この研究はドイツ学術協会（CRC1039 A3）と研究助成プログラムヘッセン州の「LandesoffensiveツアEntwicklung wissenschaftlich-ökonomischerExzellenz」（LOEWE）、トランスレーショナル医学・薬理学TMPとそうでないクローネ-フレゼニウス財団研究センターによってサポートされていました（EKFS）、研究研修グループトランスレーショナルリサーチイノベーション - ファーマ（TRIP）。

SJL / Jマウスにおける1 EAEの誘導<ol><li> マウス <ol><li> 11週齢の雌SJL / Jマウスを使用し、それらは約7日間の実験室に馴化することができます。グループあたりのn = 10匹のマウスを使用してください。 </li><li>薬物の効果を評価するために、免疫後3又は5日出発連続飲料水を介してまたは餌ペレットを介して制御グループの薬物およびプラセボを投与する（群あたりn = 10）。疾患のピーク時には、牛乳または3％の砂糖水に浸したコーンフレークと薬またはプラセボを投与します。 </li></ol></li><li> 予防接種材料 <ol><li>完全フロイントアジュバント（CFA、熱殺菌された結核菌H37 Ra）が2バイアル（各5μg）とエマルジョン中の抗原からなるEAE誘導キット（プロテオリピドタンパク質のペプチド、PLP139-151、1mg / mlのエマルジョン）を使用します凍結乾燥した百日咳毒素（PTX）の。 </li><li> すなわち、&lt;; 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBSにPTX（2μg/ ml）を溶解させ/ em&gt;の）、各PTXチューブにPBSの1.5 mLを加え、よく混ぜ、同じピペットチップで除去し、50 mLチューブ中の1mLのPBSに追加します。よく混ぜます。 </li></ol></li><li> 免疫 <ol><li>尾の基部に、2箇所にそれぞれ100μL、両方をPLP / CFAの皮下に注入します。背中上部または首の皮膚内の任意の免疫反応が頭のイメージングおよび脊髄の障害になるので、首の後ろに注入しないでください。 </li><li>免疫後2時間および24時間で二 - 、二回マウス当たり、腹腔内（ip）第1のPTXの100μLを注入します。 </li><li>対照マウスでは、PLPなしPLPなしCFA（100μLの2箇所）を加えたPTXを注入します。 </li></ol></li><li> マウスは免疫後の取り扱い <ol><li> 7日目に一日おきにマウスを計量し、その後、毎日それらの重量を量ります。 注：マウスは約1失う - EAE間に体重を2g。減少は、EAEの発症をマーク。 </li><li> 7日目アコードから毎日臨床症状を評価します運動機能に明らかな変化を、0.5スコア：標準スコアリングシステムにる（ すなわち、スコア0ない尾の先端麻痺を;スコア1：完全な尾の麻痺を、1.5スコア：1または両方の後肢の軽度の不全麻痺;スコア2：後ろ足の深刻な麻痺;スコア2.5：1後肢の完全麻痺;スコア3：両方の後肢の完全麻痺; 3.5スコア：後肢と1前脚の麻痺の完全な麻痺が3.5以上のスコアのためにマウスを安楽死させます&gt; 12時間。 </li></ol></li><li> EAEコースや撮影時 <ol><li>免疫後12 - マウスは10日目の周りに発生するスコア&gt; 1に達したときに、疾患の発症時に最初の撮影を行います。 </li><li> 3日 - 初期症状が発症する1または2日後に到達され、1持続しますピーク時の第2の撮像を実行します。 注：その後、マウスは完全に7〜10日以内に回復します。インターバル中のイメージングは​​、依然として、血管の漏れを示すことができますしかし、炎症の指標が負でなければなりません。 </li></ol></li></ol> 2.生物発光と視神経炎と脳炎症の近赤外イメージング<ol><li> イメージング・システムのセットアップ <ol><li>生物発光と近赤外信号の解析を可能にする機器をin vivoイメージングに行います。 </li><li>全てのイメージング手順の間に2.5％イソフルラン麻酔 - 2の下にマウスを保管してください。 </li><li>中央のガス供給を使用して、装置内で互いに横に位置1または2匹のマウス。中心部の上部脊椎を置きます。 </li><li>薬の効果の評価は、ペアを比較するために、同時に2匹のマウス、グループごとに1つを使用してください。これは、生物発光イメージングのために重要です。 </li><li>黒い布を用いた免疫化の部位を遮蔽し、マウス/マウスの正確な位置決めを評価するために写真とベースライン画像を取ります。すべての画像のためのカメラに6.5 cmの距離でB-フォーカスを使用してください。 </li></ol></li><li> 生物発光炎症プローブの注射とイメージング <ol><li> in vivoイメージングシステム設定を使用：8ビニングエピBLIは、エムがオープンフィルタリング、例のフィルタブロック、FSTOP 1、B = 6.5センチメートル、広告露出120秒を集中。ベースライン画像を取ります。 </li><li>すぐに使用できる化学発光試薬（40ミリグラム/ mL）を100μLの腹腔に注入します。注射器を充填する前によく混ぜます。 </li><li>生物発光画像5、10、および注射後15分をキャプチャします。生物発光ピークの時間経過は、動物間で異なります。 注：ピークは5発生します - 注射後の10分。 15分での減少はそれ以上の画像が必要とされないことを示しています。異なる時間のコースのためにマイナーなバイアスを排除するためにコントロール群と処置群のマウスのペアを使用してください。 </li><li>実験に関連する説明を記入します。自動的にポップアップダイアログボックスを観察し、そのようなマウス系統、性別、時刻、プローブ注射、グループなどの時間などの情報を含みます。ファイルのすべての中のOを保存neのフォルダ;彼らは、時間タグとすべての記述があります。 </li></ol></li><li> BBBの整合性のための近赤外蛍光ナノ粒子の注射とイメージング <ol><li> B-フォーカス（：6.5センチメートル距離）に近赤外落射蛍光イメージングを使用してください。ペグ化蛍光ナノ粒子の励起/発光最大値は690分の675 nmです。 Ex640 / Em700およびEx675 / Em720で、異なる波長で2つの画像をキャプチャ。 8ビニング2-のエクスポージャーを、使用、およびFSTOP 2は、ベースライン画像を取ります。 </li><li>尾静脈を介してペグ化された蛍光赤外線ナノ粒子の70μLの静脈注入し、マウスを3時間と、上記の設定を使用して、注射後24時間を想像してみてください。注射器を充填する前に、溶液をよく混ぜます。 </li><li>シグナルの特異性を評価するために必要とされる対照マウスにおける0.9％塩化ナトリウム、注射。 </li></ol></li><li> 注入及びMMP活性の近赤外蛍光プローブのイメージング <ol><li>剃るか、頭を脱毛するとuベースライン画像を撮影する前に、慎重に1日PPERの脊椎領域。皮膚が負傷してはいけません。 </li><li> B-フォーカス（：6.5センチメートル距離）に近赤外落射蛍光イメージングを使用してください。 MMPの活性化プローブの励起/発光最大値は700分の680 nmです。 Ex640 / Em700およびEx675 / Em720で、異なる波長で2つの画像をキャプチャ。 8ビニング1-sの露出を、使用、およびFSTOP 2は、ベースライン画像を取ります。 </li><li>それは、10匹のマウスのために十分になるようにすぐに使用できる溶液（1×PBS中で20ナノモル/ 1.5 mL）を1.5 mLチューブに1×PBSの200μLを加えます。注射器を充填する前によく混ぜます。 注：提供するボリュームは、いくつかのボリュームがシリンジ充填および注入中に失われていることを考慮に入れていません。 </li><li> 24時間イメージングの前に尾静脈を介してプローブivの150μLを注入します。シグナルの特異性を評価するためにのみ対照動物にPBSを注入します。 </li><li>注射後24時間の時点で、少なくとも二つの波長、Ex640 / Em700および実施例675 / Eでエピ-FLの画像を撮影しますM720は、設定で（8、およびFSTOP 2ビニング1-sの露出、フォーカスB）上記で説明しました。 注：2波長の使用は、非特異的シグナルを差し引くことによって、スペクトルアンミキシングを可能にします。 </li></ol></li></ol> 3.画像の解析<ol><li> 生物発光分析（BLI） <ol><li>それを開くためにソフトウェアをダブルクリックします。 </li><li>上部のメニューバーで、実験のフォルダのディレクトリに移動し、それを選択し、 ファイルブラウザのアイコンをクリックしてください。これは、テーブル内のフォルダ内のすべてのファイルを開きます。 </li><li>実験に関連する記述を示す列を設定します。 </li><li>品質管理のために、EAE信号の特異性を確認するために、EAEおよび/またはナイーブマウスの症状がなく、非レスポンダーマウスのファイルをダブルクリックします。 注：非応答マウスではないナイーブマウスの信号と最小の信号があってはなりません。 <ol><li>プロの注入前のベースライン画像をチェック信号の特異性のさらなる対照として、各マウスについてです。それが負でなければなりません。 </li></ol></li><li>画像を選択するには、最初のEAEマウスの最初のファイルをダブルクリックし、生物発光強度（LUTバー範囲）と局在を確認してください。すべての画像を一枚ずつ確認してください。各マウスの最安強度（ すなわち 、各マウスのための3つの画像のうち、2を保持）を使用してファイルを閉じます。 </li><li>画像調整と輸出<ol><li>定量化される最初のファイルをダブルクリックします。新しいウィンドウポップアップを確認します。 「オプション」（上部メニュー）の下では、各画像に表示するラベルをカスタマイズします。 </li><li>右側のツールパレットでは、に行く「画像調整」。デフォルトでは、最小値と最大強度は、「オート」に設定されており、虹の擬似カラーで表示されています。必要に応じて設定を変更するには、「手動」を選択します。 注：たとえば、エクスポートされたすべての画像が簡単に匹敵する同一のLUTバー（同一の最小値と最大値）を有していてもよいです。最小値と最大値の調整は、定量的な結果には影響しません。 </li><li>画像のエクスポート、選択PNG形式、ディレクトリ、およびイメージ名をクリックして</li></ol></li><li>関心領域の定量化（ROI） <ol><li>ツールパレットで「ROI」ツールに移動します。 ROI法（円、長方形、自動、また​​はフリーハンド）とROIの数を選択します。画像ウィンドウでポップアップROIウィンドウを確認します。 </li><li>マウスを使用して、サイズと位置を調整します。自動ROIツールを使用する場合は、すべての画像に対して同一のROIのしきい値を使用します。 ROIのサイズと位置を手動で（ 例えば、円形のROI）が定義されている場合は、すべての画像に対して同一の領域を使用してください。 </li><li> RO.I.が新しいウィンドウポップアップを観察し測定する」をクリックします。列をカスタマイズする（ 例えば、ファイル名、動物番号、グループ、実験、面積、総カウント、平均カウント、SD数、minとmaxはカウント、面積、時間ポイント、プローブ注入など ）の時間。カスタマイズされた設定を保存します。場合には、再ADYは、全てます（Ctrl + A）を選択し、スプレッドシートに表をコピーして貼り付けます。 </li><li>代わりにROIを持つPNGなどの画像をエクスポートします。保存した画像ファイルを閉じます。 </li></ol></li><li>定量化する必要があるすべての画像ファイルのために - （3.1.7 3.1.6ステップ）の手順を繰り返します。スプレッドシートにすべてのROIの定量化をコピーします。 注記：ここでは、結果等のグループ、時刻によってソートされ、統計的に分析することができます。統計分析のためのROIにおける生物発光シグナルの合計カウントを使用してください。 </li></ol></li><li> 蛍光ナノ粒子の近赤外（NIR）分析 <ol><li>ソフトウェアのコントロールを使用して、画像のしきい値を調整します。 注：これは、定量的な結果には影響を与えません。 </li><li>視覚信号の特異性を評価するために、EX /エム720分の675及びEX /エム700分の640で撮影した画像を比較します。 </li><li>定量分析のためにEX /エム720分の675で撮影した画像を使用してください（最大励起：680 nm）を。自動ROIツールを使用することができるためのROIを規定します。自動ROIのしきい値を調整し、すべての画像のためにそれを使用しています。関心領域内の総放射効率を定量化する（ステップ3.1参照）。 </li></ol></li><li> プロテアーゼ感受性プローブの近赤外（NIR）分析 <ol><li>ソフトウェアのコントロールを使用して、画像のしきい値を調整します。 注：これは、定量的な結果には影響を与えません。自家蛍光のスペクトルアンミキシングを行います。アンミキシングツールはイメージリビングに実装されます。自動アンミキシングは、自家蛍光画像などの特定および720分の675としてEX /エム700分の640を使用しています。 </li><li>混合されていない画像を選択し、上記のように、関心領域を定義します。定量的および統計分析のためのROI内の総放射効率を使用してください。 </li></ol></li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

現在のビデオは、SJL / JマウスにおけるEAEのin vivoイメージングにおける生物発光と近赤外蛍光のための技術を示しています。我々は、炎症感受性プローブを用いた生物発光イメージングは​​、主に視神経炎を示し、そして定量化はEAEの重症度の臨床評価および薬物の効果と一致することを示します。信号は脊柱によって吸収されるためしかし、生物発光イメージング法は、お?...

Multiple sclerosis is caused by the autoimmune-mediated attack and destruction of the myelin sheath in the brain and the spinal cord1. With an overall incidence of about 3.6 cases per 100,000 people a year in women and about 2.0 in men, MS is the second most common cause of neurological disability in young adults, after traumatic injuries2,3. The disease pathology is contributed to by genetic and environmental factors4 but is still not completely understood. Autoreactive T lymphocytes enter the central nervous system and trigger an inflammatory cascade that causes focal infiltrates in the white matter of the brain, spinal cord, and optic nerve. In most cases, these infiltrates are initially reversible, but persistence increases with the number of relapses. A number of rodent models have been developed to study the pathology of the disease. The relapsing-remitting EAE in SJL/J mice and the primary-progressive EAE in C57BL6 mice are the most popular models.
The clinical EAE scores, which describe the extent of the motor function deficits, and body weight are the gold standards to assess EAE severity. These clinical signs agree with the extent of immune cell infiltration and myelin destruction in the spinal cord and moderately predict drug treatment efficacy in humans5. However, these signs mainly reflect the destruction of the ventral fiber tracts in the spinal cord. Presently, there is no easy, non-invasive, reliable, and reproducible method to assess in vivo brain infiltration and optic neuritis in living mice. 
The in vivo imaging agrees with the 3 "R" principles of Russel and Burch (1959), which claim a Replacement, Reduction, and Refinement of animal experiments6, because imaging increases the readouts of one animal at several time points and allows for a reduction of the overall numbers. Presently, inflammation or myelin status is mainly assessed ex vivo via immunohistochemistry, FACS-analysis, or different molecular biological methods7, all requiring euthanized mice at specific time points. 
A number of in vivo imaging system probes have been developed to assess inflammation in the skin, joints, and vascular system. The techniques rely on the activation of bioluminescent or near-infrared fluorescent substrates by tissue peroxidases, including myeloperoxidase (MPO), matrix metalloproteinases (MMPs)8, and cathepsins9 or cyclooxygenase2. These probes have been mainly validated in models of arthritis or atherosclerosis9,10. A cathepsin-sensitive probe has also been used for fluorescence molecular tomographic imaging of EAE11. MMPs, particularly MMP2 and MMP9, contribute to the protease-mediated BBB disruption in EAE and are upregulated at sites of immune cell infiltration12, suggesting that these probes may be useful for EAE imaging. The same holds true for peroxidase or cathepsin-based probes. Technically, imaging of inflammation in the brain or spinal cord is substantially more challenging because the skull or spine absorb bioluminescent and near-infrared signals. 
In addition to inflammation indicators, fluorescent chemicals have been described, which specifically bind to myelin and may allow for quantification of myelination13. A near-infrared fluorescent probe, 3,3'-diethylthiatricarbocyanine iodide (DBT), was found to specifically bind to myelinated fibers and was validated as a quantitative tool in mouse models of primary myelination defects and in cuprizone-evoked demyelination14. In EAE, the DBT signal was rather increased, reflecting the inflammation of the myelin fibers5. 
An additional hallmark of EAE and MS is the BBB breakdown, resulting in increased vascular permeability and the extravasation of blood cells, extracellular fluid, and macromolecules into the CNS parenchyma. This can lead to edema, inflammation, oligodendrocyte damage, and, eventually, demyelination15,16. Hence, visualization of the BBB leak using fluorescent probes, such as fluorochrome-labeled bovine serum albumin5, which normally distribute very slowly from blood to tissue, may be useful to assess EAE.
In the present study, we have assessed the usefulness of different probes in EAE and show the procedure for the most reliable and robust bioluminescent technique. In addition, we discuss the pros and cons of near-infrared probes for MMP activity and BBB integrity.

<table><tbody><tr><td>AngioSpark-680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>NEV10149</td><td>Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity</td></tr><tr><td>MMP-sense 680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>NEV10126</td><td>Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation</td></tr><tr><td>XenoLight RediJect Inflammation Probe</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>760535</td><td>Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation</td></tr><tr><td>PLP139-151/CFA emulsion&amp;nbsp;</td><td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>EAE induction kit</td></tr><tr><td>Pertussis Toxin</td><td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>EAE induction kit</td></tr><tr><td>IVIS Lumina Spectrum</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td></td><td>Bioluminescence and Infrared Imaging System</td></tr><tr><td>LivingImage 4.5 software&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>CLS136334</td><td>IVIS analysis software</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Labs, Illinois, USA</td><td>26675-46-7</td><td>Anaesthetic</td></tr></tbody></table>

bioluminescence and near-infrared imaging of optic neuritis and brain inflammation in the eae model of multiple sclerosis in mice

SJL / Jマウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、再発寛解型多発性硬化症（RRMS）のモデルです。運動機能障害を記述する臨床EAEスコアは、脊髄の免疫媒介炎症の基本的な読み出しです。しかし、スコアおよび体重は脳の炎症と視神経炎のin vivoで評価することができません。後者は、約2/3のMS患者の早期かつ頻繁な症状です。ここでは、 インビボイメージングシステムを用いて、生きているマウスにおける生物発光およびEAEの視神経炎を誘発評価するための近赤外ライブイメージング、脳の炎症、及び血液脳関門（BBB）破壊するための方法を示します。酸化酵素によって活性化された生物発光基質は、主に視神経炎を示しました。信号は特異的であり、臨床スコアを並列薬の効果や病気の時間のコース、の可視化を可能にしました。 vasculatur内に留まったペグ化蛍光ナノ粒子長時間eがBBBの完全性を評価するために使用しました。近赤外イメージングは​​、疾患のピーク時BBB漏れを明らかにしました。信号は、目の周りの最も強かったです。マトリックスメタロプロテアーゼのための近赤外基質は、EAE誘発炎症を評価しました。自家蛍光は、定量化のためのスペクトルアンミキシングを必要とし、信号を妨害しました。全体として、生物発光イメージングは​​、EAEに関連する視神経炎および薬物の効果を評価するための信頼性の高い方法であり、シグナルの特異性、堅牢性、定量化の容易さ、及びコストの観点から近赤外の技術よりも優れていました。

視神経炎の生物発光の時間コース 炎症プローブの生物発光信号は、目の周りの最も強かったと視神経炎でEAEマウスでのみ発生しました。信号は非EAEマウスや炎症プローブを注入していないマウスでもないに発生しました。マウスが回復したときに信号が消失しました。したがって、信号は、視神経炎に特異?...

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Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

我々は、in vivoでのライブ生物発光およびSJL / Jマウスにおける多発性硬化症の実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルにおける視神経炎や脳炎の近赤外イメージングのための技術を示します。

マウスにおける多発性硬化症のEAEモデルにおける視神経炎と脳炎症の生物発光と近赤外イメージング

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing ...

bioluminescence-near-infrared-imaging-optic-neuritis-brain

Research

JoVE Journal

Medicine

9.1K ビュー.  University Hospital Frankfurt. 我々は、in vivoでのライブ生物発光およびSJL / Jマウスにおける多発性硬化症の実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルにおける視神経炎や脳炎の近赤外イメージングのための技術を示します。 

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Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

医学

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

免疫・感染学

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

神経科学

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein prionoids, which cause neuropathology within the central nervous system (CNS). Here we describe that intraglossal or intraperitoneal injection of alpha-synuclein fibrils into bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which overexpress human alpha-synuclein with the A53T mutation from the prion protein promoter and firefly luciferase from the promoter for glial fibrillary acidic protein (Gfap), is sufficient to induce neuropathologic disease. In comparison to homozygous Tg(M83+/+) mice that develop severe neurologic symptoms beginning at an age of 8 months, heterozygous Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) animals remain free of spontaneous disease until they reach an age of 22 months. Interestingly, injection of alpha-synuclein fibrils via the intraperitoneal route induced neurologic disease with paralysis in four of five Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice with a median incubation time of 229 &#177;17 days. Diseased animals showed severe deposits of phosphorylated alpha-synuclein in their brains and spinal cords. Accumulations of alpha-synuclein were sarkosyl-insoluble and colocalized with ubiquitin and p62, and were accompanied by an inflammatory response resulting in astrocytic gliosis and microgliosis. Surprisingly, inoculation of alpha-synuclein fibrils into the tongue was less effective in causing disease with only one of five injected animals showing alpha-synuclein pathology after 285 days. Our findings show that inoculation via the intraglossal route and more so via the intraperitoneal route is suitable to induce neurologic illness with relevant hallmarks of synucleinopathies in Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice. This provides a new model for studying prion-like pathogenesis induced by alpha-synuclein prionoids in greater detail.

Peripheral injection of alpha-synuclein fibrils into the peritoneum or tongue of Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which express human alpha-synuclein with the familial A53T mutation and firefly luciferase, can induce neuropathology, including neuroinflammation, in their central nervous system.

α-シヌクレイン線維の末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with embedded pericytes, and the glia limitans composed by the parenchymal basement membrane and astrocytic end-feed embracing the abluminal aspect of central nervous system (CNS) microvessels. In addition to maintaining CNS homeostasis the NVU controls immune cell trafficking into the CNS. During immunosurveillance of the CNS low numbers of activated lymphocytes can cross the endothelial barrier without causing BBB dysfunction or clinical disease. In contrast, during neuroinflammation such as in multiple sclerosis or its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) a large number of immune cells can cross the BBB and subsequently the glia limitans eventually reaching the CNS parenchyma leading to clinical disease. 
Immune cell migration into the CNS parenchyma is thus a two-step process that involves a sequential migration across the endothelial and glial barrier of the NVU employing distinct molecular mechanisms. If following their passage across the endothelial barrier, T cells encounter their cognate antigen on perivascular antigen-presenting cells their local reactivation will initiate subsequent mechanisms leading to the focal activation of gelatinases, which will enable the T cells to cross the glial barrier and enter the CNS parenchyma. Thus, assessing both, BBB permeability and MMP activity in spatial correlation to immune cell accumulation in the CNS during EAE allows to specify loss of integrity of the endothelial and glial barriers of the NVU. 
We here show how to induce EAE in C57BL/6 mice by active immunization and how to subsequently analyze BBB permeability in vivo using a combination of exogenous fluorescent tracers. We further show, how to visualize and localize gelatinase activity in EAE brains by in situ zymogaphy coupled to immunofluorescent stainings of BBB basement membranes and CD45+ invading immune cells.

Here, we present protocols to investigate impairment of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. We specifically address how to determine blood-brain barrier permeability and gelatinase activity involved in leukocyte migration across the glia limitans.&#160;

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1gfp/gfpレポーター マウスの画像

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

EAE疾患の重症度を評価するための脊髄の組織学的染色

Scoring Central Nervous System Inflammation, Demyelination, and Axon Injury in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a common immune-based model of multiple sclerosis (MS). This disease can be induced in rodents by active immunization with protein components of the myelin sheath and Complete Freund&#39;s adjuvant (CFA) or by the transfer of myelin-specific T effector cells from rodents primed with myelin protein/CFA into na&#239;ve rodents. The severity of EAE is typically scored on a 5-point clinical scale that measures the degree of ascending paralysis, but this scale is not optimal for assessing the extent of recovery from EAE. For example, clinical scores remain high in some EAE models (e.g., myelin oligodendrocyte glycoprotein [MOG] peptide-induced model of EAE) despite the resolution of inflammation. Thus, it is important to complement clinical scoring with histological scoring of EAE, which also provides a means to study the underlying mechanisms of cellular injury in the central nervous system (CNS).
Here, a simple protocol is presented to prepare and stain spinal cord and brain sections from mice and to score inflammation, demyelination, and axonal injury in the spinal cord. The method for scoring leukocyte infiltration in the spinal cord can also be applied to score brain inflammation in EAE. A protocol for measuring soluble neurofilament light (sNF-L) in the serum of mice using a Small Molecule Assay (SIMOA) assay is also described, which provides&#160;feedback on the extent of overall CNS injury in live mice.

著者スポットライト:多発性硬化症における肥満と自己免疫性炎症を結びつける経路の解明 

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) serves as an animal model of multiple sclerosis. This article describes an approach for scoring spinal cord inflammation, demyelination, and axonal injury in EAE. Additionally, a method to quantify soluble neurofilament light levels in the mice serum is presented, facilitating the assessment of axonal injury in live mice.

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系の炎症、脱髄、および軸索損傷のスコアリング

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a common immune-based model of multiple sclerosis (MS). This disease can be induced in rodents by ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in a Transgenic Mouse

<a href='https://app.jove.com/v/55503/bioluminescence-imaging-neuroinflammation-transgenic-mice-after'>Source: Breid, S., et. al. Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils. J. Vis. Exp. (2017)</a>This video demonstrates the bioluminescence imaging of neuroinflammation in transgenic mice, showcasing luciferase-luciferin reactions in activated astrocytes. The protocol enables non-invasive quantification of astrocytic activation, aiding studies on CNS inflammation and therapeutic efficacy.

Source: Breid, S., et. al. Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils. J. ...

マウスにおける多発性硬化症のEAEモデルにおける視神経炎と脳炎症の生物発光と近赤外イメージング

要約

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Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

α-シヌクレイン線維の末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1^gfp/gfpレポーターマウスの画像

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系の炎症、脱髄、および軸索損傷のスコアリング

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系の炎症、脱髄、および軸索損傷のスコアリング

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系の炎症、脱髄、および軸索損傷のスコアリング

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in a Transgenic Mouse

マウスにおける多発性硬化症のEAEモデルにおける視神経炎と脳炎症の生物発光と近赤外イメージング

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Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

α-シヌクレイン線維の末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1gfp/gfpレポーター マウスの画像

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系の炎症、脱髄、および軸索損傷のスコアリング

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系の炎症、脱髄、および軸索損傷のスコアリング

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系の炎症、脱髄、および軸索損傷のスコアリング

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in a Transgenic Mouse

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1^gfp/gfpレポーターマウスの画像