Name: in vitro differentiation of human pluripotent stem cells into trophoblastic cells
Uploaded: 2017-03-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
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This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.

참고 : 영양막 세포의 전구 세포에 하나 hESCs는 또는 hiPSCs의 분화를 들어, 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)에 성장 hPSCs는 BMP4 / A / P와 분화를 시작하기 전에이 구절에 대한 조건없는 공급기로 전환된다. 이 과정은 분화 된 세포의 MEF 오염을 제거한다. 여기서는 hESC의 분화를위한 프로토콜을 제공하고, 동일한 프로토콜 hiPSCs에 적용될 수있다. 1. 문화 조사 된 마우스 배아 섬유 아세포에 hESCs는의 복구 (MEFs에) (준비) <ol><li> MEFs에의 감마 조사 <ol><li> 10 % FBS, 2 mM L- 글루타민, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PEN / 패 혈성)를 DMEM, 0.1 mM 비 필수 아미노산 (NEAA) 다음 MEFs에 배양 용 배지 500 mL로. </li><li> 기본 MEFs에 하나 바이알을 해동하고, 세포를 배양 MEF 매체를 사용한다. MEF 문화 매체를 이용하여 30 판에 기본 MEFs에를 확장합니다. 주 : 산소 농도가이 단계에 대한 중요하지, 그래서어느 인큐베이터 내에서 4 % 생리 또는 주위 (20 %)의 조건을 사용할 수있다. </li><li> MEFs에 수확. 플레이트로부터 제거하고 MEFs에 원추형 튜브에 세포를 전송하기 위해 0.25 % 트립신을 사용한다. 조사 악기로 MEFs에 배치하고 3,500 회색에 세포를 노출합니다. 주 : 시간의 양이 조사부 부 내부 소스의 활성에 의존 할 것이다. </li><li> MEF 배양액을 조사 MEFs에 재현 탁하고 혈구를 이용하여 세포의 수를 계산. </li><li> 원심 분리기를 이용하여 펠렛 MEFs에 50 % MEF 배지 및 배지 (80 % FBS와 20 % MEF 배지)를 50 % 동결 세포를 추가한다. 나누어지는 유리 병 당 1 × 10 6 세포. </li><li> 하룻밤 -80 ° C 냉장고에 조사 MEF 튜브를 배치하고 장기 보관을 위해 액체 질소로 전송. </li></ol></li><li> 문화 냉동 MEFs에와 hESCs는 해동 <ol><li> hESC의 매체의 500 ml의 확인 : DMEM을 / F-12와 20 % 혈청 REPLAC장담, 0.1 mM의 NEAA, 2 mM의 L 글루타민, 10 NG / ㎖의 bFGF, 0.1 MM의 β-머 캅토 에탄올 및 1X 펜 / 패 혈성. </li><li> hESCs는 해동 전에 MEFs에 1 일 한 병을 녹여. 코트 각 웰에 1 ml의를 사용하여 0.1 % 젤라틴과 6 웰 플레이트. 실온에서 적어도 20 분 동안 배양 한 다음, 젤라틴을 제거한다. </li><li> 액체 질소 저장에서 MEFs에의 병을 제거하고 37 ° C의 물을 욕조에 유리 병을 담그지. 단지 작은 얼음 결정이 남아 간헐적 때까지 병을보세요. 신속 15ml의 원뿔형 튜브 내부 MEF 배지 9 ml의 바이알의 내용물을 옮긴다. </li><li> 5 분 동안 200 × g으로 원심 분리하여 세포 펠렛. 뜨는을 기음과 MEF 매체에서 세포 펠렛을 resuspend. 6 웰 플레이트에 균등하게 MEFs에 나누어지는. 하룻밤 37 ℃로 낮은 산소 (4 %) 배양기에 플레이트를 넣습니다. </li></ol></li><li> MEFs에에 hESCs는의 일상 문화 <ol><li> 액체 질소에서 hESC의 유리 병을 제거하고 신속하게 3를 사용하여 병을 해동7 ° C의 물을 욕조. 조심스럽게 hESC의 매체의 9 ml의를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브로 hESCs는 피펫 5 분 동안 200 XG에 스핀 다운. 배지를 제거하고 hESC의 배지 1 ㎖로 세포를 재현 탁. </li><li> 단계 1.2.4에서 제조 된 판에서 MEF 매체를 기음과 hESC의 배지 1 ㎖를 추가합니다. hESC의 매체에 바위 억제제 Y-27632 (10 μM)를 추가합니다. MEFs에 상 hESCs는을 전송합니다. </li><li> 하룻밤 37 ° C 낮은 산소 (4 %) 인큐베이터로 세포를 놓습니다. 매일 hESC의 매체를 교체합니다. 4 배에서 직립 현미경으로 시각화 파스퇴르 피펫으로 차별화 된 세포를 긁어. </li><li> 통로 hESCs는 모든 4-6일, 세포 생장 및 hESC의 콜로니의 크기에 따라. 계대 전날 MEFs에 접시를 준비합니다. 세포가 통과 할 준비가되면, hESC의 매체를 제거하고 PBS 1 ㎖로 잘 씻는다. </li><li> 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제를 추가 (37 ° C로 미리 예열), 5 분 동안 37 ℃에서 배양하고, 콜라게나 제를 제거합니다. WPBS로 세포를 웰 당 화산재 hESC의 배지 1 mL를 넣고 5 ㎖ 수동 피펫의 끝을 사용하여 작은 덩어리로 세포를 긁어. 새로운 MEF 코팅 잘 (들)에 일시 중단 된 세포 덩어리를 전송합니다. </li></ol></li></ol> MEFs에에서 hESCs는 2. 전환은 공급없이하는 세포 외 매트릭스 코팅 된 플레이트에 조건을 <ol><li> 준비 MEF 중간 (CM)를 금연실 <ol><li> 90~100%의 포화 상태에서 T75 플라스크에 조사 MEFs에 플레이트; 치밀 MEFs에 도금하는 것이 중요하다. 들이 플라스크의 바닥에 부착 여부를 결정하기 위해 현미경을 사용하여 세포를 관찰 (MEFs에 도금 또는 다음날 약 6 시간 후에 부착). 참고 : 현미경을 사용하여 관찰 할 때 붙어 있지 않은 세포가 중간에 떠. 다음 날, MEF 매체를 제거하고 B-FGF가없는 hESC의 매체의 25ml를 추가합니다. </li><li> 배양 24 시간 후 조정 배지를 수집합니다. 십이일의 최대 매일 새로운 배지로 교체하십시오. </l난&gt; <li> 0.22 μM 필터를 사용하여 수집 된 CM 필터. 앞서, 사용하는 CM에 신선한 B-FGF를 추가합니다. 참고 : CM은 -80 ° C에서 냉동 1 년까지 저장할 수 있습니다. 또한, 2 주 4 ° C에서 CM을 저장합니다. </li></ol></li><li> 전환 MEFs에에 문화에서 hESCs는이 피더 무료로하는 세포 외 기질 코팅 플레이트. <ol><li> 코팅 조직 배양 플레이트에 대한 세포 외 매트릭스의 제조 <ol><li> 얼음에 세포 외 기질의 분취 량 (약 3 ~ 4 시간)을 해동. 얼음처럼 차가운 팁, 일, 차가운 50 ML 원뿔 튜브 및 DMEM / F12 매체, 전송 얼음처럼 차가운 DMEM 24 ml의에 세포 외 기질의 2 mg의 사용 / F-12 (희석는 공급 업체에서 세포 외 기질 농도에 따라 달라집니다 ). </li><li> 즉시 얼음에 50 ㎖에게 원뿔 튜브를 전송하고 4 ℃에서 보관합니다. 코팅 조직 배양 플레이트의 웰에 희석 된 세포 외 기질의 적당량을 추가 (예컨대, 6 웰 플레이트에 웰 당 1 mL) 중. 코팅 플레이트 소용돌이 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양한다. </li></ol></li><li> B-FGF (10 NG / ㎖)를 함유하는 CM을 사용 MEFs에 발 (단계 1.3)을 통과 hESCs는. <ol><li> 대기음은 새로운 판에서 세포 외 기질을 제거하고 B-FGF를 포함하는 CM을 추가 할 수 있습니다. 피펫을 사용하여 MEF 플레이트에서 긁어 세포 덩어리를 전송하고 세포 외 기질 코팅 된 플레이트로 나누어지는. 밤새 37 ℃로 저산소 배양기에서 품어. </li><li> 매일 B-FGF 매체와 CM 교체; 매체의 크기는 배양 플라스크의 크기에 의존 할 것이다. 한 6 잘 잘위한 매체 2 ㎖를 사용합니다. 파스퇴르 피펫으로 차별화 된 세포를 긁어. </li><li> 통로 hESCs는 현미경으로 볼 때 식민지가 밝은 모든 6~7일. 참고 : 세포 외 기질 코팅 된 플레이트에 성장 hESC의 식민지가 MEF-배양 된 세포보다 큰 성장한다. </li><li> 공급 장치가없는 세포가 통과 할 준비가되면, 광고에 의해 세척, 매체를 제거PBS를 제거하기 위해 피펫, 기음을 사용하여 PBS의 땡 1 ㎖를 추가, 0.5 ㎎ / ㎖ 디스 파제 피펫으로 (37 ° C로 미리 예열), 5 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 잘 당 PBS 2 ㎖를 추가하고 나중에 흡입에 의해 PBS로 세포를 씻으십시오. 물론 당 CM의 1 ML을 추가하고 수동 5 ml를 피펫의 팁을 사용하여 작은 덩어리로 세포를 긁어. </li><li> 새로운 세포 외 기질 코팅 된 플레이트에 일시 중단 된 세포 덩어리 플레이트; 세포는 24 시간 후 준수해야합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> BMP4 / A / P를 사용하여 hESCs는 3. 차별화 <ol><li> 분화 매체를 준비합니다. 사용 CM은 (B-FGF 결여)와 추가 (신선한) BMP4 (50 NG / ㎖) A83-01 (1 μM), 및 PD173074 (0.1 μM). 사용하기 전에 CM 이러한 억제제를 추가합니다. </li><li> 4 % 산소로 설정 인큐베이터 내 배양 한 통과를 위해 세포 외 기질 코팅 된 플레이트에 성장 공급 장치가없는 hESCs는을 사용합니다. 세포 외 기질 코팅 된 플레이트 상에 제 1 통로 후,세포는 24 시간 동안 부착 할 수 있습니다. 다음 날, 분화를 시작합니다. (B-FGF를 포함) 형상을 제거하고 BMP4 / A / P (6 웰 플레이트에 웰 당 2 ml)에 포함 된 CM로 교체합니다. 4 %의 산소 농도를 이용하여 세포를 배양 계속. </li><li> BMP4 / A / P를 포함하는 CM (2 ㎖ / 잘위한 6 웰 플레이트) 2 일마다 교체합니다. 대기음은 기존의 매체를 제거하고 피펫을 사용하여 새 CM을 추가 할 수 있습니다. B-FGF (고려 차별화 하루 2) BMP4을 추가 및 제거에 이어 두 번째 날에, 세포 형태는 현미경을 이용하여 관찰 할 때 더 큰 나타나는 변경됩니다. 참고 : 밝은 둥근 모서리를 보이는 미분화 세포는 존재하지 않습니다. </li><li> 원하는 시간 지점에서 세포를 수집합니다. 차별화 된 세포는 약 2 주 후에 분할 중단됩니다. 이 기간 동안 형질 세포 (다음 섹션 참조). </li></ol> siRNA를 또는 플라스미드 DNA와 융모 세포의 4. 형질 <ol><li> 형질 전환을위한 융모 세포를 준비 </강한&gt; <ol><li> MEFs에 그들을 전송 후 세포 외 기질에 두 구절에 대한 문화 hESCs는 (단계 2.2 참조). B-FGF를 포함 hESC의 매체를 사용합니다. </li><li> 차별화 전에 새로운 세포 외 기질 플레이트 일일 위에 hESCs는 분할합니다. 다음날 적어도 50 % 컨 플루을 보장하는, 잘 / 새로운 판에 1 : 높은 휴대 포화 상태가 중요하므로 세포 1을 분할합니다. 저산소 배양기에서 세포를 밤새 인큐베이션. 참고 : hESCs는이 단계에서 계산 할 필요가 없습니다. </li><li> 다음날, 분화 배지로 배지 교환 (CM 6 웰 플레이트 ㎖ / 웰 BMP4 / A / P를 함유하고 B-FGF 결여, 2를 이용). 흡인에 의해 기존의 매체를 제거하고 피펫을 사용하여 새로운 매체 (2 ml)에 전송합니다. 밤새 낮은 산소 인큐베이터 (4 % 산소)에 세포를 놓습니다. </li></ol></li><li> 형질 유전자 파쇄 된 siRNA를 이용하여 또는 플라스미드 DNA를 사용하여 <ol><li> 원하는 시간 -까지 세포 분화(일 1과 14 사이)을 가리 킵니다. 트랜 스펙 션 하루 전에 5 분 동안 0.05 % 트립신을 사용하여 세포를 Trypsinize. 젤라틴 코팅 플레이트 상에 원하는 컨 플루 (형질 감염 시약 프로토콜에 따라 다름)에 플레이트 (제거하는 20 분 및 흡인을위한 조직 배양 접시에 0.1 % 젤라틴 추가). (B-FGF가없는) BMP4 / A / P를 포함하는 CM을 추가하고 밤새 품어. </li><li> 다음날, 세포에 신선한 차별화 매체를 추가 할 수 있습니다. siRNA와 형질 감염 시약을 사용하여 siRNA를 형질 감염. 플라스미드 DNA를 들어, 적절한 리포 펙 타민 시약을 사용한다. </li><li> 각 형질 전환 시약에 기재 한 바와 같이 제품 프로토콜을 따르십시오. 저산소 배양기에서 밤새 셀, 셀의 각 웰 / 플레이트로 siRNA에 리포 펙 타민 단지 이동을 부드럽게 혼합하고 배양. 참고 : 일부 형질 전환 시약이 CM은 펜 / 연쇄상 구균이 부족 필요 항생제에 의해 억제된다. </li><li> 다음날, 신선한 분화 용지로 교체합니다. </li><li> 욕망에서 세포를 수확(D) 타임 포인트 (예를 들면, 24 시간, 48 시간 및 72 시간)을 정량적 RT-PCR을 사용하여 유전자 파쇄 효율을 확인한다. 수확 셀, 웰 당 1 ml에 첨가하고, 37 ℃에서 5 분 동안 배양하고, 0.05 % 트립신을 사용한다. 트립신을 중화 잘 당 MEF 매체의 5 ML을 추가합니다. 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀 다운하고 RNA의 분리를위한 세포 펠렛을 사용한다. </li></ol></li></ol> 융모 세포의 5 병원체 감염 : 센다이 바이러스 성 감염 <ol><li> 차별화 hESCs는 준비 <ol><li> MEFs에의 전송 후 세포 외 기질에 두 구절에 대한 문화 hESCs는 (단계 2.2 참조). B-FGF를 포함 hESC의 매체를 사용합니다. </li><li> 차별화 전에 새로운 세포 외 기질 플레이트 일일 위에 hESCs는 분할합니다. 다음날 적어도 50 %의 포화 상태를 확인하는 새로운 판 / 웰,에 1 : 높은 휴대 포화 상태가 중요하므로 분할 세포 1입니다. 저산소 배양기 (4 %의 산소)에서 하룻밤 동안 세포를 인큐베이션. &lt;BR /&gt; 참고 : hESCs는이 단계에서 계산 할 필요가 없습니다. </li><li> 다음 날, 낮은 산소 인큐베이터 (4 % 산소)의 분화 배지 (CM 포함 BMP4 / A / P 및 부족 B-FGF)과 하룻밤 문화 매체를 교체합니다. </li></ol></li><li> 융모 세포의 센다이 바이러스 감염 <ol><li> 어느 날 원하는 차별화 하루 전에 5 분 동안 0.05 % 트립신을 사용하여 (단일 세포) 분화 세포를 Trypsinize 및 젤라틴 코팅 플레이트로 전송. 차별화 매체를 추가하고 저산소 배양기에서 하룻밤 품어. </li><li> 다음날, (이 바이러스에 따라 달라집니다) 감염 매체를 추가합니다. 6 웰 플레이트 잘 하나 0.5 ml에 사용 BMP4 / A / P를 포함하는 펜 / 연쇄상 구균이 결여 사용 CM. MOI는 저산소 배양기에서 8 시간 동안 1 품어을 = 센다이 바이러스를 추가합니다. </li><li> 추가 시간 포인트가 필요한 경우, 4 시간 후 바이러스 함유 배지를 제거하고 BMP4 / A / P의 CM으로 대체. 세포를 수집RNA 분리하는 셀 스크레이퍼를 사용. </li><li> 바이러스 반응 (18)에 관여하는 유전자에 대한 QRT-PCR을 수행하여 바이러스 감염의 효율성을 확인합니다. </li></ol></li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRACHYURY+and+CDX2+mediate+BMP-induced+differentiation+of+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells+into+embryonic+and+extraembryonic+lineages.">BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages.</a> Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+BMP-4+treatment+initiates+mesoderm+induction+in+human+embryonic+stem+cells.">Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).</li><li>Vallier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cell+fate+decisions+of+human+embryonic+stem+cells+and+mouse+epiblast+stem+cells+are+controlled+by+the+same+signalling+pathways.">Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways.</a> PloS one. 4 (6), e6082 (2009).</li><li>Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+fibroblast+growth+factor+(FGF)+receptor+2+suggests+a+role+for+FGF+signaling+in+pregastrulation+mammalian+development.">Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).</li><li>Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF2+sustains+NANOG+and+switches+the+outcome+of+BMP4-induced+human+embryonic+stem+cell+differentiation.">FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).</li><li>Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+inhibition+directs+BMP4-mediated+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+syncytiotrophoblast.">FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast.</a> Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).</li><li>Bischof, P., Irminger-Finger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+cytotrophoblastic+cell,+a+mononuclear+chameleon.">The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).</li><li>Cole, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycosylated+hCG,+a+review.">Hyperglycosylated hCG, a review.</a> Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).</li><li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leucocyte+antigen+(HLA)+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines,+determined+using+single+antigen+beads+to+characterize+allotype+specificities+of+anti-HLA+antibodies.">Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

우리는 영양막 세포의 전구 세포로 hESCs는 차별화를위한 기본 단계를 제시했다. 이 프로토콜은 최근 융모 세포의 분화를 증가시키고 통상적 BMP4 단독 치료로 관찰 중배엽 전구 세포의 생성을 방지 빠르게 티빈 / 노달 시그널링 억제제의 추가 hESCs는 차별화하기 위해 최적화되었다. BMP4 모델 시스템은 인간의 영양막 세포 계보 사양 및 확장의 초기 단계의 시험을 허용한다. 또한,이 BMP4 모델 시스템?...

태반은 임신 중 태아의 성장과 생존에 필요한 산모와 태아 순환 사이의 가스, 영양소, 노폐물, 호르몬의 교환을 용이하게한다. 포유류 배아 발생 동안 형성된 제 기관 6-7 일을 인간 임신 후 생쥐 1, 2, 3, 4 일 3.5-4.5 개발 시작 태반이다. 융모 세포는 태반의 가장 중요한 세포이며, 이러한 세포는 포유 동물 배아의 초기 계통 분화 이벤트 중 하나를 나타낸다. 그들은 착상 전 배반포의 외부 여분의 배아 trophectoderm 세포에서 발생한다. 태반 개발 초기 단계의 우리의 지식은 초기 인간 발달을 모델링에 대한 윤리적, 물류 제한에 의해 제한된다. 배아 이식, trophoblasts 중임산부 상피 세포를 침공하고 전문 전구 세포 (5)로 분화. Cytotrophoblasts (CTBS)의 융합 및 syncytiotrophoblasts (않은 SYN) 및 extravillous 침입 trophoblasts (EVTs)로 분화, 미분화 전구 세포를 단핵하는 앵커 자궁 태반을. 않은 SYN은 임신 유지에 필요한 호르몬을 합성 말기 분화 세포를 다핵 있습니다. 융모 세포에 손상이 유산, 전자 간증, 자궁 내 성장 제한 한 결과로 EVTs 및 않은 SYN을 생성 초기 분화 이벤트는, 태반 형성에 필수적이다. 개발 된 인간 영양막 세포주의 종류 CTBS 태반 호르몬 및 디스플레이 속성 침습 6 생산 융모 상피암를 불멸화 포함한다. 인간의 첫 번째 임신의 태반에서 차 융모 세포는 고립하지만, 세포 빨리 DIF 할 수 있습니다ferentiate 및 체외에서 증식 중지합니다. 중요한 변형 일차 세포주는 종양 및 영양막 불멸화 세포주 정확하게 차 trophoblasts 7 표현되지 않을 수 있음을 나타내는 다른 유전자 발현 프로파일을 갖는다. 또한,이 라인은이 세 번째 학기를 통해 첫 번째 이후의 단계에서 파생되기 때문에 태반의 영양막 세포 줄기 세포 전구 세포를 닮은 않을 것이다. 태반의 형성 및 기능의 초기 사건을 연구하기 위해 초기 단계 인간 trophoblasts의 체외 배양 시스템에서 강력한 필요성이있다. 착상 전 배아의 내부 세포괴와 속성을 공유하는 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)은, 종종 조기 태반의 형성을 포함한 초기 인간 현상을 모델링하기 위해 사용된다. 두 사람의 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 및 hESCs는 뼈 모르를 사용하여 체외에서 trophoblasts로 분화 될 수있다phogenic 단백질 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. BMP4을 이용한 융모 세포로 다 능성 세포의 이러한 변환은 인간 세포에 특이하고 초기 인간 배아 구 (16)에 대한 액세스를 필요로하지 않기 때문에 널리 초기 인간 태반의 개발을 연구하는데 사용된다. 최근에는 발견되었다는 억제제의 첨가 A83-01 (A) 및 된 Smad2 / 3, MEK1 / 2의 신호 전달 경로를 차단 PD173074 (P)는, trophectoderm 같은 조상 주로 않은 SYN으로 hPSC 분화의 효율을 증대 및 중배엽, 내배엽, 또는 외배엽 세포 9, 17의 광범위한 세대가없는 EVTs, </suP&gt;. 십이일 인간 포배 단계의 배아로부터 단리 trophectoderm 세포와 유사한 유전자 발현 프로필을 가지며 각종 태반 특정한 성장 호르몬 분비에 대한 이러한 매질 조건을 이용하여, hESCs는이 시험 관내 모델 시스템 (9), (11)의 유효성을지지 차별화. 여기서는 BMP4 / A / P 배지를 이용하여 인간 전구 세포 영양막에 hPSCs의 생체 외 분화에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이러한 조건은 리포 펙션 - 매개 형질 전환을 사용하여 RNA 서열, 유전자 파괴 된 siRNA를 이용하여, 병원체 감염, 유전 적 변형을 포함한 다양한 애플리케이션에 세포 과잉수 생산.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Knock Out Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>This is referred to as &quot;serum replacement&quot; in this protocol.</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Millipore</td><td>GF-003</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Rock inhibitor Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>Irradiated CF1 MEFs</td><td>GlobalStem</td><td>6001G</td><td>MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150i low oxygen incubator</td><td>Heracell/VWR</td><td>89187-192</td><td>Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>PD173074</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3044/10</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td>Trizol is used to isolate total RNA.</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>This is referred to as &quot;extracellular matrix&quot; in this protocol.</td></tr></tbody></table>

in vitro differentiation of human pluripotent stem cells into trophoblastic cells

태반은 배아 발생 동안 처음 개발 기관이며, 배아의 생존을 위해 필요하다. 태반이 착상 전 배반포의 여분의 배아 trophectoderm 세포로부터 분화 다양한 융모 세포로 구성되어 있습니다. 이와 같이, 인간 태반의 초기 분화 이벤트에 대한 우리의 이해 때문에 인간 배아의 분리 및 조작에 대한 윤리적, 법적 제한으로 제한됩니다. 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)은 인간 발달을 조사하기위한 견고한 모델 시스템이며 또한 다양한 영양막 세포 유형의 마커를 발현 융모 세포로 생체 외에서 분화 될 수있다. 여기서, 우리는 뼈 형태 형성 단백질 (4) 및 티빈 / 노달 신호 전달 경로의 저해제를 사용하여 세포 내로 융모 hPSCs를 구별하기위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜 된 siRNA로 형질 감염 될 수있는 다양한 영양막 세포 유형을 생성손실의 기능 표현형을 조사 또는 병원균에 감염 될 수있다합니다. 또한, hPSCs는 유전자 변형 될 수 있고, 당시의 기능 이득 분석을 위해 영양막 세포의 전구 세포로 분화. hPSCs부터 인간 trophoblasts를 발생이 체외 분화 방법은 초기 인간 배아 작업의 윤리적 법적 제한을 극복하고,이 시스템은 약물 발견 및 줄기 세포 연구를 포함한 다양한 용도에 사용될 수있다.

hPSCs의 체외 분화의 개요 이 체외 분화 프로토콜은 하나의 통로 (그림 1A)에 대한 조건없는 공급기로 전환하는 MEFs에 성장 미분화 hESCs는 시작됩니다. 우리는이 프로토콜에 hESCs는의 분화를 설명하는 동안, 우리는 성공적으로 융모 세포로 hiPSCs를 구별하기 위해이 프로토콜을 사용했다. 세포 외 매트릭스?...

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In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

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In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

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8.5K 조회수.  University of Pennsylvania. Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

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Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

인간 세포 배양을위한 회전 세포 배양 시스템 : 모델로 인간 Trophoblast 셀

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

연구

생체공학

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

인간의 기본 영양막 세포 멜라토닌에 대해 저산소증의 보호 효과를 연구하기 위해 세포 배양 모델 / 재산 소화에 의한 혼란

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

발생학

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells differentiate into primary trophoblast giant cells (TGCs) while the polar trophectoderm overlying the inner cell mass continues to proliferate later differentiating into secondary TGCs. TGCs play a key role in developing placenta and are essential for a successful pregnancy. Investigation of transcriptional regulation of specific genes during post-implantation development can give insights into TGCs development. Cells of the ectoplacental cone (EPC) from embryos at 7-7.5 days of gestation (E7-7.5), derived from the polar trophectoderm, differentiate into secondary TGCs1. TGCs can be studied in situ, on cryostat sections of embryos at E7 although the number of TGCs is very low at this stage. An alternative means of analyzing secondary TGCs is to use short-term cultures of individual EPCs from E7 embryos. We propose a technique to investigate the transcriptional status of genes of interest both in vivo and in vitro at the single-cell level using fluorescent in situ hybridization (RNA FISH) to visualize nascent transcripts. This technique provides a direct readout of gene expression and enables assessment of the chromosomal status of TGCs, which are large endoreplicating cells. Indeed, a key feature of terminal differentiation of TGCs is that they exit the cell cycle and undergo multiple rounds of endoreplication.This approach can be applied to detect expression of any gene expressed from autosomes and/or sex chromosomes and can provide important information into developmental mechanisms as well as placental diseases.

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

의 초기 RNA 물고기에 의해 전사 분석<em&gt; 생체</em&gt; 영양막 세포 거대 세포 또는<em&gt; 체외</em&gt; Ectoplacental 콘의 Explants의 단기 문화

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

신경과학

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Blastocysts에서 마우스 Trophoblast의 줄기 세포의 유도

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

생물학

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend on its ability to efficiently, timely, and faithfully recapitulate the sequences of blastocyst development (morphogenesis, specification, patterning), and to form cells reflecting the blastocyst stage. Here we show that na&#239;ve human pluripotent stem cells cultured in PXGL conditions and then triply inhibited for the Hippo, transforming growth factor- &#946;, and extracellular signal-regulated kinase pathways efficiently undergo morphogenesis to form blastoids (&gt;70%). Matching with developmental timing (~4 days), blastoids unroll the blastocyst sequence of specification by producing analogs of the trophoblast and epiblast, followed by the formation of analogs of the primitive endoderm and the polar trophoblasts. This results in the formation of cells transcriptionally similar to the blastocyst (&gt;96%) and a minority of post-implantation analogs. Blastoids efficiently pattern by forming the embryonic-abembryonic axis marked by the maturation of the polar region (NR2F2+), which acquires the specific potential to directionally attach to hormonally stimulated endometrial cells, as in utero. Such a human blastoid is a scalable, versatile, and ethical model to study human development and implantation in vitro.

A protocol outlining the formation of human blastoids that efficiently, timely, and sequentially generate blastocyst-like cells.

인간 배반포 모델링 배반포 개발 및 이식을 위한 프로토콜

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend ...

Analyzing Angiogenesis: In Vitro Assay for Tube Formation on BM Matrix

Trophoblast Cell Recovery from Angiogenesis-Tube Formation Assay for Differentiation Marker Expression Analysis

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of mesenchymal to endothelial-like transition. Traditionally, this process is evaluated by an in vitro tube-formation assay, where the cells organize themselves into tube-like structures when seeded over a polymerized basement membrane preparation. Although several structural features can be measured in photomicrographs of the structures, to assess the real commitment of EVT to the endothelial-type phenotype, biochemical analysis of cell extracts is required. Scraping the cells from the culture dish to obtain RNA and/or protein extracts is not an alternative since the tube-like structures are severely contaminated by the bulk of proteins from the polymerized basement membrane. Thus, a strategy to separate the cells from the basement membrane proteins prior to the preparation of cell extracts is needed. Here, a simple, fast, and cost-effective method to recover the tube-like structures from the in vitro tube-formation assay and the subsequent analysis by biochemical techniques is presented. Tube-like structures formed by HTR8/SVneo cells, an EVT cell line, were liberated from the polymerized basement membrane by a short incubation with PBS supplemented with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). After serial washes, a ready-to-use pellet of purified tube-like structures can be obtained. This pellet can be subsequently processed to obtain RNA and protein extracts. qPCR analysis evidenced the induced expression of VE-cadherin and alphav-integrin, two endothelial cell markers, in EVT-derived tube-like structures compared to control cells, which was consistent with the induction of the endothelial cell marker, CD31, evaluated by immunofluorescence. Western blot analysis of the tube-like structures' protein extracts revealed the overexpression of RECK in transfected HTR8/SVneo cells. Thus, this simple method allows to obtain cell extracts from the in vitro tube-formation assay for the subsequent analysis of RNAs and protein expression.

The present protocol allows the recovery of tube-like structures formed in the classical in vitro angiogenesis-tube formation assay where cells, such as trophoblast cells, organize in capillary-like structures over a layer of extracellular basement membrane matrix. The recovered structures are used for RNA and protein isolation for various biochemical analyses.

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...