Einwegflasche Top-Filter mit 0,2 um PES-Membran. Lagern Sie in sterile Flaschen. Wenn filtriert und richtig gespeichert (bei Raumtemperatur), ist der Puffer bisher stabil, für 2 Jahre. </li><li> Verdünnen Sie 1 ul des Gd-Aptamer-Stammlösung (aus Schritt 1.2) und 2 ul der QS-Stammlösung (aus Schritt 1.2) in 497 &amp; mgr; l Testpuffer. Gut mischen einen Wirbel verwenden. Ihre Konzentrationen in der 2x Gd-Sensorlösung werden 200 nM und 400 nM. HINWEIS: Das Volumen des 2x Gd-Sensorlösung in diesem Schritt hergestellt wird , ist 500 &amp; mgr; L, der 6 zu testen ausreicht - 7 verschiedene Konzentrationen von Gd 3+ für die Kalibrierungskurve und der Kontrastmittel - Lösungen(Schritt 3). Jede Probe geben Dublikatmulden in einer 384-Well-Platte. <ol><li> Stellen Sie die Lautstärke des 2x Gd-Sensorlösung entsprechend der Anzahl von Gd 3+ Lösungen , die getestet werden muss. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die 2x Gd-Sensorlösung in 9 PCR-Röhrchen, mit 50 &amp; mgr; l in jedes Röhrchen. Die Röhrchen in einen Thermocycler. </li><li> Stellen Sie das Programm in den Thermocycler die Lösung in den Rohren bis 95 ° C zu erhitzen, Halten für 5 min und dann langsam abkühlen, die Lösungen auf 25 ° C über ca. 15 min (mit einer Rate von ~ 0,05-0,1 ° C / s). Die Heiz- und Kühlkreislauf ist eine optimale Hybridisierung zwischen dem Gd-Aptamer und dem QS zu gewährleisten. Teilhybridisierungsergebnisse in unvollständigem Abschrecken und eine höhere Hintergrundfluoreszenz des Sensors. Wenn ein Thermocycler nicht verfügbar ist, führen Sie diesen Prozess stattdessen ein heißes Wasserbad. </li><li> Nach dem Abkühlen auf 25 ° C, verwenden Sie sofort die Lösung, oder halten Sie in den Thermocycler (bis ca. 2 h), bis sie bereit zu seinbenutzt. Wenn ein Wasserbad für die Heizung verwendet wird, lassen Sie die Rohre im Bad, da das Wasser kühlt langsam auf Raumtemperatur. </li></ol> 3. Konstruieren der Fluoreszenz - Kalibrierungskurve und Nachweis der Anwesenheit von unchelatisierte Gd 3+ in einer Lösung von Gd Kontrastmittel <ol><li> Man löst GdCl 3 Feststoff in dem Testpuffer (den gleichen Puffer , wie in Schritt 2.1). </li><li> Durch Reihenverdünnung, Herstellung von 100 &amp; mgr; l von jeweils 6 verschiedenen Gd 3+ Lösungen in Mikrozentrifugenröhrchen bei Doppel der endgültigen gewünschten Konzentrationen für die Eichkurve (2x Lösungen). <ol><li> Um zum Beispiel eine Kalibrierung für 0 (nur Puffer ohne GdCl 3) zu konstruieren, 50, 100, 200, 400 und 800 nM von Gd 3+, werden die Lösungen , die 0, 100, 200, 400, 800 und 1600 nM des Ions. Achten Sie darauf, immer auch die &#39;blank&#39; mit 0 nM Gd 3+ als negative Kontrolle. </li></ol></li><li> Man löst das Kontrastmittel-Test zu seinin dem Assaypuffer ed. Bereiten 2 oder 3 verschiedenen Konzentrationen der Kontrastmittel-Lösungen über serielle Verdünnung. HINWEIS: Test 3 verschiedenen Konzentrationen des Kontrastmittellösung empfohlen. Damit soll sichergestellt werden, dass diese Konzentrationen im linearen Bereich liegen. Wenn die getesteten Proben keine lineare Beziehung anzuzeigen, verwendet, um die Konzentrationen des Kontrastmittels verringern. </li><li> Nehmen Sie die PCR-Röhrchen, die 2x Gd-Sensor-Lösung aus Schritt 2.5 aus dem Thermocycler enthält. </li><li> In 50 ul jeder Gd 3+ Lösung aus Schritt 3.2 in 6 der 9 PCR - Röhrchen , die 2x Gd-Sensorlösung enthält. Mischen durch Pipettieren von oben und unten. Jedes PCR - Röhrchen enthält nun die gewünschte Konzentration von Gd 3+ getestet werden, 100 nM Gd-Aptamer und 200 nM QS. </li><li> Zu der verbleibenden PCR-Röhrchen die 2x Gd-Sensorlösung enthält, werden 50 ul der Kontrastmittel-Lösungen aus Schritt 3.3. Gut mischen durch Pipettieren nach oben und unten ein paar Mal. </li><li> Inkubieren Sie die solutions in den PCR-Röhrchen ca. 5 min bei Raumtemperatur. Sie können bis zu 30 Minuten stehen gelassen werden. </li><li> Übertragen Sie 45 ul jeder Röhre in eine 384-Well-Platte. Jedes PCR-Röhrchen geben Dublikatmulden. </li><li> Notieren Sie sich die Fluoreszenz von jeder Vertiefung auf einem Plattenleser. Das Fluorophor (FAM), die in dem Gd-Sensor-Design hat Anregungs- und Emissionsmaxima von 495 und 520 nm sind, wie auf der Website des Herstellers aufgeführt. Wählen geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen oder Filter abhängig davon, ob der Plattenleser ist monochromator- oder Filterbasis. </li><li> Zeichnen Sie die graphische Darstellung der Fluoreszenz in willkürlichen Fluoreszenzeinheiten (AFU) gegen die Konzentration von Gd 3+. </li><li> Zeichnen Sie die Grafik als Fluoreszenz - fache Veränderung gegen die Konzentration von Gd 3+. Berechnen Sie die Fluoreszenz - fache Veränderung durch das AFU jeder Konzentration durch das AFU des &#39;leeren&#39; Lösung Teilen (mit 0 nM von Gd 3+). Die Fluoreszenz-fache Änderung wird für die n erlaubenormalization der Ergebnisse sollte die AFU Display einige periodische (verschiedene Tage, etc.) Variationen. </li><li> Vergleichen der Fluoreszenzemission der Lösung des Kontrastmittels und die &quot;leere&quot; enthalten, die die Lösung ist , die 0 nM GdCl 3 (nur Puffer). HINWEIS: Eine höhere Fluoreszenz der GBCA Lösung impliziert die Anwesenheit von unchelatisierten Gd 3+, die weitere Reinigung des Kontrastmittels erforderlich machen kann. Die Menge an unchelatisierte Gd 3+ vorhanden kann in Schritt 3.10 oder 3.11 konstruiert unter Verwendung der Eichkurve abgeschätzt werden. </li></ol>

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<li>Johansson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+reporter-quencher+pairs+for+efficient+quenching+through+formation+of+intramolecular+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers.</a> Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).</li>
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<li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicrogram+determination+of+lanthanides+through+quenching+of+calcein+blue+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence.</a> Anal. Chem. 59 (8), 1122-1125 (1987).</li>
</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Verwendung der Aptamer-basierten Gd-Sensor, ein Anstieg in der Fluoreszenzemission , die auf die Konzentration des unchelatisierten Gd 3+ proportional ist beobachtet wird . Um die Menge der Probe zu minimieren verwendet wird, kann der Test in einem 384-Well-Mikroplatten mit einer Gesamtprobenvolumen von 45 &amp; mgr; l pro Vertiefung ausgeführt werden. In dieser Konstruktion ist die Wahl von Fluorescein (FAM) und DABCYL (Dab) wurde auf die Kosten der Reagenzien basieren in erster Linie; die Emissionswellenl?...

Die zunehmende Bedeutung der Kernspintomographie (MRI) in der klinischen Diagnose, die durch die inhärente Empfindlichkeit der Technik begrenzt ist, hat in dem schnellen Wachstum der Forschung in die Entwicklung von neuartigen Gadolinium-Kontrastmitteln (GBCAs) 1 geführt. GBCAs sind Moleküle , die verabreicht werden , um die Bildqualität zu verbessern, und sie haben typischerweise die chemische Struktur eines dreiwertigen Gadolinium - Ion (Gd 3+) zu einem mehrzähnigen Liganden koordiniert. Diese Komplexbildung ist von entscheidender Bedeutung , da unchelatisierten Gd 3+ ist giftig; es wurde bereits 2 in der Entwicklung von nephrogener systemische Fibrose bei einigen Patienten mit Nierenerkrankung oder Versagen gebracht. Folglich wird die wäßrige freie Ionen Erfassungs dazu bei, die Sicherheit der GBCAs gewährleisten. Die Anwesenheit von unchelatisierten Gd 3+ in GBCA Lösungen ist oft das Ergebnis einer unvollständigen Reaktion zwischen dem Liganden und dem Ion, Dissoziation des Komplexes oder displacement durch andere biologische Metallkationen 3. Unter den verschiedenen Techniken , die derzeit zur Bestimmung der Anwesenheit von Gd 3+, diejenigen , die sich auf Chromatographie und / oder Spektrometrie Rang höchsten in Bezug auf Vielseitigkeit und Anwendbarkeit 4. Unter ihren Stärken sind eine hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit, die Fähigkeit , verschiedene Matrices (einschließlich humanem Serum 5, Urin und Haar 6, Abwasser 7 und Kontrastmittelformulierungen 8) und die gleichzeitige Quantifizierung von mehreren Gd 3+ Komplexe (eine Auflistung zu analysieren vor dem Jahr 2013 von Studien in einer umfassenden Überprüfung von Telgmann et al.) 4. Der einzige Nachteil ist , dass mehrere dieser Verfahren erfordern Instrumentierungen (wie induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie) 4 , dass einige Laboratorien haben möglicherweise keinen Zugriff auf. Im Rahmen der neuen GBCA Entdeckung an der Forschung und Proof-of-Concept-Ebenen, arelatively bequemer, schneller und kostengünstiger spektroskopischen-basierte Verfahren (wie UV-Vis-Absorption oder Fluoreszenz) kann als eine wertvolle Alternative dienen. Mit diesen Anwendungen im Blick, ein fluoreszierendes Aptamer-basierten Sensor für wässrige Gd 3+ wurde 9 entwickelt. Das Aptamer (Gd-Aptamer) ist ein 44-Basen langen einzelsträngigen DNA - Moleküls mit einer bestimmten Sequenz von Basen , die durch den Prozess der systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) 9 isoliert. Um das Aptamer in einen Fluoreszenzsensor anzupassen, ein Fluorophor an das 5&#39; - Ende des Stranges befestigt sind , die dann mit einem Quenching Strang (QS) über 13 komplementären Basen (Abbildung 1) hybridisiert ist. Der QS ist mit einem dunklen Quencher-Molekül am 3&#39;-Terminus markiert. In der Abwesenheit von Gd 3+, dem Sensor (Gd-Sensor), einer 1 umfasste: 2 - Molverhältnis von Gd-Aptamer und QS bzw. haben, minimale Fluoreszenzemission aufgrund to Energieübertragung von dem Fluorophor zu dem Quencher. Die Zugabe von wässrigem Gd 3+ das QS vom Gd-Aptamer, was zu einem Anstieg in der Fluoreszenzemission verdrängen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55216/55216fig1.jpg" /> Abbildung 1. Der Sensor (Gd-Sensor), der mit Fluorescein (ein Fluorophor) und dem langen Lösch Strang (QS) getaggt mit Dabcyl (ein dunkler Löscher) 13-Basis (Gd-Aptamer) markiert 44-base lange Aptamer besteht . In Abwesenheit von unchelatisierten Gd 3+, die Fluoreszenz des Sensors ist minimal. Mit Zugabe von Gd 3+, Verschiebung des QS auftritt und eine Erhöhung der Fluoreszenzemission beobachtet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55216/55216fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55216/55216fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Es ist derzeit, eine häufig verwendete spektroskopische basiertes Verfahren zur Erkennunging wässrigen Gd 3+. Dieser Assay verwendet das Molekül Xylenolorange, die 433 bis 573 nm auf Chelatisierung an die Ionen 10 eine Verschiebung der maximalen Absorptionswellenlänge unterzogen wird . Das Verhältnis dieser zwei Absorptionsmaxima können verwendet werden , um die Menge des unchelatisierten Gd 3+ zu quantifizieren. Das Aptamer Sensor ist eine Alternative (kann auch komplementär sein) an den Xylenolorange-Test, als die beiden Verfahren unterschiedliche Reaktionsbedingungen (wie beispielsweise pH und der Zusammensetzung der Pufferlösungen verwendet wird) haben, Ziel Selektivitäten, linearen Bereichen der Quantifizierung und Erfassungsmodalitäten 9.

<table><tbody><tr><td>Gd-aptamer</td><td>IDTDNA</td><td>Input sequence and fluorophore modification in the order form</td><td>A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.</td></tr><tr><td>Quenching strand</td><td>IDTDNA</td><td>Input sequence and quencher modification in the order form</td><td>A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.</td></tr><tr><td>Molecular biology grade water</td><td></td><td></td><td>No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well</td></tr><tr><td>Gadolinium(III) chloride anhydrous</td><td>Strem</td><td>936416</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride anhydrous</td><td>MP Biomedicals</td><td>0520984480 - 100 g</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Acros Organics</td><td>327300025</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide, pellets</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359</td><td>Corrosive</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>Toxic and corrosive</td></tr><tr><td>384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates</td><td>Corning</td><td>3575</td><td>Plates which are suitable for fluorescence reading are required.</td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter</td><td>Thermo Scientific</td><td>5680020</td><td>The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane</td></tr><tr><td>Disposable sterile bottles 250 mL</td><td>Corning</td><td>430281</td><td>A larger or smaller bottle may be used</td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td></td><td></td><td>No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tubes</td><td></td><td></td><td>No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free</td></tr><tr><td>Micropipets</td><td></td><td></td><td>No specific manufacturer</td></tr><tr><td>Pipet tips (non filter) of appropriate sizes</td><td></td><td></td><td>No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Biotek Synergy H1</td><td></td><td>Plate readers from other manufacturers would work equally well</td></tr></tbody></table>

an aptamer-based sensor for unchelated gadolinium(iii)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd3+ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 - 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd3+ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd3+ in aqueous conditions.

Eine typische Fluoreszenzänderung des Gd-Sensorlösung in Gegenwart von unchelatisierten Gd 3+ ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Emission kann als die Fluoreszenz - fache Veränderung (2A) oder die rohe Fluoreszenzablesen (2B) in willkürlichen Einheiten aufgetragen werden (AFU). Beide Diagramme ergeben sehr ähnliche Eichkurven mit einem linearen Bereich für die Konzentration von Gd 3+ unter 1 &amp; mgr; M und ...

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An Aptamer-based Sensor for Unchelated GadoliniumIII

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

Ein Aptamer-basierten Sensor für unchelatisierte Gadolinium (III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

7.2K Aufrufe.  California State University, East Bay. The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor. 

Serie: An Aptamer-based Sensor for Unchelated GadoliniumIII

Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) complex and protocols for the preparation of its novel non-radioactive, i.e., natural Ga(III) as well as radioactive 68Ga complex. The ligand as well as the Ga(III) complex were characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, mass spectrometry and elemental analysis. 68Ga was obtained by a standard elution method from a 68Ge/68Ga generator. Experiments to evaluate the 68Ga-labeling efficiency of EOB-DTPA at pH 3.8&#8211;4.0 were performed. Established analysis techniques radio TLC (thin layer chromatography) and radio HPLC (high performance liquid chromatography) were used to determine the radiochemical purity of the tracer. As a first investigation of the 68Ga tracers&#39; lipophilicity the n-octanol/water distribution coefficient of 68Ga species present in a pH 7.4 solution was determined by an extraction method. In vitro stability measurements of the tracer in various media at physiological pH were performed, revealing different rates of decomposition.

Investigations on the GaIII Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

A procedure for the isolation of EOB-DTPA and subsequent complexation with natural Ga(III) and 68Ga is presented herein, as well as a thorough analysis of all compounds and investigations on labeling efficiency, in vitro stability and the n-octanol/water distribution coefficient of the radiolabeled complex.

Untersuchungen über die Ga (III) -Komplexes von EOB-DTPA and Its<sup&gt; 68</sup&gt; Ga Radiolabeled Analog

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

Forschung

Chemie

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance imaging (MRI). Their purpose is to enhance the relaxation rate of water protons in tissue, thus increasing the MR image contrast and the specificity of the MRI measurements. Current clinically approved contrast agents are low molecular weight molecules that are rapidly cleared from the body. The use of dendrimers as carriers of paramagnetic chelators can play an important role in the future development of more efficient MRI contrast agents. Specifically, the increase in local concentration of the paramagnetic species results in a higher signal contrast. Furthermore, this CA provides a longer tissue retention time due to its high molecular weight and size. Here, we demonstrate a convenient procedure for the preparation of macromolecular MRI contrast agents based on poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers with monomacrocyclic DOTA-type chelators (DOTA &#8211; 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate). The chelating unit was appended by exploiting the reactivity of the isothiocyanate (NCS) group towards the amine surface groups of the PAMAM dendrimer to form thiourea bridges. Dendrimeric products were purified and analyzed by means of nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectrometry, and elemental analysis. Finally, high resolution MR images were recorded and the signal contrasts obtained from the prepared dendrimeric and the commercially available monomeric agents were compared.

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

This protocol describes the preparation and characterization of a dendrimeric magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent that carries cyclen-based macrocyclic chelates coordinating paramagnetic gadolinium ions. In a series of MRI experiments in vitro, this agent produced an amplified MRI signal when compared to the commercially available monomeric analogue.

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung der für Magnetresonanz-Kontrastmittel Dendrimer-basierten

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance ...

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

MR Molekulare Bildgebung von Prostatakrebs mit einem kleinen Molecular Targeted CLT1 Peptid-Kontrastmittel

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Medizin

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Biofunktionalisierten Prussian Blue Nanopartikel für Molekulare Bildgebung Multimodale Anwendungen

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Biotechnik

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect resulting in significant reductions in systemic toxicity. Nonetheless, insufficient release of encapsulated drug from liposomes has limited their clinical efficacy. Temperature-sensitive liposomes have been engineered to provide site-specific release of drug in order to overcome the problem of limited tumor drug bioavailability. Our lab has designed and developed a heat-activated thermosensitive liposome formulation of cisplatin (CDDP), known as HTLC, to provide triggered release of CDDP at solid tumors. Heat-activated delivery in vivo was achieved in murine models using a custom-built laser-based heating apparatus that provides a conformal heating pattern at the tumor site as confirmed by MR thermometry (MRT). A fiber optic temperature monitoring device was used to measure the temperature in real-time during the entire heating period with online adjustment of heat delivery by alternating the laser power. Drug delivery was optimized under magnetic resonance (MR) image guidance by co-encapsulation of an MR contrast agent (i.e.,&#160;gadoteridol) along with CDDP into the thermosensitive liposomes as a means to validate the heating protocol and to assess tumor accumulation. The heating protocol consisted of a preheating period of 5 min prior to administration of HTLC and 20 min heating post-injection. This heating protocol resulted in effective release of the encapsulated agents with the highest MR signal change observed in the heated tumor in comparison to the unheated tumor and muscle. This study demonstrated the successful application of the laser-based heating apparatus for preclinical thermosensitive liposome development and the importance of MR-guided validation of the heating protocol for optimization of drug delivery.

AN MRI-compatible&#160;custom-designed laser-based heating apparatus has been developed to provide local heating of subcutaneous tumors in order to activate release of agents from thermosensitive liposomes specifically at the tumor region.

Kundenspezifische Laser-basierte Heizvorrichtung zum ausgelöste Freisetzung von Cisplatin von wärmeempfindlichen Liposomen mit Magnet-Resonanz-Bild Anleitung

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient's cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

Magnetic Levitation Gekoppelt mit tragbaren Imaging und Analyse für Krankheitsdiagnostik

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

<meta charset="utf8"></head><body>Fluoreszierender Assay zum Nachweis neuartiger Eisenchelatoren

Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target for anti-cancer approaches. The development of novel compounds and the identification of leads for further modification requires that proof of mechanism assays be carried out. There are many assays to evaluate the impact on proliferation; however, the ability to chelate iron is an important and sometimes overlooked end-point measure due to the high costs of equipment and the challenge to quickly and reproducibly quantify the strength of chelation. Here, we describe a quantifiable and inexpensive cell-free fluorescent method to confirm the ability of novel compounds to chelate iron. Our assay relies on the commercially available inexpensive fluorescent dye Calcein, whose fluorescence can be quantified on most fluorescent microtiter plate readers. Calcein is a weak iron chelator, and its fluorescence is quenched when it binds Fe2+/3+; fluorescence is restored when a novel chelator outcompetes Calcein for bound Fe2+/3+. The removal of fluorescent quenching and the resulting increase in fluorescence allows the chelation ability of a novel putative chelator to be determined. Therefore, we offer an inexpensive, high-throughput assay that allows the rapid screening of novel candidate chelator compounds.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Bewertung der Auswirkungen neuartiger Eisenchelatoren auf den Stoffwechsel von Krebszellen

We describe a fluorescent assay that can quickly and inexpensively confirm the ability of novel compounds to chelate iron. The assay measures the ability of compounds to outcompete the iron binding activity of the weak iron chelating fluorescent probe Calcein, resulting in a quantifiable increase in fluorescence when chelation occurs.

Quantifizierbare und kostengünstige zellfreie Fluoreszenzmethode zur Bestätigung der Fähigkeit neuartiger Verbindungen, Eisen zu chelatisieren 

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target ...

Krebsforschung

Automated Preparation of [68Ga]Ga-3BP-3940 on a Synthesis Module for PET Imaging of the Tumor Microenvironment

A fast, efficient method has been developed on the GAIA synthesis module for automated gallium-68 radiolabeling of 3BP-3940, a molecular imaging probe targeting the fibroblast activation protein for positron emission tomography imaging of the tumor microenvironment. The reaction conditions involved acetate buffer (final concentration: 0.1 M), methionine as an anti-radiolysis agent (final concentration: 5.4 mg/mL), and 30 &#181;g of 3BP-3940, with heating for 8 min at 98 &#176;C. A final purification step on a C18 cartridge was necessary to obtain a radiolabeled product of high purity. In contrast, the generator-produced 68Ga was used directly without a concentration step on a cation exchange cartridge. The production of three validation batches confirmed the method&#39;s reliability, allowing the synthesis of [68Ga]Ga-3BP-3940 in 22.3 &#177; 0.6 min with high radiochemical purity (RCP), as determined by both radio-HPLC (99.1% &#177; 0.1%) and radio-TLC (99.2% &#177; 0.1%). The average radiochemical yield, based on RCP values measured by radio-HPLC, was 74.4% &#177; 3.3%. The stability of the radiolabeled product was demonstrated for up to 4 h after preparation. This protocol provides a reliable, rapid, and efficient methodology for the preparation of [68Ga]Ga-3BP-3940, which can easily be transposed to a clinical setting.

This research describes the automated process for [68Ga]Ga-3BP-3940 production with the GAIA V2 synthesizer, for PET imaging of fibroblast activation protein. The results of quality control tests performed on three test batches are also presented.

Automatisierte Präparation von [68Ga]Ga-3BP-3940 auf einem Synthesemodul für die PET-Bildgebung der Tumormikroumgebung

A fast, efficient method has been developed on the GAIA synthesis module for automated gallium-68 radiolabeling of 3BP-3940, a molecular imaging probe ...

Ein Aptamer-basierten Sensor für unchelatisierte Gadolinium (III)

Zusammenfassung

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Untersuchungen über die Ga (III) -Komplexes von EOB-DTPA and Its

Vorbereitung und

MR Molekulare Bildgebung von Prostatakrebs mit einem kleinen Molecular Targeted CLT1 Peptid-Kontrastmittel

Biofunktionalisierten Prussian Blue Nanopartikel für Molekulare Bildgebung Multimodale Anwendungen

Kundenspezifische Laser-basierte Heizvorrichtung zum ausgelöste Freisetzung von Cisplatin von wärmeempfindlichen Liposomen mit Magnet-Resonanz-Bild Anleitung

Magnetic Levitation Gekoppelt mit tragbaren Imaging und Analyse für Krankheitsdiagnostik

Quantifizierbare und kostengünstige zellfreie Fluoreszenzmethode zur Bestätigung der Fähigkeit neuartiger Verbindungen, Eisen zu chelatisieren

Quantifizierbare und kostengünstige zellfreie Fluoreszenzmethode zur Bestätigung der Fähigkeit neuartiger Verbindungen, Eisen zu chelatisieren

Quantifizierbare und kostengünstige zellfreie Fluoreszenzmethode zur Bestätigung der Fähigkeit neuartiger Verbindungen, Eisen zu chelatisieren

Automatisierte Präparation von [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940 auf einem Synthesemodul für die PET-Bildgebung der Tumormikroumgebung