Name: in vitro differentiation of human pluripotent stem cells into trophoblastic cells
Uploaded: 2017-03-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
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This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.

注：栄養膜前駆細胞へのhESCまたはhiPSCsのいずれかの分化のために、マウス胚繊維芽細胞（MEF）上に成長したhPSCsをフィーダーを含まないために、2つの通路のための条件をBMP4 / A / Pと分化を開始する前に遷移されます。このプロセスは、分化した細胞のMEF汚染を排除します。ここでは、hESCの分化のためのプロトコルを提供し、同じプロトコルをhiPSCsに適用することができます。 1.照射マウス胚線維芽細胞上のhESCの文化と回復（のMEF）（準備） <ol><li> MEFののガンマ線照射 <ol><li> 10％FBS、2mM L-グルタミン、1×ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）を含むDMEM、及び0.1mMの非必須アミノ酸（NEAA）のMEFを培養するための培地500mlを加えます。 </li><li>一次のMEFの1つのバイアルを解凍し、細胞を培養するためのMEF培地を使用します。 MEF培地を用いて30プレートに一次のMEFを展開します。 注：酸素濃度はそう、このステップのために重要ではありませんインキュベータ内の生理学的（4％）または周囲（20％）の条件のいずれかを使用することができます。 </li><li> MEFSを収穫。プレートからのMEFを削除し、コニカルチューブに細胞を転送するために0.25％トリプシンを使用してください。照射機器にのMEFを置き、3500グレーに細胞をさらします。 注：時間の量は、照射ユニットの内部ソースの活性に依存します。 </li><li> MEF培地を照射したMEFを再懸濁し、血球計数器を用いて細胞数を数えます。 </li><li>遠心分離機を使用したMEFをペレット化し、50％のMEF培地と培地を凍結50％の細胞（80％FBS、20％MEF培地）を加えます。アリコート1バイアルあたり1×10 6個の細胞。 </li><li>一晩-80℃の冷凍庫で照射MEFバイアルを置き、その後、長期保存のために液体窒素に転送します。 </li></ol></li><li> 文化のために凍結したMEFおよびヒトES細胞を解凍 <ol><li> 20％血清REPLACを含むDMEM / F-12：hESCの培地500mlを作りますement、0.1mMのNEAA、2mMのL-グルタミン、10ng / mLのbFGFを、0.1 mMのSSメルカプトエタノール、および1×ペニシリン/ストレプトマイシン。 </li><li>ヒトES細胞を解凍する前に、MEFを1日1バイアルを解凍します。各ウェルは1 mlで使用し、0.1％ゼラチンでコート6ウェルプレートを、。室温で少なくとも20分間インキュベートし、その後、ゼラチンを削除します。 </li><li>液体窒素中で貯蔵からのMEFのバイアルを取り外し、37℃の水浴中でバイアルを浸します。唯一の小さな氷の結晶が残るまで断続的にバイアルをご覧ください。迅速に15ミリリットルコニカルチューブ内のMEF培地の9ミリリットルにバイアルの内容を転送します。 </li><li> 5分間、200×gで遠心分離して細胞をペレット化。上清を吸引除去し、MEF培地中で細胞ペレットを再懸濁します。 6ウェルプレート上に均等にしたMEFを等分。一晩37℃の低酸素（4％）インキュベーターにプレートを置きます。 </li></ol></li><li> MEFの上のhESCのルーチンの文化 <ol><li>液体窒素からのhESCバイアルを取り外し、すぐに3を使用して、バイアルを解凍7℃の水浴。ゆっくりのhESC媒体の9ミリリットルを含む15ミリリットルコニカルチューブにヒトES細胞をピペットし、5分間、200×gでスピンダウン。培地を除去し、ヒトES細胞培地1mlで細胞を懸濁します。 </li><li>ステップ1.2.4で製造したプレートからMEF培地を吸引し、ヒトES細胞培地の1ミリリットルを追加します。ヒトES細胞培地にROCK阻害剤Y-27632（10μM）を追加します。 MEFの上にヒトES細胞を転送します。 </li><li>一晩37℃で低酸素（4％）インキュベーターにセルを配置します。毎日のhESC媒体を交換してください。 4Xで正立顕微鏡下で可視化パスツールピペットを用いて分化した細胞を削り取ります。 </li><li>パサージュヒトES細胞ごとに4-6日、細胞集密度とhESCコロニーの大きさに応じて。継代前日のMEFのプレートを準備します。細胞は継代に準備ができているときは、hESCの培地を除去し、1mlのPBSでよく洗います。 </li><li> 1mg / mlのコラゲナーゼを追加します（37℃に予熱した）、37℃で5分間インキュベートし、コラゲナーゼを除去します。 WPBSで細胞をアッシング、ウェル当たりのhESC培地の1ミリリットルを追加し、手動で5ミリリットルピペットの先端を使用して小さな塊に細胞をこすり取ります。新しいMEF-コーティングされたウェル（複数可）に懸濁細胞塊を転送します。 </li></ol></li></ol>フィーダーなしに条件を細胞外マトリックスでコーティングされたプレート上のMEFからのhESCの2推移<ol><li> 準備MEF馴化培地（CM） <ol><li>百分の90から100までの集密度でT75フラスコ中で照射したMEFをプレート。のMEFが密にメッキされることが重要です。彼らは、フラスコの底部に取り付けられているかどうかを判断するために顕微鏡を用いて細胞を観察し（MEFをメッキまたは翌日以降、約6時間を添付します）。 注：顕微鏡を用いて観察したときに未結合細胞が培地中に浮遊します。翌日、MEF培地を除去し、B-FGFを欠くのhESC培地25mlを追加します。 </li><li>インキュベーションの24時間後に馴化培地を収集します。 12日の最大のために毎日新鮮な培地と交換してください。 </l私&gt; <li> 0.22μmのフィルターを用いて収集したCMをフィルタリングします。使用前に、CMに新鮮なB-FGFを追加します。 注：CMは、-80℃で凍結し、最長1年間保存することができます。また、4℃で2週間CMを格納します。 </li></ol></li><li> トランジションのMEF上で培養物からヒトES細胞は、無フィーダーする細胞外マトリックスでコーティングされたプレートを。 <ol><li>被覆組織培養プレートのための細胞外マトリックスの調製<ol><li>氷（約3-4時間）に、細胞外マトリックスのアリコートを解凍します。氷冷DMEM / F-12の24ミリリットル中に氷のように冷たいヒント、1冷たい、50ミリリットルコニカルチューブ、およびDMEM / F12培地、細胞外マトリックスの転送に2mgを使用した（希釈は、サプライヤーからの細胞外マトリックスの濃度に依存します）。 </li><li>直ちに氷上に50ミリリットルを円錐管に移し、4℃で保存。被覆組織培養プレートのために、ウェルに希釈し、細胞外マトリックスの適切な量を追加する（例えば、6ウェルプレート中のウェルあたり1ml）中。プレートをコーティングするために旋回し、少なくとも1時間室温でインキュベートします。 </li></ol></li><li> B-FGF（10 ngの/ ml）を含むCMを使用して（ステップ1.3のように）のMEFからの通路のhESC。 <ol><li>吸引し、新しいプレートから細胞外マトリックスを削除して、B-FGFを含むCMを追加します。ピペットを用いて、MEFプレートから掻き取り、携帯塊を移し、細胞外マトリックスでコーティングされたプレートに、それを分取。一晩37℃での低酸素インキュベーターでインキュベートします。 </li><li>毎日のB-FGF媒体とCMを交換してください。培地の量は、培養フラスコの大きさに依存するであろう。 6ウェル1のために2mlの培地を使用してください。パスツールピペットで分化した細胞を削り取ります。 </li><li>通路hESCを顕微鏡で見たときにコロニーが明るいごとに6-7日、。 注：細胞外マトリックスでコーティングされたプレート上で増殖したhESCコロニーは、MEF培養細胞よりも大きくなります。 </li><li>無フィーダー細胞が通過に準備ができたら、培地を除去し、広告によって洗いますPBSを除去するために、ピペット、吸引を使用してPBSの丁1mlを、追加の0.5mg / mlのディスパーゼピペットを用いて（37℃に予熱）、5分間37℃でインキュベートします。 </li><li>ウェルあたり2mlのPBSを添加し、その後吸引することにより、PBSで細胞を洗浄。ウェルあたりのCMの1ミリリットルを追加し、手動で5ミリリットルピペットの先端を使用して小さな塊に細胞をこすり取ります。 </li><li>プレートの新しい細胞外マトリックスでコーティングされたプレートに中断し、細胞塊。細胞は24時間後に接着する必要があります。 </li></ol></li></ol></li></ol> BMP4 / A / Pを使用したhESCの3分化<ol><li>分化培地を準備します。利用CM（欠けているB-FGF）と（新鮮）BMP4（50 ngの/ ml）を、A83-01（1μM）、およびPD173074（0.1μM）を追加します。使用前にCMにこれらの阻害剤を追加します。 </li><li> 4％の酸素で設定したインキュベーター内部の培養1通過のための細胞外マトリックス被覆プレート上で増殖するフィーダーなしのhESCを、使用してください。細胞外マトリックスでコーティングされたプレート上に最初に通過した後、細胞は24時間添付してみましょう。次の日、分化を開始。 （B-FGFを含む）のCMを削除し、BMP4 / A / P（6ウェルプレート中のウェル当たり2ミリリットル）を含むCMと交換してください。 4％の酸素濃度を用いて細胞を培養することを続けます。 </li><li> BMP4 / A / Pを含むCM（2ミリリットル/ウェルのための6ウェルプレート）2日毎に交換してください。吸引し古い培地を除去し、ピペットを用いて、新しいCMを追加します。 B-FGF（考え分化2日目）のBMP4の追加や削除後の第2日目に、細胞の形態は顕微鏡を用いて観察したときに大きく表示されて、変更されます。 注：明るい丸い縁を呈する未分化細胞は、存在しません。 </li><li>希望の時点で細胞を収集します。分化した細胞は、約2週間後に分裂を停止します。この期間中にトランスフェクト細胞（次のセクションを参照）。 </li></ol> siRNAまたはプラスミドDNAと絨毛細胞の4トランスフェクション<ol><li> トランスフェクションのための栄養膜細胞を準備します </強いです&gt; <ol><li> MEFのからそれらを転送した後、細胞外マトリックス上の2つの通路のための培養ヒトES細胞（ステップ2.2参照）。 B-FGFを含むhESCの培地を使用してください。 </li><li> 1日の分化する前に、新しい細胞外マトリックスプレート上にヒトES細胞を分割します。次の日、少なくとも50％の密集度を確保する新しいプレート/ウェル、上に1：高い細胞集密度はそれほど細胞1を分割し、重要です。低酸素インキュベーター中で一晩細胞をインキュベートします。 注：ヒトES細胞は、このステップ中にカウントする必要はありません。 </li><li>次の日は、分化培地で培地を交換してください（CM 6ウェルプレートのためミリリットル/ウェルBMP4 / A / Pを含有し、B-FGFを欠く、2を使用して）。吸引によって古い培地を除去し、ピペットを使用して、新しい培地（2ml）に移します。一晩低酸素インキュベーター（4％酸素）で細胞を置きます。 </li></ol></li><li> トランスフェクション遺伝子破壊のためにsiRNAを使用するか、プラスミドDNAを用いて <ol><li>希望のタイムまで、細胞を分化（1日目と14の間）のポイント。トランスフェクションの前日に、5分間、0.05％トリプシンを用いて細胞をトリプシン処理します。ゼラチンコートプレート上に所望の密集度（トランスフェクション試薬プロトコルに応じて）にそれらをプレート（除去するために20分を吸引するための組織培養プレートに0.1％のゼラチンを追加します）。 （B-FGFを欠く）BMP4 / A / Pを含むCMを追加し、一晩インキュベートします。 </li><li>翌日、細胞に新鮮な分化培地を追加します。 siRNAトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトするsiRNA。プラスミドDNAの場合は、適切なリポフェクタミン試薬を使用しています。 </li><li>各トランスフェクション試薬について説明したように、製品のプロトコルに従ってください。低酸素インキュベーターで一晩細胞を、各ウェルの細胞/プレートにsiRNAをリポフェクタミン複合体を移し穏やかに混合し、文化。 注：一部のトランスフェクション試薬は、CMがペニシリン/ストレプトマイシンを欠いている必要が抗生物質によって阻害されています。 </li><li>翌日、新鮮な分化培地と交換してください。 </li><li>願望で細胞を収穫Dの時点（ 例えば、24時間、48時間、および72時間）定量的RT-PCRを用いて遺伝子破壊効率を確認します。収穫細胞については、ウェル当たり1ミリリットルを添加し、37℃で5分間インキュベートし、0.05％トリプシンを使用します。トリプシンを中和するためにウェルあたりMEF培地の5ミリリットルを追加します。 5分間、200×gで細胞をスピンダウンし、RNA単離のために細胞ペレットを使用します。 </li></ol></li></ol>絨毛細胞の5病原体感染：仙台ウイルス感染<ol><li> 分化のためにヒトES細胞を準備します <ol><li> MEFのからの転送後の細胞外マトリックス上の2つの通路のための培養ヒトES細胞（ステップ2.2参照）。 B-FGFを含むhESCの培地を使用してください。 </li><li> 1日の分化する前に、新しい細胞外マトリックスプレート上にヒトES細胞を分割します。次の日、少なくとも50％の密集度を確保する新しいプレート/ウェル、上に1：高い細胞集密度は、そのように分割セル1が重要です。低酸素インキュベーター（4％酸素）で一晩細胞をインキュベートします。&lt;BR /&gt;注：ヒトES細胞は、このステップ中にカウントする必要はありません。 </li><li>翌日、一晩低酸素インキュベーター（4％酸素）に分化培地（CM BMP4 / A / Pを含有し、B-FGFを欠く）と文化で培地を交換してください。 </li></ol></li><li> 栄養膜細胞の仙台ウイルス感染 <ol><li>ある日、希望分化日の前に、5分間、0.05％トリプシンを用いて、（単一細胞）に分化する細胞をトリプシン処理し、ゼラチンコートプレートに移します。分化培地を追加し、低酸素インキュベーターで一晩インキュベートします。 </li><li>翌日、感染のための培地を追加（これは、ウイルスによって異なります）。 6ウェルプレートの1ウェル0.5 mlで使用し、BMP4 / A / Pを含むペニシリン/ストレプトマイシンを欠く使用CM。 MOIは、低酸素インキュベーター中で8時間、1インキュベートを=のためにセンダイウイルスを追加します。 </li><li>追加の時点が必要な場合は、4時間後にウイルス含有培地を除去し、BMP4 / A / P CMと交換してください。細胞を回収RNA単離のために細胞スクレーパーを使用して。 </li><li>ウイルス応答18に関与する遺伝子のための定量RT-PCRを行うことにより、ウイルス感染の効率を決定します。 </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycosylated+hCG,+a+review.">Hyperglycosylated hCG, a review.</a> Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).</li><li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leucocyte+antigen+(HLA)+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines,+determined+using+single+antigen+beads+to+characterize+allotype+specificities+of+anti-HLA+antibodies.">Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

私たちは、栄養膜の前駆細胞にヒトES細胞を区別するための基本的な手順を提示しました。このプロトコルは、最近栄養膜細胞への分化を増加させ、典型的には単独のBMP4処理で観察された中胚葉前駆細胞の発生を回避すること、急速にアクチビン/ノーダルシグナル伝達阻害剤を添加してヒトES細胞を区別するために最適化されています。 BMP4のモデルシステムは、人間の栄養膜細胞系譜の仕?...

胎盤は、妊娠中の胎児の成長と生存のために必要と母体と胎児循環の間の気体、栄養素、老廃物、およびホルモンの交換を容易にされています。哺乳類の胚発生の間に形成された第一の臓器は、ヒトおよびマウスの1で3.5から4.5日で6-7日後受胎の開発から始まり、胎盤、2、3、4です。栄養膜細胞が胎盤の最も重要な細胞であり、これらの細胞は、哺乳動物の胚の初期の系統分化のイベントのいずれかを表します。彼らは、着床前胚盤胞の外胚体外栄養外胚葉細胞から生じます。胎盤の開発の初期段階の私たちの知識は、早期人間開発のモデリング上の倫理や物流の制限によって制限されています。 胚移植時には、トロホブラスト母性上皮に侵入し、専門の前駆細胞5に分化します。細胞栄養芽層（のCTB）が融合し、子宮にアンカー胎盤合胞体（のSYN）とextravillous侵襲性栄養膜（EVTs）に分化単核、未分化前駆細胞です。 SYNは、妊娠を維持するために必要なホルモンを合成する多核、最終分化細胞です。絨毛細胞での障害は流産、子癇前症、および子宮内発育制限1になるようEVTsとのSYNを生成する初期分化事象は、胎盤形成に必須です。開発されてきた人間の栄養膜細胞株の種類は胎盤ホルモンを産生のCTBと絨毛を、不死化および浸潤特性6を表示することを含みます。人間の妊娠第一期の胎盤を単離することができるが、細胞はすぐにDIFから初代栄養膜細胞ferentiateおよびin vitroで増殖して停止します。重要なことには、形質転換された、一次細胞株は、腫瘍形成および不死化栄養膜細胞株は、正確に一次栄養膜7を表していない可能性があることを示し、異なる遺伝子発現プロファイルを有します。さらに、これらの行は、それらが三学期を介して第1の後段に由来しているため、胎盤トロホブラスト幹細胞前駆体に似ている可能性は低いです。 胎盤の形成と機能の初期事象を研究するために、初期段階のヒト栄養芽細胞の体外培養系における堅牢なの必要性があります。着床前胚の内部細胞塊と特性を共有するヒト胚性幹細胞（hESC）は、しばしば早期胎盤の形成を含む、初期のヒトの発生をモデル化するために使用されます。ヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）およびヒトES細胞の両方は、骨モルを用いてインビトロで栄養芽細胞に分化させることができますphogenicタンパク質4（BMP4）8、9、10、11、12、13、14、15。 BMP4を使用して栄養膜細胞への多能性細胞のこの変換は、人間の細胞に特異的であり、それは初期ヒト胚9、16へのアクセスを必要としないため、広く初期のヒト胎盤の発達を研究するために使用されます。最近、SMAD2 / 3及びMEK1 / 2シグナル伝達経路を遮断する阻害剤A83-01（A）およびPD173074（P）の添加は、栄養外胚葉様前駆細胞、主にSYNのにHPSCの分化の効率を高めることが発見されました中胚葉、内胚葉、または外胚葉細胞9の大規模な発生がなく、EVTs、17 </suP&gt;。これらの培地条件を用いて、12日間分化ヒトES細胞は、ヒト胚盤胞段階の胚から単離された栄養外胚葉細胞と同様の遺伝子発現プロファイルを有しており、種々の胎盤特異的成長ホルモンを分泌し、in vitroモデル系9、11本の妥当性を支持します。ここでは、BMP4 / A / P培地を用いて、ヒト栄養芽前駆細胞へのhPSCsのインビトロ分化のための詳細なプロトコルを提示します。これらの条件は、リポフェクション媒介性トランスフェクションを用いたRNA配列、siRNAを用いた遺伝子破壊、病原体感染、遺伝的改変を含む、多種多様な用途のための細胞の過剰数を生成します。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Knock Out Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>This is referred to as &quot;serum replacement&quot; in this protocol.</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Millipore</td><td>GF-003</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Rock inhibitor Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>Irradiated CF1 MEFs</td><td>GlobalStem</td><td>6001G</td><td>MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150i low oxygen incubator</td><td>Heracell/VWR</td><td>89187-192</td><td>Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>PD173074</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3044/10</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td>Trizol is used to isolate total RNA.</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>This is referred to as &quot;extracellular matrix&quot; in this protocol.</td></tr></tbody></table>

in vitro differentiation of human pluripotent stem cells into trophoblastic cells

胎盤は、胚発生の間に開発した最初の臓器であり、発達中の胚の生存のために必要とされます。胎盤は、着床前胚盤胞の胚体外栄養外胚葉細胞から分化する様々な栄養膜細胞から構成されています。このように、ヒト胎盤の早期分化事象の理解があるため、人間の胚発生の単離および操作上の倫理的および法的制約のために制限されています。ヒト多能性幹細胞（hPSCs）人間開発を研究するための強力なモデル系であり、また、種々の栄養膜細胞型のマーカーを発現する栄養膜細胞にインビトロで分化させることができます。ここでは、骨形成タンパク質4及びアクチビン/ノダルシグナル伝達経路の阻害剤を使用して、栄養膜細胞にhPSCsを区別するための詳細なプロトコルを提示します。このプロトコルは、siRNAでトランスフェクトすることができる種々の栄養膜細胞型を生成します機能喪失表現型を調査するため、または病原体に感染させることができます。さらに、hPSCsは、遺伝的に変更することができ、その後の機能獲得分析のための栄養膜の前駆細胞に分化しました。 hPSCsから始まる人間栄養芽細胞を生成するためのこのインビトロ分化方法は、ヒト初期胚での作業の倫理的、法的な制限を克服し、このシステムは、創薬・幹細胞研究を含め、様々な用途に使用することができます。

hPSCsのインビトロ分化の概要このインビトロ分化プロトコルは、1の通路（ 図1A）のための無フィーダー条件に移行されたMEF上で増殖させた未分化ヒトES細胞から始まります。私たちはこのプロトコルでhESCの分化を説明したが、我々が正常絨毛細胞にhiPSCsを区別するために、このプロトコルを使用し...

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In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

ヒト多能性幹細胞のin vitro分化における絨毛細胞へ

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

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In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

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8.6K ビュー.  University of Pennsylvania. Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

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Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

ヒト細胞培養のための回転細胞培養システム：モデルとしてのヒト栄養膜細胞

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

生物工学

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

メラトニンに対する低酸素/再酸素化誘発性の破壊の保護効果を研究するために、ヒト初代栄養膜細胞培養モデル

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

発生生物学

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

栄養膜幹細胞へのマウス胚性線維芽細胞の直接変換するためのプロトコル

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells differentiate into primary trophoblast giant cells (TGCs) while the polar trophectoderm overlying the inner cell mass continues to proliferate later differentiating into secondary TGCs. TGCs play a key role in developing placenta and are essential for a successful pregnancy. Investigation of transcriptional regulation of specific genes during post-implantation development can give insights into TGCs development. Cells of the ectoplacental cone (EPC) from embryos at 7-7.5 days of gestation (E7-7.5), derived from the polar trophectoderm, differentiate into secondary TGCs1. TGCs can be studied in situ, on cryostat sections of embryos at E7 although the number of TGCs is very low at this stage. An alternative means of analyzing secondary TGCs is to use short-term cultures of individual EPCs from E7 embryos. We propose a technique to investigate the transcriptional status of genes of interest both in vivo and in vitro at the single-cell level using fluorescent in situ hybridization (RNA FISH) to visualize nascent transcripts. This technique provides a direct readout of gene expression and enables assessment of the chromosomal status of TGCs, which are large endoreplicating cells. Indeed, a key feature of terminal differentiation of TGCs is that they exit the cell cycle and undergo multiple rounds of endoreplication.This approach can be applied to detect expression of any gene expressed from autosomes and/or sex chromosomes and can provide important information into developmental mechanisms as well as placental diseases.

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

の新生RNA FISHによる転写分析<em&gt;インビボ</em&gt;栄養膜巨細胞または<em&gt;インビトロ</em&gt;栄養膜コーン外植片の短期文化

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

移行, 侵略, と不死化妊娠初期絨毛細胞の増殖を評価する生体外の試金

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

神経科学

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

胚盤胞からマウス栄養膜幹細胞の導出

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

生物学

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend on its ability to efficiently, timely, and faithfully recapitulate the sequences of blastocyst development (morphogenesis, specification, patterning), and to form cells reflecting the blastocyst stage. Here we show that na&#239;ve human pluripotent stem cells cultured in PXGL conditions and then triply inhibited for the Hippo, transforming growth factor- &#946;, and extracellular signal-regulated kinase pathways efficiently undergo morphogenesis to form blastoids (&gt;70%). Matching with developmental timing (~4 days), blastoids unroll the blastocyst sequence of specification by producing analogs of the trophoblast and epiblast, followed by the formation of analogs of the primitive endoderm and the polar trophoblasts. This results in the formation of cells transcriptionally similar to the blastocyst (&gt;96%) and a minority of post-implantation analogs. Blastoids efficiently pattern by forming the embryonic-abembryonic axis marked by the maturation of the polar region (NR2F2+), which acquires the specific potential to directionally attach to hormonally stimulated endometrial cells, as in utero. Such a human blastoid is a scalable, versatile, and ethical model to study human development and implantation in vitro.

A protocol outlining the formation of human blastoids that efficiently, timely, and sequentially generate blastocyst-like cells.

胚盤胞の開発と移植をモデル化するためのヒト芽球イドのプロトコル

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend ...

Analyzing Angiogenesis: In Vitro Assay for Tube Formation on BM Matrix

Trophoblast Cell Recovery from Angiogenesis-Tube Formation Assay for Differentiation Marker Expression Analysis

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of mesenchymal to endothelial-like transition. Traditionally, this process is evaluated by an in vitro tube-formation assay, where the cells organize themselves into tube-like structures when seeded over a polymerized basement membrane preparation. Although several structural features can be measured in photomicrographs of the structures, to assess the real commitment of EVT to the endothelial-type phenotype, biochemical analysis of cell extracts is required. Scraping the cells from the culture dish to obtain RNA and/or protein extracts is not an alternative since the tube-like structures are severely contaminated by the bulk of proteins from the polymerized basement membrane. Thus, a strategy to separate the cells from the basement membrane proteins prior to the preparation of cell extracts is needed. Here, a simple, fast, and cost-effective method to recover the tube-like structures from the in vitro tube-formation assay and the subsequent analysis by biochemical techniques is presented. Tube-like structures formed by HTR8/SVneo cells, an EVT cell line, were liberated from the polymerized basement membrane by a short incubation with PBS supplemented with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). After serial washes, a ready-to-use pellet of purified tube-like structures can be obtained. This pellet can be subsequently processed to obtain RNA and protein extracts. qPCR analysis evidenced the induced expression of VE-cadherin and alphav-integrin, two endothelial cell markers, in EVT-derived tube-like structures compared to control cells, which was consistent with the induction of the endothelial cell marker, CD31, evaluated by immunofluorescence. Western blot analysis of the tube-like structures' protein extracts revealed the overexpression of RECK in transfected HTR8/SVneo cells. Thus, this simple method allows to obtain cell extracts from the in vitro tube-formation assay for the subsequent analysis of RNAs and protein expression.

The present protocol allows the recovery of tube-like structures formed in the classical in vitro angiogenesis-tube formation assay where cells, such as trophoblast cells, organize in capillary-like structures over a layer of extracellular basement membrane matrix. The recovered structures are used for RNA and protein isolation for various biochemical analyses.

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

マウスの主栄養膜細胞と絨毛浸潤アッセイの分離

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...