以下のプロトコルは、皮膚パンチ生検から分離されたヒト真皮線維芽細胞の迅速かつ効率的な再プログラミングを通じて、自家のヒト誘発多能性幹細胞を生成するための指示を提供する。この手順は、細胞リプログラミングの経験がほとんどまたはまったくない研究者によって行われ、適切な調整を行うことで、異種フリーの人工多能性幹細胞の生成を可能にする。自己IPS細胞は、再生医療の応用や遺伝性疾患や癌などの疾患をモデル化して、基礎となる分子メカニズムを調査し、より具体的な治療法を開発するために使用される可能性があります。
ワークロードが高い。試薬や材料を準備するステップを含め、実験を慎重に計画する前にプロトコルを研究することは非常に有用です。この手順の視覚的なデモンストレーションは、ほとんどまたはまったく経験のない研究が細胞の単離および再プログラミングを行うのに役立ち、微生物およびRNA汚染の可能性に関連する一般的な間違いを避ける。
無菌フードの下で、取得した人間の皮膚のサンプルを100ミリメートル皿にHPSS溶液で洗浄します。細かい鉗子とはさみを使って毛髪や脂肪を取り除き、メスで解剖して2ミリメートルの大きさの断片を1ミリメートルずつ解剖し、瘢痕、汚れた領域、または組織の焼けた部分を避ける。各35ミリメートル皿に4つの小さな断片を置き、無菌カバーガラスで覆い、1.5ミリメートルのI-DMEMを加えます。
プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%を約15日間、または細胞が85%合流するまでインキュベートします。培養液を3日ごとに変更し、逆相対照顕微鏡を使用して細胞の成長を毎日確認します。さて、カバーグラスを細かい鉗子で持ち上げ、100ミリメートル皿に逆さまにして1X滅菌PBSで洗います。
サンプルのフラグメントを削除し、破棄します。1X滅菌PBSでプレートを洗浄します。1X PBSを取り外し、100ミリメートル皿に入れたカバーグラスに3ミリメートルのトリプシンEDTAを加え、35ミリメートルの皿にもトリプシンEDTAの1ミリメートルを加えます。
5%の二酸化炭素で摂氏37度で5分間インキュベートします。その後、100ミリメートル皿に5ミリメートルのTSSを加え、TSSを2ミリメートルずつ35ミリメートル皿に加えてトリプシン化をブロックします。サスペンションを15ミリメートルの無菌チューブに集め、遠心分離機を摂氏4度で400倍に5分間回収します。
上清を吸引し、I-DMEMの12ミリメートルでペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を3ミリメートルのアリコートに分割し、それぞれ60ミリメートルのプレートに移します。5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートする。
毎日メディアを変更します。培養中の細胞を75%の合流点に達するまで、トリプシン化を3回繰り返して、その通過4の細胞を得る。次に、I-DMEMをS-DMEMに置き換えて細胞を同期させ、摂氏37度で48時間インキュベートし、5%の二酸化炭素を使用します。
細胞同期中に、線維芽細胞の増殖媒体および線維芽細胞の自由なプログラミングのための総非修飾RNAリプログラミングのカクテルを準備する。36に分割された非修飾RNAアリコートの9つのチューブの調製を簡素化するために、我々はフードの壁に取り付けたスキームに従うために使用しました。氷上で解凍した基底膜マトリックス100マイクロリットルを各ウェルに移して底を均一に覆い、24ウェルプレートをコーティングします。
細胞を播種する前に摂氏37度で少なくとも1時間インキュベートする。培養中の細胞を用いたプレートから培地を吸引し、1X PBSで素早く洗浄する。トリプシン化を繰り返して、その通過5個の細胞を得る。
上清を吸引し、適切な量の線維芽細胞拡張培地でペレットを再懸濁する。70%アルコールでヘモサイトメーターを準備し、きれいにします。次に、10マイクロリットルのトリパンブルーと10マイクロリットルの細胞懸濁液を1.5ミリリットルチューブに軽く混合して溶液を調製し、室温で1~2分間インキュベートします。
ピペット10マイクロリットルの溶液をヘモサイトメーターに入れ、逆相対照顕微鏡のステージに置いて数える。生存不可能な細胞は青であり、生存細胞は染色されない。ヘモサイトメーターチャンバーの少なくとも2つの正方形の細胞を数える。
希釈を行い、線維芽細胞拡張培地の500マイクロリットル当たり4番目の細胞に2.5倍の10倍の密度を得て、細胞ペレットを再懸濁する。ピペット500マイクロリットルの細胞懸濁液を24ウェルプレートの各ウェルに入した。細胞を摂氏37度と5%の二酸化炭素で一晩インキュベートする。
朝、各ウェルから古い培地を取り出し、500マイクロリットルのプレzアームドキセノフリーの因子フリー培地に置き換えます。5%の二酸化炭素の下で37%の摂氏で少なくとも6時間インキュベートする。室温でカクテルを再プログラミングする全nmRNAの5つの15.4マイクロリットルのアリコートを解凍し、氷の中に入れる。
各アリコートに234.6マイクロリットルの減らされた血清培地を加え、3〜5回ピペットを軽くし、チューブA.ラベル5つの無菌RNase-free 0.5ミリリットルチューブとしてラベルを付け、6マイクロリットルの合成小干渉RNAトランスフェクション試薬を244マイクロリットルの還元血清培地と混合します。次に、ピペットを使用して各チューブBの内容物を管Aドロップワイズに添加する。チューブの底部をタップして混ぜます。
室温で15分間インキュベートします。その後、5つのアリコートのそれぞれから各ウェルにnmRNAトランスフェクション複合体溶液の125マイクロリットルを加え、プレートを傾け、ピペットは媒体に下降する。20個の井戸の中身を軽く揺らすことで混ぜます。
残りの4つのウェルを参照として使用します。プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%で15時間インキュベートします。翌日、培地を吸引する。
無菌フードの下で、1日目のように、さらに3日間毎日トランスフェクション手順を繰り返します。5日目に、培地を吸引し、無菌フードの下で新鮮な、事前に温めたXF / FF培養培地と交換します。プレートを摂氏37度と炭酸ガス5%でインキュベートします。
細胞培養を位相コントラスト顕微鏡で毎日監視し、IPSCコロニーの形成を観察するまで観察する。このプロトコルの目的は、非統合型リプログラミング法を用いて、腹部皮膚から分離された真皮線維芽細胞を再プログラムすることであった。ヒト線維芽細胞は、培養後1週間以内に腹腔皮膚のサンプルから成長し、2週間以内に85%の合流に達した。
細胞はプラスチック培養皿に接着性を持ち、その形態は細長く紡錘状から平らで星形までさまざまであった。線維芽細胞の形態と配置と培養は、BMMに播種した後、細長い形態を獲得し、細い分岐構造を形成するように配置した後に劇的に変化した。小さなコロニーは、最初のトランスフェクションから1日目にすでに文化に見え、その大きさは時間の経過とともに徐々に増加し、その数は7日目から14日目の間に安定したままであった。
抗生物質を含まない培地を用いてリプログラミングを行ったため、無菌状態が保証されない場合には、微生物汚染が大きな問題となった。増殖速度とめっき密度はリプログラミング効率に影響を与えるため、細胞通過を計画し、細胞増殖率に基づいてめっき密度を定義することが重要です。動物由来の試薬を適切な異種フリー試薬に置き換えるこのプロトコルは、成人ヒト線維芽細胞を臨床使用しなかった完全な異種非培養環境でIPS細胞に再プログラミングすることを可能にする。
ヒト細胞は血液媒介病原体の感染源となる可能性があるため、処置を通して個人保護具を着用すべきである。
