Funding Sources: The University of Arizona, The Jim Himelic Foundation, and the Arizona Center for the Biology of Complex Diseases.

hiPSCsは4ミリメートルの皮膚パンチ生検から単離されたヒト皮膚線維芽細胞に由来し、センダイウイルス媒介リプログラミング11を 介して家の中に再プログラムされました。アリゾナ大学の治験審査委員会は、被験者の募集と生検コレクションのすべての手順を承認しました。 IPSC文化のための細胞外マトリックスコーティングされた表面の調製<ol><li>前日iMEFsに成長しているhiPSC文化の合流点に、細胞外マトリックス（マトリゲル）でコーティングされたプレートを準備します。 </li><li>緩慢解凍は、細胞外マトリックスのアリコート2時間4℃で氷の上で（依存多くは、仕様書の指示に従ってください）。 </li><li>バイオセーフティフードでは、（-20℃で保存）冷たいピペットチップを使用して、多くの特定の希釈率に係る冷ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F-12（DMEM / F12 / HEPES）に、細胞外マトリックスの1アリコートを追加。 </li><li>ディスペンス〜60081;それぞれの新しい細胞培養ウェル当たり細胞外マトリックスのLは、必要に応じて12ウェルプレートを処理しました。 </li><li>室温で数時間プレートをインキュベートします。ここでは、3時間のインキュベーション時間を使用します。 注意：プレートを直ちに使用するか、または2週間まで4℃で保存することができます。 </li></ol>伝播の細胞外マトリックス上にiMEFフィーダー細胞上に成長させたhiPSCsの2.転送<ol><li>継代の日に、4°Cからマトリックスコートしたプレートを取り外し、プレートを組織培養フード中で1時間室温に順応することを可能にします。 </li><li>吸引しiMEFsに成長しているhiPSC文化の6ウェルプレートの1ウェルから培地および500μLのコラゲナーゼ解離試薬（基礎的培養液中1mg / mL）で交換してください。 </li><li> IPSCコロニーの縁が少し持ち上げるように表示されるまで30分 - 〜10 37℃でインキュベートします。 注：インキュベーション時間がラインに依存し、変化します。顕微鏡下で解離を監視します。 </li><li>車efully解離試薬を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）で穏やかに2回洗浄します。 </li><li>ウェルに10ng / mLのRho関連タンパク質キナーゼ阻害剤（Y-27632のROCK阻害剤）を用いて室温mTeSR1完全培地の1 mLを加え。 注：この最初の通過中にiMEF馴化培地とmTeSR1の50:50混合物を使用することは示唆されており、このメディア移行中hiPSCsの生存のために有益であり得ます。 </li><li>手動スコアと1ピック、フードの内側に部分的に配置された小さな位相差顕微鏡を使用して - 2 hiPSCコロニーを（〜700 - 直径が1000μm）注射器と針（25 G、1.5で）を使用。 P200のピペットチップを用いて培地にコロニーの得点の作品をオフにプッシュします。 </li><li>コーティングを乱さないように注意しながら、新しいプレートからマトリックスで吸引し、廃棄してください。 </li><li>転送ウェルコーティングされた新しい行列に決めたiPS細胞を含む古いから細胞懸濁液の1ミリリットル。 </li><li>プラ37℃、5％CO 2のインキュベーター中のCeプレート。細胞を均一に広げるために、いくつかのクイック、前後、および横方向の動きにプレートを揺らし。 24時間プレートを邪魔しないでください。 </li><li> mTeSR1完全培地（Y-27632 ROCK阻害剤を添加するステップ2.5での最初のプレーティング後に必要とされていない）との毎日の完全メディアの変更を行います。 </li></ol>マトリックスでコーティングされたプレート上のhiPSCsの3小規模継代注：一般的に、コーティングされたプレートをマトリックスにhiPSCsの初期転送した後、細胞はすべてiMEFsが排除されており、細胞が無フィーダー条件に適合していることを確認するために、同様の方法でもう一度継代する必要があります。 <ol><li>セクション1で説明したように前IPSCの密集度に一日を新たにコーティングされたマトリックスプレートを準備します。 </li><li>通路の日に、4℃のインキュベーションからマトリックスコーティングされたプレートを取り外し、プレートを組織CULで1時間室温に順応することを可能にしますトゥーレフード。 </li><li> （当初は行列にフィーダーから移行）hiPSCsの6ウェルプレートの1ウェルから培地を吸引し、500μLの細胞解離緩衝液と交換してください。 注：ここで使用した市販の細胞解離緩衝液は、（材料表を参照）、コラゲナーゼと比較して、mTeSR1媒体での使用に適しています。 </li><li> IPSCコロニーの縁が少し持ち上げるように表示されるまで7分 - 3室温でインキュベートします。前に述べたように、インキュベーション時間は、ライン従属変数です。したがって、最適な時間を決定するために、顕微鏡下で細胞の解離を監視します。 </li><li>慎重に解離緩衝液を吸引し、PBSで穏やかに2回洗浄します。 </li><li>ウェルに10ng / mLのY-27632のROCK阻害剤を用いて室温mTeSR1完全培地500μLを追加します。 </li><li>代わりに、ステップ2.6のようにスコアリングコロニーの、P200チップを使用してメディアにコロニーの所望の数をプッシュし、静かに細胞懸濁液を2倍のAGを粉砕しますサイズは200ミクロン - 〜50の塊にhiPSCコロニーを破壊するだけでなくの一角ainst。各1新しいウェルに転送するために2個のコロニー - 例えば、12ウェルプレートについて、1を選択します。 12ウェルプレートの単一の新しいウェルに古いから細胞懸濁液を転送します。 </li><li>細胞を均一に広げ、37℃、5％CO 2インキュベーター中で24時間プレート残りをさせるためにいくつかの迅速、前後、および横方向の動きにプレートを揺らし。 </li><li> mTeSR1完全培地を毎日フルメディアの変更を行います。前述のように、最初のプレーティング後のY-27632 ROCK阻害剤を添加する必要はありません。 注：ステップ3.7から未使用のIPSCのコロニーは、この時点で、容易に凍結保存することができます。 </li></ol>免疫細胞化学のためのhiPSCsの播種のための商工会議スライドとカバーガラスの4準備注：以下のプロトコルは、4ウェルのプラスチックチャンバースライドとappropriatと12ミリメートルのガラスカバースリップを利用しますマルチウェル中のメディアの電子ボリュームは、費用対効果の高い免疫細胞化学をサポートします。大きなウェルカバースリップサイズの使用が望まれる場合は、メディア・ボリュームを増大させることができます。 <ol><li>前hiPSCの合流点にある日、セクション1で説明したように十分なマトリックス溶液を追加したばかりの細胞外マトリックスでコーティングされたチャンバースライドを準備する（〜300から4ウェルチャンバースライドのウェルあたり500μL）だけでなく、任意の心配せずに完全にコートそれぞれに蒸発。代わりに、24ウェルプレートの各ウェルに1洗浄・滅菌カバースリップを配置した後、500μLの細胞外マトリックスでコーティングし、カバーガラスを溶液の上に浮いていないことを確認します。 </li><li>通路の日に、4°Cからコーティングチャンバースライド/カバースリップを除去し、組織培養フード中で1時間室温に順化を可能にします。 </li><li> hiPSCsの12ウェルプレートの1ウェルから培地を吸引し、500μLの解離緩衝液と交換してください。 </li><li>部屋テンペでインキュベート〜3 rature - IPSCコロニーの縁まで7分はわずかに持ち上げるように見えます。 </li><li>慎重に解離緩衝液を吸引し、ウェルに10ng / mLのY-27632 ROCK阻害剤を用いて室温mTeSR1完全培地の1 mLを加え。 </li><li>組織培養フードの内部に配置され、小さな位相差顕微鏡を使用して、手動で（〜千 - 直径が1500μm）をメッキする4ウェルチャンバースライドまたは1新しいカバースリップの1コロニー/新しい井戸を選ぶ押すことにより、P200のピペットチップを使用してそれ培地へプレート表面オフ。 </li><li>コーティングを乱さないように注意しながら、新しいチャンバースライド/カバースリップから行列を吸引します。 </li><li>サイズは200ミクロン - 優しく〜50の塊にhiPSCコロニーを破壊するために、細胞懸濁液をウェルの一角に対して2回粉砕します。ウェル4ウェルチャンバースライド/カバースリップのそれぞれの新しいウェルに古いから細胞懸濁液250μLを転送します。 </li><li> mTeSR1続き各新しいだけでなく、最大500μLの容量を持参10ng / mLのY-27632 ROCK阻害剤aining。 </li><li> 37℃、5％CO 2のインキュベーターでチャンバースライド/カバースリップを置きます。 </li><li> 24時間後、mTeSR1完全培地を毎日フルメディアの変更を行います。前述したように、再び、Y-27632 ROCK阻害剤の添加は、最初のプレーティングの後に必要ではありません。 </li></ol>免疫細胞化学のための性IPSCの5準備<ol><li>コンフルエント後、ウェルから培地を除去し、予め温めておい注意を 4％パラホルムアルデヒド（〜300μL/ウェルの4ウェルチャンバースライド/カバースリップ）を添加することにより固定を介しhiPSCコロニーを維持します。 20分間室温でインキュベートします。 </li><li>制度バイオハザードや化学物質の安全性ガイドラインに従って適切にパラホルムアルデヒドを捨てます。 </li><li> PBSでベンチトップシェーカー上で5分間ずつ細胞を3回洗浄します。 注：チャンバースライド/カバースリップ上の細胞は、この段階で無期限に4℃で十分なPBSを用いて格納することができます。あるいは、それらは、直ちにICCのために使用することができます。 </li></ol>多能性マーカーとhiPSCsの6免疫染色注：標準的な多能性抗体を用いたイムノhiPSCs。アンチ段階特異的胎児性抗原4（SSEA4）を抗オクタマー結合タンパク質4（OCT-で：ここでは例として、細胞は、以下のように順次に1 1表面と1細胞内抗原を標的とする抗体で二重染色されています4）および抗TRA-1-60抗SRY関連HMGボックス遺伝子2（SOX2付き）（）抗体の詳細のための材料の表を参照してください。 <ol><li>井戸からPBSを吸引し、トリトンX-100なしで500μL/ウェルのブロッキング溶液に追加します。室温で1時間インキュベートします。 </li><li>トリトンX-100なしでブロッキング溶液で希釈することにより、表面抗体の、SSEA4またはTRA-1-60のいずれか、：事前に測定された濃度を準備します（200ここでは、1を使用します）。 <ol><li>チャンバースライドの場合は、4ウェルチャンバースライドの300μL/ウェルを準備上記のソリューションおよび抗SSEA4またはTRA-1-60一次抗体の1.5μLをブロッキングの298.5μLを混合することによって。 </li><li>カバースリップのために、ソリューションおよび抗SSEA4またはTRA-1-60一次抗体の1μLをブロッキングの199μLを混合して40μL/カバースリップを準備します。 </li></ol></li><li>チャンバースライドからのブロッキング溶液を吸引除去し、適切なウェルに一次抗体を分注します。カバースリップのために、しっかりとペトリ皿の内側にパラフィルムの一部を配置し、液滴のような上に一次抗体の40μLを分注します。曲がった注射針や鉗子を使用して、慎重に培養ウェルのうち、カバースリップを持ち上げ、パラフィルム上の抗体のドロップにダウンそれセル側に配置します。 4℃で一晩インキュベートします。 </li><li>チャンバースライドから抗体を除去し、PBS中に追加することで、各10分 - 翌朝は、3回、5細胞を洗浄します。カバースリップのために、パラフィルムオフ各1を持ち上げて、24ウェルプレート、セルサイドアップのほかに戻ってそれを置きます。慎重にPを追加BS。 </li><li> 1で適切な二次抗体を準備します。ブロッキング溶液で500。 <ol><li>チャンバースライドの場合は、300μL/ウェルのソリューションおよび（SSEA4用）ヤギ抗マウスIgG3のアレクサフルオロ488または1μLヤギ抗マウスのIgMのアレクサフルオロの1μLをブロッキングの499μLを混合して4ウェルチャンバースライドを準備488（TRA-1-60のため）。 </li><li>カバースリップのために、ブロッキング溶液およびヤギ抗マウスIgG3の（SSEA4用）アレクサフルオロ488またはヤギの1μLTRA-1-60のための抗マウスIgMアレクサフルオロ488（の1μLの499μLを混合して40μL/カバースリップを準備）。 </li></ol></li><li>チャンバースライドからPBSを吸引し、適切なウェルに二次抗体を分注します。カバースリップのために、ステップ6.2以下、2時間室温でパラフィルム上に配置された抗体溶液にカバースリップを反転。 注：使用した蛍光二次抗体をタグ付けされた場合、細胞が光から保護されなければなりません。暗いENVでチャンバースライドとカバースリップを置きますインキュベーションおよび洗浄中にironment。 </li><li>チャンバースライドから抗体を除去し、PBS中に追加することで、10分ごと - 5のために、細胞を3回洗浄します。カバースリップのために、パラフィルムから一つ一つ丁寧に持ち上げ、24ウェルプレート、セルサイドアップのウェル内に戻って置きます。静かに洗浄液中にPBSを追加します。 </li><li>第二の抗原に対するプロービングの前に、細胞内のOCT-4またはこの場合SOX2は、室温で1時間透過処理試薬（トリトンX-100）で作られたブロッキング溶液中で再度インキュベートします。 </li><li> OCT-4またはSOX2のために免疫染色するには、単に一次および二次抗体を適用するための手順6.1から6.6に記載の方法に従ってください。 1から200及び二次抗体ヤギ抗ウサギIgGアレクサフルオロ594：このプロトコルの目的のために、1の濃度で、OCT-4及びSOX2を使用する500。 </li><li> 6&#39;-ジアミジノ-2 &#39;PBSで10分間ずつ4で対比染色 - 上記の一次および二次抗体処理後、5、細胞を3回洗浄-phenylindole、核の可視化が所望される場合、標準的なプロトコルを以下の二塩酸塩（DAPI）。 </li></ol>表示7.準備<ol><li>チャンバースライドの場合は、慎重に製造者の指示に従って、スライドから上部チャンバーを削除します。その後、蒸留水ですすぎ、および顕微鏡検査を可能にするための媒体とカバーガラスを取り付け追加します。 </li><li>カバースリップは、ガラス顕微鏡スライド上に配置された封入剤のドロップに上カバースリップを反転。 </li><li>標準または共焦点蛍光顕微鏡下での画像。 </li></ol>

<ol>
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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+protein+marker+panel+for+characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+(hiPSCs)+using+global+quantitative+proteome+analysis.">Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis.</a> Stem cell res. 14, 323-338 (2015).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).</li><li>Bigdeli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+human+embryonic+stem+cells+to+feeder-free+and+matrix-free+culture+conditions+directly+on+plastic+surfaces.">Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces.</a> J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).</li><li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging.">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここで紹介する体系的なプロトコルは、具体的には、免疫細胞化学を介して、効果的な多能性分析をサポートするように設計されたスケールダウン培養技術の形で時間節約と費用対効果の高い方法を、提供しています。 以下のように記載される方法論の主な利点はあります。伝統的に3以上4継代12、13を表示するバルク分離技術...

人工多能性幹細胞（iPS細胞）に、ヒト成人の体細胞を再プログラミングする疾患1,2を研究するための患者特異的細胞の潜在的に無制限の供給を得るための方法を提供します。 in vitroでの疾患表現型を反復することは、それがもっともらしい疾患に関連する細胞および分子メカニズムを調べるために行い、創薬やオーダーメイド医療3を高めるであろう。加えて、ヒトiPS細胞（hiPSCs）が死亡または機能不全の細胞を交換し、いくつかの障害4、5との関連で機能を回復するための固有の資源として使用することができる特定の細胞型を誘導する可能性を提供します。 上記のアプリケーションでiPS細胞を使用することに重要な前提条件は、その多能性未分化状態は、培養中の拡張中に維持されることを保証することです。一般的に、techniq細胞および特殊な装置を大量に必要とするようなフローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、ポリメラーゼ連鎖反応および機能アッセイのようなUEは、IPSCの多能性6、7、8、9、10の詳細な分析のために使用されます。しかし、性IPSC「未分化状態のルーチン評価は、効果的にこのように減少し、時間とリソースを含む、特に免疫細胞化学（ICC）のために、これらの細胞の限られた増殖によって達成されることがあります。 最近の進歩は、マウス線維芽細胞フィーダー層および血清含有培地を必要とする従来の培養系よりも大幅に改善されて定義された無血清条件でのiPS細胞の成長、を可能にします。しかし、現在の文献は、フィーダーからiPS細胞を移行する方法について説明し明確な段階的なプロトコルが含まれていません。フィーダーフリーシステムへの層。 この文脈では、本プロトコルは、系統的に照射マウス胚性線維芽細胞（iMEF）フィーダー層上で増殖させhiPSCsは、特に堅牢をサポートするために、小規模の（1）無血清培地中で伝播するように適合され、及び（2）で培養することができる方法の詳細免疫細胞化学的解析。全体として、この方法は、免疫細胞化学を用いて、定期的にそれらの多能性を確認するために、無血清条件下でのヒトiPS細胞を増殖させるためのタイムリーかつ費用効果的な手順を表します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM-F12/HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-Basic</td>
			<td>Cell Sciences</td>
			<td>CRF001B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 ROCK Inhibitor</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 Basal Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>05850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 5X Supplement</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>05850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Buffer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>07174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M PO4 Buffer</td>
			<td>In-House</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldeyde, prill</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phoshate Buffered Saline</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, 
			Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, 
			SSEA4 (MC813) Mouse mAb, 
			TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling 
			Cell Signaling 
			Cell Signaling 
			Cell Signaling</td>
			<td>2840 
			3579 
			4755 
			4746</td>
			<td>Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Cell Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>0720080/0720081</td>
			<td>Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slides</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12 565 21</td>
			<td>Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for growth</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12 545 82</td>
			<td>Available in 12, 15, 18, 22 and 25mm sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale propagation of human ipscs in serum-free conditions for routine immunocytochemical characterization

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.

このプロトコルは、人間性IPSCは、無フィーダーするための条件をフィーダー層から転送され、その後、具体的に多能性の維持を確認するための費用対効果の高い免疫細胞化学を有効にするために限定的に伝播させることができる方法を段階的に説明します。 図1は、このプロトコルの概略図を示します。 図2Aは、6ウェルプレート中iMEFsに成長...

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Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.

ルーチンの免疫細胞化学的特性評価のための無血清条件でのヒトiPS細胞の小規模伝播

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.9K ビュー.  The University of Arizona. Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

発生生物学

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

ヒト多能性のための新しい文化モデルは、プラセンタ馴化培地中のゼラチンの細胞増殖幹

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during embryonic development that also commonly occurs in glioblastoma, the most frequent malignant brain tumor. EMT has also been observed in multiple carcinomas outside the brain including breast cancer, lung cancer, colon cancer, gastric cancer. EMT is centrally linked to malignancy by promoting migration, invasion and metastasis formation. The mechanisms of EMT induction are not fully understood. Here we describe an in vitro system for standardized isolation of cortical neural stem cells (NSCs) and subsequent EMT-induction. This system provides the flexibility to use either single cells or explant culture. In this system, rat or mouse embryonic forebrain NSCs are cultured in a defined medium, devoid of serum and enzymes. The NSCs expressed Olig2 and Sox10, two transcription factors observed in oligodendrocyte precursor cells (OPCs). Using this system, interactions between FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling involving Zeb1, Zeb2, and Twist2 were observed where TGF&#946;-activation significantly enhanced cell migration, suggesting a synergistic BMP-/TGF&#946;-interaction. The results point to a network of FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling to be involved in EMT induction and maintenance. This model system is relevant to investigate EMT in vitro. It is cost-efficient and shows high reproducibility. It also allows for the comparison of different compounds with respect to their migration responses (quantitative distance measurement), and high-throughput screening of compounds to inhibit or enhance EMT (qualitative measurement). The model is therefore well suited to test drug libraries for substances affecting EMT.

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

培養ひと胎児脳神経幹細胞の免疫細胞化学的解析のジカ ウイルス感染症

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

セルショウジョウバエ切り込みをトランスとの結合を評価する集計の試金-配位子とCisによるその阻害-配位子

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデル フィーダー フリー培養条件

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...