이 연구는 독일 연구 협회 (CRC1039 A3) 및 연구 자금 지원 프로그램 헤센, 중개 의학 및 약학 TMP 연구 센터의 주 &quot;Landesoffensive 주르 ENTWICKLUNG wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz&quot;(LOEWE)과 그렇지 크로네-는 Fresenius 재단 지원 (EKFS), 연구 교육 그룹 중개 연구 혁신 - 제약 (TRIP).

SJL 1. EAE 유도 / J 마우스 <ol><li> 마우스 <ol><li> 11 주 된 여성 SJL / J 마우스를 사용하고이 약 7 일 동안 실험 방으로 길들 할 수 있습니다. 그룹 당 N = 10 마우스를 사용합니다. </li><li> 약물 효과의 평가를 위해 연속적으로 식수 통하거나 3 오일 면역화 후 (N = 그룹당 10)을 출발 음식 펠릿 통해 대조군 약물 위약을 투여. 질병의 피크 동안 우유 또는 3 % 설탕 물에 젖은 콘플레이크와 약물 또는 위약을 관리 할 수 ​​있습니다. </li></ol></li><li> 면역 물질 <ol><li> 완전한 프로 인트 보조제 (CFA, 열 사망 결핵균 H37 Ra)가 2 병 (5 μg의 각)와 에멀젼에 EAE 유도 키트 항원으로 구성된 (테오 단백질의 펩티드, PLP139-151, 1 ㎎ / ㎖ 에멀젼)를 사용하여 동결 건조 백일해 독소 (PTX). </li><li> 1X 인산염 완충 식염수에서 PTX (2 μg의 / ㎖) (PBS를 녹이고, 즉, &lt;/ EM&gt;에서) 같은 피펫 팁과 제거, 잘 혼합하고, 50 mL의 튜브에 PBS 1 ㎖에 추가하는 각 PTX 튜브에 PBS 1.5 mL를 넣어; 잘 섞다. </li></ol></li><li> 면제 <ol><li> 꼬리의 기부에,이 부분의 각 100 μL를 모두 PLP / CFA 피하 주입한다. 상단 뒤쪽이나 목의 피부에있는 면역 반응이 머리와 척수의 영상을 방해하기 때문에, 목에의 뒷면에 삽입하지 마십시오. </li><li> 접종 후 2 시간 및 24 시간의 초 - 당 두번 마우스 복강 PTX (IP) 100 μL, 상기 제 1 주입한다. </li><li> 제어 생쥐 들어 PLP없이 PLP없이 CFA (100 μL의 두 부분) 플러스 PTX 주입. </li></ol></li><li> 마우스 예방 접종 후 처리 <ol><li> 쥐에게 하루 7 매일 최대의 무게를 측정 한 다음 매일을 무게. 주 : 마우스 1 잃게 - EAE 동안 체중을 2g. 감소는 EAE의 발병을 표시합니다. </li><li> 7 일 협정 매일 임상 증상을 평가운동 기능의 명백한 변화를 0.5 점수 : 표준 점수 시스템에 보내고 (즉, 0 점수 없습니다 꼬리의 말단 마비 1 점수 : 전체 꼬리 마비를 1.5 점수 : 하나 또는 두 뒷다리의 가벼운 마비 2 점수 : 뒷 다리의 심한 마비, 점수 2.5 : 하나의 뒷 다리의 완전 마비; 골 3 : 두 뒷다리의 완전한 마비, 3.5 점수 :. 뒷다리 하나 앞 다리의 마비의 완전 마비는 3.5 이상의 점수에 대한 함께 쥐를 안락사 &gt; 12 시간. </li></ol></li><li> EAE 코스와 영상의 시간 <ol><li> 접종 후 12 - 마우스는 10 일째 주위 발생 점수&gt; 1에 도달하면,이 질병의 발병에 제 1 이미징을 수행한다. </li><li> 삼일 - 초기 증상이 후 1 ~ 2 일에 도달되며, 1 동안 지속됩니다 피크에서 두 번째 영상을 수행합니다. 참고 : 그 후, 쥐가 완전히 7 ~ 10 일 이내에 복구합니다. 간격 동안의 이미지는 여전히 혈관 누수를 표시 할 수 있습니다하지만 염증 지표는 음수가 될 것이다. </li></ol></li></ol> 2. 발광 생물과 시신경염 및 뇌 염증의 근적외선 영상 <ol><li> 촬상 시스템의 설치 <ol><li> 생물 발광 근적외선 신호의 분석을 가능하게하는 장치와 생체 내 영상에 수행한다. </li><li> 모든 이미징 과정에서 2.5 %의 이소 플루 란 마취 - 2에서 쥐를 유지합니다. </li><li> 위치 하나 중간에 가스 공급 장치를 사용하여 장치에서 서로 옆에 두 개의 마우스. 중앙의 상부 척추를 놓습니다. </li><li> 약물 치료 효과의 평가가 쌍을 비교하기 위해, 동시에 두 개의 마우스, 그룹 당 하나를 사용하십시오. 이 생물 발광 이미징을위한 중요합니다. </li><li> 검은 천으로 예방 접종의 사이트를 보호하고 마우스 / 마우스의 정확한 위치를 평가하기 위해 사진과베이스 라인 이미지를 촬영합니다. 모든 이미지를 카메라에 6.5 cm의 거리를두고 B-초점을 사용합니다. </li></ol></li><li> 주입 및 생물 발광 염증 프로브 이미징 <ol><li> 생체 내 이미징 시스템 설정을 사용 : 8 비닝 에피 BLI는, 엠가 열려 필터링, 전 필터 블록, FSTOP 1, B = 6.5 cm, 광고 노출 (120)의 초점; 베이스 라인 이미지를 촬영. </li><li> 즉시 사용 가능한 화학 발광 시약 (40 ㎎ / ㎖)의 100 μL의 IP를 주입한다. 주사기를 채우기 전에 잘 섞는다. </li><li> 생물 발광 이미지를 5, 10, 및 주입 후 15 분 캡처. 생물 발광 피크의 시간 경과 동물간에 다르다. 주 : 최대 5 발생합니다 - 주입 후 10 분; 15 분에서 감소는 더 이상 이미지가 필요하지 않습니다 나타냅니다. 때문에 서로 다른 시간의 과정에 약간의 편견을 제거하기 위해 제어 및 치료 그룹의 마우스 쌍을 사용합니다. </li><li> 실험에 관련된 설명을 입력합니다. 자동 팝업 대화 상자를 관찰; 이 마우스 변형, 성별, 시점, 프로브 주입, 그룹 등의 시간 등의 정보를 포함한다. 파일 모두 O를 저장북동 폴더; 그들은 시간 태그와 모든 설명을해야합니다. </li></ol></li><li> BBB 무결성을위한 근적외선 형광 나노 입자의 주입 및 이미징 <ol><li> B 조 초점 (6.5 cm 거리)에 근적외선 표면 형광 이미징을 사용합니다. 페 길화 된 형광 나노 입자의 여기 / 발광 최대 값은 690분의 675 나노 미터이다. Ex640 / Em700 및 Ex675 / Em720에서 서로 다른 파장, 두 개의 이미지를 캡처; 8 비닝 2의 노출을 사용하고 FSTOP 2.베이스 라인 이미지를 가져 가라. </li><li> 꼬리 정맥을 통해 페 길화 된 형광 적외선 나노 입자의 70 μL 정맥 주사하고 쥐 3 시간과 위의 설정을 사용하여 주사 후 24 시간을 상상한다. 주사기를 채우기 전에 용액을 잘 섞는다. </li><li> 신호의 특이성을 평가하기 위해 필요하다 대조군 마우스에 0.9 % 염화 나트륨 주입한다. </li></ol></li><li> 주입 및 MMP 활성을위한 근 적외 형광 프로브의 이미징 <ol><li> 면도를하거나 머리를 털을 뽑다 및 유베이스 라인 이미지를 복용하기 전에 조심스럽게 일일 pper 척추 영역입니다. 피부가 손상되지 않아야합니다. </li><li> B 조 초점 (6.5 cm 거리)에 근적외선 표면 형광 이미징을 사용합니다. MMP를 기동 프로브의 여기 / 발광 최대 값은 700분의 680 나노 미터이다. Ex640 / Em700 및 Ex675 / Em720에서 서로 다른 파장, 두 개의 이미지를 캡처; 8 비닝 1의 노출을 사용하고 FSTOP 2.베이스 라인 이미지를 가져 가라. </li><li> 이 마우스 (10)에 충분하게되도록 즉시 사용 가능한 용액 (1X PBS 20을 nmol / 1.5 mL)을 1.5 ㎖의 튜브에 200 μL의 PBS 1X에 추가; 주사기를 채우기 전에 잘 섞는다. 참고 : 제공된 볼륨이 약간의 볼륨이 주사기 충전 및 주입시 손실을 고려하지 않습니다. </li><li> 촬상 전에 꼬리 정맥을 통해 24 시간 프로브 IV 150 μL를 주입한다. 신호의 특성을 평가하는 경우에만 대조군으로 PBS를 주입한다. </li><li> 주사 후 24 시간에서, 적어도 2 개의 파장, Ex640 / Em700 및 예 675 / E에 에피 FL 이미지를 가지고m720은 설정 (8 및 FSTOP 2 비닝 1의 노출, 초점 B) 위 설명했다. 주의 : 2 개의 파장의 사용이 비특이적 신호를 감산하여 스펙트럼 unmixing 허용한다. </li></ol></li></ol> 3. 이미지 분석 <ol><li> 생물 발광 분석 (BLI) <ol><li> 를 열 수있는 소프트웨어를 두 번 클릭합니다. </li><li> 상단 메뉴 바에서 실험의 폴더의 디렉토리로 이동을 선택, 파일 브라우저 아이콘을 클릭; 이 테이블에있는 폴더의 모든 파일을 엽니 다. </li><li> 실험에 관련된 설명을 표시하는 열을 구성합니다. </li><li> 품질 관리의 경우, EAE 신호의 특이성을 확인 EAE 및 / 또는 순진한 마우스의 증상없이 비 응답자 마우스의 파일을 더블 클릭합니다. 참고 : 순진 마우스와 비 응답자 마우스에서 최소한의 신호에는 신호가 없어야합니다. <ol><li> 프로의 주입하기 전에 기본 이미지를 확인신호의 특이성을 추가 대조군으로서 각 마우스 일; 그것은 부정적인해야합니다. </li></ol></li><li> 이미지를 선택하려면 첫 번째 EAE 마우스의 첫 번째 파일을 더블 클릭하고 생물 발광 강도 (LUT 바 범위) 및 현지화를 확인합니다. 모든 이미지를 하나씩 확인합니다. 각 마우스의 낮은 강도로 파일을 닫습니다 (즉, 각 마우스 2 3 중 이미지를 유지). </li><li> 이미지 조정 및 수출 <ol><li> 정량화 할 수있는 첫 번째 파일을 두 번 클릭합니다. 새 창 팝 업을 준수하십시오. &quot;옵션&quot;(상위 메뉴)에서 각 이미지에 표시 할 라벨을 사용자 정의 할 수 있습니다. </li><li> 오른쪽 도구 팔레트에서 이동 &quot;이미지 조정.&quot; 기본적으로 최소 및 최대 강도는 &quot;자동&quot;으로 설정하고 무지개 사색에 표시됩니다. 필요한 경우 설정을 변경하려면 &quot;사용 설명서&quot;를 선택합니다. 참고 : 예를 들어, 모든 내 보낸 이미지가 동일한 LUT 바 (동일 최소값과 최대 값)을 할 수 있습니다 쉽게 비교할 수 있습니다.최소값과 최대 값의 조정은 양적 결과에 영향을주지 않습니다. </li><li> 이미지 내보내기를 선택 PNG, 디렉토리 및 이미지 이름을 클릭 </li></ol></li><li> 관심 지역의 정량 (ROI) <ol><li> 도구 팔레트에서 &quot;ROI&quot;도구로 이동합니다. 투자 수익 (ROI) 방법 (원형, 사각형, 자동차, 또는 자유 손)와 로아의 수를 선택합니다. ROI를 창 이미지 창 팝업 관찰한다. </li><li> 마우스를 사용하여, 크기와 위치를 조정한다. 자동 ROI 툴을 사용하는 경우 모든 이미지에 대해 동일한 투자 수익 (ROI) 임계 값을 사용합니다. ROI의 크기와 위치를 수동으로 (예를 들어, 원형의 ROI) 정의 된 경우 모든 이미지에 대해 동일한 영역을 사용합니다. </li><li> RO.I. 새 창 팝업을 위로 관찰 측정 &quot;을 클릭합니다. 열을 사용자 정의 (예를 들어, 파일 이름, 동물 번호, 그룹, 실험, 면적, 총 수, 평균 횟수, SD 수, 최소 및 최대 카운트, 면적, 시간 포인트, 프로브 주입 등)의 시간. 사용자 정의 된 설정을 저장합니다. 때 다시ADY 모든 (Ctrl + A)를 선택하고 복사하여 스프레드 시트에 표를 붙여 넣습니다. </li><li> 장소에 ROI를 가진 PNG로 이미지를 내 보냅니다. 저장 한 이미지 파일을 닫습니다. </li></ol></li><li> 정량하는 데 필요한 모든 이미지 파일 -이 절차를 반복합니다 (3.1.7 3.1.6 단계). 스프레드 시트에 모든 ROI의 정량화를 복사합니다. 참고 : 여기에, 결과 등 그룹, 시점, 정렬 할 수 있습니다 통계적으로 분석 하였다. 통계 분석에 대한 ROI를에 생물 발광 신호의 총 수를 사용합니다. </li></ol></li><li> 형광 나노 입자의 근적외선 (NIR) 분석 <ol><li> 소프트웨어의 컨트롤을 사용하여 이미지의 임계치를 조정한다. 참고 :이 양적 결과에 영향을주지 않습니다. </li><li> 시각 신호의 특이성을 평가하기 위해 예 / 엠 720분의 675 및 예 ​​/ 엠 700분의 640에서 촬영 한 이미지를 비교. </li><li> 정량 분석에 대한 예 / 엠 720분의 675에서 촬영 한 화상을 사용하여 (여기 최대 : 680 ㎚). 자동 ROI 도구가 이용 될 수있는 로아를 정의. 자동 ROI 임계 값을 조정하고 모든 이미지를 사용합니다. 로아의 전체 방사 효율을 정량화한다 (단계 3.1 참조). </li></ol></li><li> 단백질 분해 효소에 민감한 프로브의 근적외선 (NIR) 분석 <ol><li> 소프트웨어 제어를 사용하여 이미지의 임계치를 조정한다. 참고 :이 양적 결과에 영향을주지 않습니다. 자동 형광 스펙트럼 unmixing을 수행합니다. unmixing 도구는 이미지 생활에서 구현됩니다. 자동 unmixing은 자동 형광 이미지로 특정하고 720분의 675로 예 / 엠 700분의 640을 사용합니다. </li><li> 혼합되지 않은 이미지를 선택하고 상술 한 바와 같이 ROI를 정의합니다. 정량 및 통계 분석에 대한 ROI를 총 방사 효율을 사용합니다. </li></ol></li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

본 동영상은 SJL / J 마우스의 EAE의 생체 내 이미징의 생물 발광 및 근적외선 형광을위한 기술을 보여줍니다. 우리는 염증에 민감한 프로브를 사용하여 생물 발광 영상은 주로 시신경염를 표시하고 정량화가 EAE 심각도의 임상 평가 및 약물의 효과에 동의 것으로 나타났다. 신호가 척추에 의해 흡수되기 때문에, 생물 발광 촬상 방법 가능성 EAE 현시 (17)의 기본 위치 인 요추 ?...

Multiple sclerosis is caused by the autoimmune-mediated attack and destruction of the myelin sheath in the brain and the spinal cord1. With an overall incidence of about 3.6 cases per 100,000 people a year in women and about 2.0 in men, MS is the second most common cause of neurological disability in young adults, after traumatic injuries2,3. The disease pathology is contributed to by genetic and environmental factors4 but is still not completely understood. Autoreactive T lymphocytes enter the central nervous system and trigger an inflammatory cascade that causes focal infiltrates in the white matter of the brain, spinal cord, and optic nerve. In most cases, these infiltrates are initially reversible, but persistence increases with the number of relapses. A number of rodent models have been developed to study the pathology of the disease. The relapsing-remitting EAE in SJL/J mice and the primary-progressive EAE in C57BL6 mice are the most popular models.
The clinical EAE scores, which describe the extent of the motor function deficits, and body weight are the gold standards to assess EAE severity. These clinical signs agree with the extent of immune cell infiltration and myelin destruction in the spinal cord and moderately predict drug treatment efficacy in humans5. However, these signs mainly reflect the destruction of the ventral fiber tracts in the spinal cord. Presently, there is no easy, non-invasive, reliable, and reproducible method to assess in vivo brain infiltration and optic neuritis in living mice. 
The in vivo imaging agrees with the 3 "R" principles of Russel and Burch (1959), which claim a Replacement, Reduction, and Refinement of animal experiments6, because imaging increases the readouts of one animal at several time points and allows for a reduction of the overall numbers. Presently, inflammation or myelin status is mainly assessed ex vivo via immunohistochemistry, FACS-analysis, or different molecular biological methods7, all requiring euthanized mice at specific time points. 
A number of in vivo imaging system probes have been developed to assess inflammation in the skin, joints, and vascular system. The techniques rely on the activation of bioluminescent or near-infrared fluorescent substrates by tissue peroxidases, including myeloperoxidase (MPO), matrix metalloproteinases (MMPs)8, and cathepsins9 or cyclooxygenase2. These probes have been mainly validated in models of arthritis or atherosclerosis9,10. A cathepsin-sensitive probe has also been used for fluorescence molecular tomographic imaging of EAE11. MMPs, particularly MMP2 and MMP9, contribute to the protease-mediated BBB disruption in EAE and are upregulated at sites of immune cell infiltration12, suggesting that these probes may be useful for EAE imaging. The same holds true for peroxidase or cathepsin-based probes. Technically, imaging of inflammation in the brain or spinal cord is substantially more challenging because the skull or spine absorb bioluminescent and near-infrared signals. 
In addition to inflammation indicators, fluorescent chemicals have been described, which specifically bind to myelin and may allow for quantification of myelination13. A near-infrared fluorescent probe, 3,3'-diethylthiatricarbocyanine iodide (DBT), was found to specifically bind to myelinated fibers and was validated as a quantitative tool in mouse models of primary myelination defects and in cuprizone-evoked demyelination14. In EAE, the DBT signal was rather increased, reflecting the inflammation of the myelin fibers5. 
An additional hallmark of EAE and MS is the BBB breakdown, resulting in increased vascular permeability and the extravasation of blood cells, extracellular fluid, and macromolecules into the CNS parenchyma. This can lead to edema, inflammation, oligodendrocyte damage, and, eventually, demyelination15,16. Hence, visualization of the BBB leak using fluorescent probes, such as fluorochrome-labeled bovine serum albumin5, which normally distribute very slowly from blood to tissue, may be useful to assess EAE.
In the present study, we have assessed the usefulness of different probes in EAE and show the procedure for the most reliable and robust bioluminescent technique. In addition, we discuss the pros and cons of near-infrared probes for MMP activity and BBB integrity.

<table><tbody><tr><td>AngioSpark-680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>NEV10149</td><td>Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity</td></tr><tr><td>MMP-sense 680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>NEV10126</td><td>Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation</td></tr><tr><td>XenoLight RediJect Inflammation Probe</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>760535</td><td>Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation</td></tr><tr><td>PLP139-151/CFA emulsion&amp;nbsp;</td><td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>EAE induction kit</td></tr><tr><td>Pertussis Toxin</td><td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>EAE induction kit</td></tr><tr><td>IVIS Lumina Spectrum</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td></td><td>Bioluminescence and Infrared Imaging System</td></tr><tr><td>LivingImage 4.5 software&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>CLS136334</td><td>IVIS analysis software</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Labs, Illinois, USA</td><td>26675-46-7</td><td>Anaesthetic</td></tr></tbody></table>

bioluminescence and near-infrared imaging of optic neuritis and brain inflammation in the eae model of multiple sclerosis in mice

SJL / J 쥐에 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)는 재발 - 완화 성 다발성 경화증 (RRMS)의 모델이다. 운동 기능 적자를 설명하는 임상 EAE 점수는 척수의 면역 매개 염증의 기본 판독입니다. 그러나 점수와 체중은 뇌의 염증과 시신경염의 생체 내 평가를 허용하지 않습니다. 후자는 2/3 MS 환자에서 초기 자주 표현된다. 여기서는 생체 촬상 시스템을 이용하여 살아있는 쥐 생물 발광과 EAE는 시신경염을 유발 평가 근적외선 라이브 영상, 뇌 염증 및 혈액 - 뇌 장벽 (BBB) 중단하는 방법을 보여준다. 산화 효소에 의해 활성화 생물 발광 기판은 주로 시신경염 나타났다. 신호는 특정이었고, 임상 점수를 병렬 약물 효과 및 질병 시간 과정의 시각화를 허용했다. vasculatur 내에 남아 페 길화 된 형광 나노 입자장시간 E는 BBB의 무결성을 평가하기 위해 사용되었다. 근적외선 영상은 질병의 피크에서 BBB 누수를 한 것으로 밝혀졌습니다. 신호는 눈 주위 강했다. 매트릭스 메탈 용 근적외선 기판 EAE - 유발 된 염증을 평가하기 위해 사용되었다. 자동 형광 정량 unmixing 스펙트럼을 요구 신호 간섭. 전반적으로, 생물 발광 이미징 EAE 관련 시신경염 약물 효과를 평가하기위한 신뢰성있는 방법이고 신호 특이성 견고성 정량의 용이성 및 비용면에서 근적외선 기술보다 우수 하였다.

시신경염의 생물 발광의 시간 코스 염증 프로브의 생물 발광 신호는 눈 주위 강한이었고 시신경염와 EAE 마우스에서만 일어났다. 신호는 비 EAE 마우스 나 염증 프로브를 주입하지 생쥐도 발생 하였다. 쥐를 복구 할 때 신호가 사라졌다. 따라서, 신호 시신경염 특정하고, 상기 신호의 피크 임상 EAE 스코어의 피크 평...

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Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

우리는 생체 살아있는 생물 발광 및 근적외선 SJL / J 마우스에서 다발성 경화증에 대한 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 모델에서 시신경염과 뇌염의 이미징 기술을 보여준다.

마우스의 다발성 경화증의 EAE 모델에서 시신경염 및 뇌 염증의 생물 발광 및 근적외선 영상

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing ...

bioluminescence-near-infrared-imaging-optic-neuritis-brain

Research

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Medicine

9.2K 조회수.  University Hospital Frankfurt.  우리는 생체 살아있는 생물 발광 및 근적외선 SJL / J 마우스에서 다발성 경화증에 대한 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 모델에서 시신경염과 뇌염의 이미징 기술을 보여준다. 

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Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

실험자가 면역 뇌척수염 성인 마우스에 유리 척수 Windows를 이식

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

연구

의학

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

면역학 및 감염병학

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

신경과학

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein prionoids, which cause neuropathology within the central nervous system (CNS). Here we describe that intraglossal or intraperitoneal injection of alpha-synuclein fibrils into bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which overexpress human alpha-synuclein with the A53T mutation from the prion protein promoter and firefly luciferase from the promoter for glial fibrillary acidic protein (Gfap), is sufficient to induce neuropathologic disease. In comparison to homozygous Tg(M83+/+) mice that develop severe neurologic symptoms beginning at an age of 8 months, heterozygous Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) animals remain free of spontaneous disease until they reach an age of 22 months. Interestingly, injection of alpha-synuclein fibrils via the intraperitoneal route induced neurologic disease with paralysis in four of five Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice with a median incubation time of 229 &#177;17 days. Diseased animals showed severe deposits of phosphorylated alpha-synuclein in their brains and spinal cords. Accumulations of alpha-synuclein were sarkosyl-insoluble and colocalized with ubiquitin and p62, and were accompanied by an inflammatory response resulting in astrocytic gliosis and microgliosis. Surprisingly, inoculation of alpha-synuclein fibrils into the tongue was less effective in causing disease with only one of five injected animals showing alpha-synuclein pathology after 285 days. Our findings show that inoculation via the intraglossal route and more so via the intraperitoneal route is suitable to induce neurologic illness with relevant hallmarks of synucleinopathies in Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice. This provides a new model for studying prion-like pathogenesis induced by alpha-synuclein prionoids in greater detail.

Peripheral injection of alpha-synuclein fibrils into the peritoneum or tongue of Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which express human alpha-synuclein with the familial A53T mutation and firefly luciferase, can induce neuropathology, including neuroinflammation, in their central nervous system.

알파 - 시누 클레인 브릴의 주변 접종 후 형질 전환 마우스의 신경 염증의 생물 발광 영상

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with embedded pericytes, and the glia limitans composed by the parenchymal basement membrane and astrocytic end-feed embracing the abluminal aspect of central nervous system (CNS) microvessels. In addition to maintaining CNS homeostasis the NVU controls immune cell trafficking into the CNS. During immunosurveillance of the CNS low numbers of activated lymphocytes can cross the endothelial barrier without causing BBB dysfunction or clinical disease. In contrast, during neuroinflammation such as in multiple sclerosis or its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) a large number of immune cells can cross the BBB and subsequently the glia limitans eventually reaching the CNS parenchyma leading to clinical disease. 
Immune cell migration into the CNS parenchyma is thus a two-step process that involves a sequential migration across the endothelial and glial barrier of the NVU employing distinct molecular mechanisms. If following their passage across the endothelial barrier, T cells encounter their cognate antigen on perivascular antigen-presenting cells their local reactivation will initiate subsequent mechanisms leading to the focal activation of gelatinases, which will enable the T cells to cross the glial barrier and enter the CNS parenchyma. Thus, assessing both, BBB permeability and MMP activity in spatial correlation to immune cell accumulation in the CNS during EAE allows to specify loss of integrity of the endothelial and glial barriers of the NVU. 
We here show how to induce EAE in C57BL/6 mice by active immunization and how to subsequently analyze BBB permeability in vivo using a combination of exogenous fluorescent tracers. We further show, how to visualize and localize gelatinase activity in EAE brains by in situ zymogaphy coupled to immunofluorescent stainings of BBB basement membranes and CD45+ invading immune cells.

Here, we present protocols to investigate impairment of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. We specifically address how to determine blood-brain barrier permeability and gelatinase activity involved in leukocyte migration across the glia limitans.&#160;

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

Vivo에서 스펙트럼-도메인 광학 일관성 단층 촬영 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy와 Cx3cr1gfp/gfp 기자 쥐의 이미징

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

EAE 질병 중증도를 평가하기 위한 척수의 조직학적 염색

Scoring Central Nervous System Inflammation, Demyelination, and Axon Injury in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a common immune-based model of multiple sclerosis (MS). This disease can be induced in rodents by active immunization with protein components of the myelin sheath and Complete Freund&#39;s adjuvant (CFA) or by the transfer of myelin-specific T effector cells from rodents primed with myelin protein/CFA into na&#239;ve rodents. The severity of EAE is typically scored on a 5-point clinical scale that measures the degree of ascending paralysis, but this scale is not optimal for assessing the extent of recovery from EAE. For example, clinical scores remain high in some EAE models (e.g., myelin oligodendrocyte glycoprotein [MOG] peptide-induced model of EAE) despite the resolution of inflammation. Thus, it is important to complement clinical scoring with histological scoring of EAE, which also provides a means to study the underlying mechanisms of cellular injury in the central nervous system (CNS).
Here, a simple protocol is presented to prepare and stain spinal cord and brain sections from mice and to score inflammation, demyelination, and axonal injury in the spinal cord. The method for scoring leukocyte infiltration in the spinal cord can also be applied to score brain inflammation in EAE. A protocol for measuring soluble neurofilament light (sNF-L) in the serum of mice using a Small Molecule Assay (SIMOA) assay is also described, which provides&#160;feedback on the extent of overall CNS injury in live mice.

저자 스포트라이트: Unveiling the Pathway Linking Obesity to Autoimmune Inflammation in Multiple Sclerosis (다발성 경화증에서 비만과 자가면역 염증을 연결하는 경로 발표) 

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) serves as an animal model of multiple sclerosis. This article describes an approach for scoring spinal cord inflammation, demyelination, and axonal injury in EAE. Additionally, a method to quantify soluble neurofilament light levels in the mice serum is presented, facilitating the assessment of axonal injury in live mice.

실험적 자가면역 뇌척수염에서 중추신경계 염증, 탈수초화 및 축삭 손상 채점

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a common immune-based model of multiple sclerosis (MS). This disease can be induced in rodents by ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in a Transgenic Mouse

<a href='https://app.jove.com/v/55503/bioluminescence-imaging-neuroinflammation-transgenic-mice-after'>Source: Breid, S., et. al. Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils. J. Vis. Exp. (2017)</a>This video demonstrates the bioluminescence imaging of neuroinflammation in transgenic mice, showcasing luciferase-luciferin reactions in activated astrocytes. The protocol enables non-invasive quantification of astrocytic activation, aiding studies on CNS inflammation and therapeutic efficacy.

Source: Breid, S., et. al. Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils. J. ...

마우스의 다발성 경화증의 EAE 모델에서 시신경염 및 뇌 염증의 생물 발광 및 근적외선 영상

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실험자가 면역 뇌척수염 성인 마우스에 유리 척수 Windows를 이식

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

알파 - 시누 클레인 브릴의 주변 접종 후 형질 전환 마우스의 신경 염증의 생물 발광 영상

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

Vivo에서 스펙트럼-도메인 광학 일관성 단층 촬영 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy와 Cx3cr1^gfp/gfp 기자 쥐의 이미징

실험적 자가면역 뇌척수염에서 중추신경계 염증, 탈수초화 및 축삭 손상 채점

실험적 자가면역 뇌척수염에서 중추신경계 염증, 탈수초화 및 축삭 손상 채점

실험적 자가면역 뇌척수염에서 중추신경계 염증, 탈수초화 및 축삭 손상 채점

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in a Transgenic Mouse