Name: isolation of circulating tumor cells in an orthotopic mouse model of colorectal cancer
Uploaded: 2017-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer at JoVE.com

この研究は、ドイツの研究財団（WE 3548 / 4-1）とローランド・エルンスト・シュタップゥン・ファール・ジェシードハイツェン（Roland-Ernst-StiftungfürGesundheitswesen）（1/14）によって支持された。

ここに提示された動物実験は、機関および政府の動物保護および使用委員会によって独立して審査され、許可され、 実験動物連合連盟 （FELASA）のガイドラインに従って実施された。すべての可能な措置は、麻酔および鎮痛、または必要な場合には早期安楽死を含む苦痛を最小限にするためにとられた。 1.細胞およびオルガノイドの調製注：1回の注入につき100,000細胞で20μLの容量を使用してください。漏出を防止し、標準化された注射を確実にするために、基底膜マトリックス（BMM）を使用する。再現可能な結果を確保するために、一定の間隔で（STRプロファイリングを介して 、 例えば ）細胞株認証アッセイを行います。 <ol><li> 新鮮な組織からの一次細胞懸濁液の調製 注：常に無菌条件下で作業してください。新鮮なものの即時転送手術室から氷上で実験室に切除された組織は、細胞の高い生存性を確実にするために必要とされる。 患者の健康と最適な治療が常に最優先事項でなければなりません。したがって、研究のための組織試料は、切除された腫瘍のその後の病理学的検査および病期診断を妨害しない方法で得なければならない。従って、ほとんどの場合、病理学的診断との非干渉を確実にするために、訓練された病理学者によって得られた研究のためのサンプルを有することは合理的である。 <ol><li>切除標本（理想的には1cm 3 ）から滅菌除去した直後に、20〜30mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を予め充填した50mLチューブに組織サンプルを入れる。チューブを氷上に保管し、すぐに検査室に移す。 </li><li>ペトリ皿に組織を入れ、十分なPBSで2回洗浄して残りの血液を除去する。 </li><li>組織をscaで小片（〜2〜4 mm）に切断するlpel（ 例えば 、＃20または＃36ブレード）。 </li><li>腫瘍組織を単細胞懸濁液にさらに解離させるために、解離剤を製造者の指示に従って使用する。あるいは、酵素消化の他のプロトコールを使用する。 </li><li>得られた単一細胞懸濁液の細胞を計数する（ 例えば 、コールターカウンターまたは血球計で）。 </li><li>遠心分離（1,500 xgで5分間）し、細胞懸濁液をPBSで2回洗浄する。 </li><li> BMMに5×10 6細胞/ mLの濃度で細胞を再懸濁し、氷上に保ちます。 </li></ol></li><li> 注射用細胞株の調製 <ol><li>標準的な培養条件（37℃、5％CO 2 ）下ですべての結腸直腸癌細胞株を増殖させ、手術の日に調製する。 </li><li>標準的な細胞培養プロトコールに従って細胞を採取し、細胞を計数し（ 例えば 、コールターカウンターまたは血球計算盤で）、reqを計算する注射される動物の数に依存して、すべての注射のための尿量。 </li><li>実際に必要とされる量の3-5倍を準備して、ピペッティングロスと注入シリンジのデッドボリュームを考慮してください。 </li><li>遠心分離（1,500gで5分間）し、細胞懸濁液をPBSで2回洗浄する。 </li><li> BMMに5×10 6細胞/ mLの濃度で細胞を再懸濁し、氷上に保ちます。 </li></ol></li><li> オルガノイドの調製 注：すべての3Dオルガノイド培養物は、標準的な培養条件（37℃、5％CO 2 ）下で増殖させる。オルガノイド培養の詳細なプロトコールはこれまでに公開されている。従来の細胞株と同様に18、19、20、我々 は注射当たり100,000細胞で20μLBMMのボリュームをお勧めします。オルガノイドは、手術の日に次のように調製される： <ol><li>以下の培地を調製する（以下、（DMEM）/ F12 + 1％HEPES（1M）+ 1％グルタミン（200mM）+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）を含むDMEM / F12 + </li><li> 15 mLチューブに1 mLのDMEM / F12 +++をあらかじめ充填する。 </li><li>注意深くオルガノイドを培養プレートの表面から吸引し、3〜5ウェルの内容物を1つの15mLチューブに移す。 </li><li>細長いガラスピペットで上下にピペッティングすることにより、有機体を慎重に小さな断片に砕きます。 </li><li>管に5mLのDMEM / F12 +++を添加し、続いて1000xgで5分間遠心分離する。 </li><li>遠心分離後、上清を除去し、ペレットを600μL酵素解離緩衝液に再懸濁し、懸濁液を6ウェルプレートの1つのウェルに移す。 </li><li> 37℃で1〜5分間インキュベートし、オルガノイドを溶解するために懸濁液を上下に慎重にピペッティングする。 注：消化は顕微鏡で確認してください。すべての細胞クラスターが解離したときに完了する単一細胞へのd。 </li><li>うまく消化し​​たら、消化を停止するために1.4mLのDMEM / F12 +++を加える。その後、消化されたオルガノイドのすべてのウェルを50mLチューブに移す。 </li><li>細胞を数え、すべての注射に必要な量を計算する。 </li><li>分注ロスと注入シリンジのデッドボリュームを考慮に入れて実際に必要とされる量の3〜5倍を準備する</li><li>遠心分離（1,500 xgで5分間）し、細胞懸濁液をPBSで2回洗浄する。 </li><li> BMM中の細胞を5×10 6細胞/ mLの濃度に再懸濁し、それらを氷上に保つ。 </li></ol></li></ol> 2.正射マウスモデル<ol><li> 手術のためのレシピエント動物の調製 注：6-8週齢のNOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wj1 / SzJ（NOD scidガンマ、NSG）マウスをレシピエントとして使用する。 21 NSGは、最も免疫不全のマウスのうち、成熟したB、TおよびNK細胞を欠いており、他の複数の免疫性のdeフェクト。 21彼らは確実に低い細胞数が注入されている場合でも、腫瘍を成長させ、遠隔転移に非常になりやすいです。 NSGマウスは優れた育種家であり、従来の特定病原体不使用（SPF）単位で維持することができます。 <ol><li>最初の切開の前に、0.05mg / kgのブプレノルフィンを皮下注射する。 </li><li>全身麻酔の場合、セボフルランを3-3.5容量％で使用する。つま先ピンチ反射の喪失は、十分な麻酔を示す。 </li><li>角膜の乾燥を避けるために、眼科用軟膏で麻酔したマウスの眼を覆う。 </li><li>小さなテーブルの上で仰向けにマウスを拘束します。 </li><li>腹部を電気シェーバー（脱毛クリームを代わりに使用することができる）で剃り、少なくとも3回クロルヘキシジン/ヨウ素と70％アルコールで消毒する。 </li><li>手術野を滅菌ドレープで覆う。 注：周術期抗生物質の使用はオプションであり、制度上のガイドラインの対象となります。 </li></ol></li><li> 中線開腹術および盲腸曝露 <ol><li>はさみ（メスを交互に使用することができます）を使用して、下腹部の皮膚の小さな正中線切開（3〜5 mm）を行います。鉗子で腹部の筋肉組織を拾い、慎重にはさみで切開して、腹腔を開きます。 </li><li>盲腸を特定し、慎重に外傷性鉗子で外形化する。盲腸のブラインドエンドパウチを腹部に配置し、頭蓋骨を指します。 </li><li>体外に出すと、常に温かい生理食塩水綿棒を使って盲腸を湿らせてください。 </li></ol></li><li> 眼内注射、腹部閉鎖および術後回復 <ol><li>内腔内注射のためには、30Gカニューレを備えた標準的な1mL注射器を使用する。このシリンジをマイクロインジェクションポンプに取り付け、マイクロインジェクションポンプをマイクロマニピュレーターに取り付けます。 </li><li>慎重に非鉗子鉗子で盲腸の先端をつかみ、それを穏やかに滑らかにする温かい生理食塩水で湿らせた鉗子の第2のセットでd。 </li><li>カニューレを盲腸の真上に配置する。 </li><li>双眼の外科用顕微鏡で視覚制御下で次の手順を実行します。 </li><li>盲腸の外郭部分の両端にある2つの非外傷性鉗子で盲腸を慎重に把握し、わずかに引き伸ばし、ゆっくりとそれを平行にかつ真上に位置するカニューレ上にゆっくりと引き寄せる。漏出および腹膜播種につながる可能性があるので、腸壁全体を穿孔しない（したがって、細胞を管腔に注入する）ことは重要であり、穿孔の初期点を超えて漿膜を穿孔しないことも重要である。 <ol><li>腸をカニューレの方に移動し、カニューレを腸の方へ移動させないでください。ホックと2つの鉗子の間に腸を伸ばします。外科医の手は、振戦を軽減するために表面上に静止していなければならない。 </li></ol></li><li>漿膜の間に細胞を注入する（上の非常に薄い、半透明の裏地eの壁内の血管）および筋肉痛。したがって、カニューレは、血管の上および薄い半透明膜の下に視覚的に配置されなければならない。 </li><li>カニューレが腸壁の内側にある間に振戦を軽減するために、注射を開始するためにフットスイッチを使用してください。 </li><li>カニューレが所定の位置に来たら、注射を開始する。 20秒間を使用すると、ポンプのコントロールユニットに1μL/ sが設定されます。 注：損傷した血管の中または近くへの注射は、直接的な血管内伝播および遠隔転移を招き、したがって避けるべきである。 </li><li>注射が完了した後、カニューレを慎重に後方に引っ張って外す。 </li><li>乾燥した綿棒を盲腸の下に置き、漏出した細胞を溶解して人工腹膜の播種を防ぐために盲腸を蒸留水で十分にすすいでください。 </li></ol></li><li> 腹部の閉鎖および術後の回復 <ol><li> rの後盲腸を静かに腹腔に戻してください。 </li><li>急速吸収性の6 - 0の縫合糸で腹壁を閉鎖する。 </li><li>外科用創傷クリップで皮膚を閉じます。 </li><li>麻酔から完全に回復するまで38℃に設定されたヒーティングマップ上にマウスを置きます。 </li><li> 48時間後のマウスの術後状態を密接に観察する。苦痛の場合は、ブプレノルフィン0.05 mg / kgを12時間毎に投与する。 </li><li>腫瘍の成長による苦痛の徴候について少なくとも1日1回、マウスをモニターする。 </li></ol></li></ol>全血試料からの循環腫瘍細胞の単離注：麻酔したマウスの経皮的心臓穿刺により血液を採取し、その後安楽死させる。理想的には、100μLの抗凝固剤（エチレンジアミン四酢酸（EDTA）またはヘパリン）をあらかじめ充填したシリンジに、1,000μLの血液を採取します。抗ヒトEpCAM（上皮細胞接着分子）抗体を用いてCTCを同定した。ヒト上皮細胞株がマウスモデルで使用される場合、これは非常にうまく機能します。他の器具については、異なる抗体が必要とされ得る。 <ol><li> CTC濃縮： <ol><li> 15mLのチューブに5mLの密度勾配培地をあらかじめ充填し、注意深く血液を15mLのチューブに移す。 </li><li>遠心分離（ブレーキなしで300xgで30分間）し、慎重に上清を除去する。 </li><li>残りを新しい15 mLチューブに入れ、遠心分離機にかけます（15分間、ブレーキで300 xg）。 </li><li>単核細胞を含む中間相を回収し（残りを捨てる）、細胞をPBSで2回洗浄する。 </li><li>ペレットを200μLPBS / 1％EDTAに再懸濁し、4μLのEpCAM抗体を加える。暗所で氷上で20分間インキュベートする。 </li></ol></li><li> スクリーニングとピッキング <ol><li>以下の緩衝液（以下、ピッキング緩衝液と称する）を調製する：PBS + 10％ウシ胎児血清（FCS）+ 1％ペニシリン/ Sトレプトマイシン（1％）+ 0.8％EDTA。 </li><li> PAPペンを使用して、6cmの滅菌ペトリ皿（液体が皿に分散するのを防ぐ）に約1cmの円を描き、この円の中にピペットバッファー700μLをピペットで入れる。 </li><li>円内の700μLのピッキングバッファーに50μLの細胞懸濁液を添加する。顕微鏡で細胞の密度をチェックする。濃すぎる場合は、サンプルを別の料理に分割します。 </li><li>細胞が沈降するのを待ちます（約5分）。 </li><li>染色された（= EpCAM陽性）細胞の細胞懸濁液の滴をスクリーニングする。 </li><li>セルが発見されると、マイクロマニピュレータを用いて細胞を選択し、意図下流分析（ 例えば 、RNA抽出緩衝液または培養培地）に応じて、50μLのバッファに入れ。 </li><li>目的とする下流分析に応じて、陰性対照としてEpCAM陰性細胞および/または培地を単離する。 </li><li>下流の分析（ 例えば 、細胞培養、PCR）を続ける。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2016.">Cancer statistics, 2016.</a> CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).</li><li>Weitz, J., Koch, M., Debus, J., H&#246;hler, T., Galle, P. R., B&#252;chler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer.">Colorectal cancer.</a> Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).</li><li>Sch&#246;lch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+of+colorectal+cancer.">Circulating tumor cells of colorectal cancer.</a> Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).</li><li>Steinert, G., Sch&#246;lch, S., Koch, M., Weitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+significance+of+circulating+and+disseminated+tumour+cells+in+colorectal+cancer.">Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer.</a> Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).</li><li>Bork, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+relevance+of+minimal+residual+disease+in+colorectal+cancer.">Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer.</a> World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).</li><li>Bork, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+and+outcome+in+non-metastatic+colorectal+cancer:+a+prospective+study.">Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study.</a> Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).</li><li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+differences+of+circulating+tumor+cells+in+colorectal+cancer.">Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer.</a> Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).</li><li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+Spread+Emerging+From+Liver+Metastases+of+Colorectal+Cancer:+Does+the+Seed+Leave+the+Soil+Again?.">Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again?.</a> Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).</li><li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+shows+that+detection+of+circulating+tumor+cells+indicates+poor+prognosis+in+patients+with+colorectal+cancer.">Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).</li><li>Steinert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Escape+and+Survival+Mechanisms+in+Circulating+Tumor+Cells+of+Colorectal+Cancer.">Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer.</a> Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).</li><li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mighty+mouse:+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development.">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li><li>Roper, J., Hung, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priceless+GEMMs:+genetically+engineered+mouse+models+for+colorectal+cancer+drug+development.">Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development.</a> Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).</li><li>Sch&#246;lch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+combined+with+TLR7/8+activation+induces+strong+immune+responses+against+gastrointestinal+tumors.">Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors.</a> Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).</li><li>Sch&#246;lch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+activation+and+ionizing+radiation+induce+strong+immune+responses+against+multiple+tumor+entities.">TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities.</a> Oncoimmunology. 4 (11), e1042201 (2015).</li><li>Sch&#246;lch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+exhibit+stem+cell+characteristics+in+an+orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer.">Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).</li><li>Nanduri, L. K., Garc&#237;a, S., Weitz, J., Sch&#246;lch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Colorectal+Cancer-Derived+Circulating+Tumor+Cells.">Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells.</a> Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).</li><li>van Noort, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Drug+Candidates+for+the+Treatment+of+Metastatic+Colorectal+Cancer+through+Global+Inverse+Gene-Expression+Profiling.">Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling.</a> Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD/SCID/gamma(c)(null)+mouse:+an+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells.">NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li><li>Simon, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+phenotypic+and+genomic+analysis+of+C57BL/6J+and+C57BL/6N+mouse+strains.">A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains.</a> Genome Biol. 14 (7), R82 (2013).</li><li>Kalish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C57BL/6N+Mice+Are+More+Resistant+to+Ehrlich+Ascites+Tumors+Than+C57BL/6J+Mice:+The+Role+of+Macrophage+Nitric+Oxide.">C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide.</a> Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).</li><li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer.">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> J Vis Exp. (10), e484 (2007).</li><li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+PI3K/MEK+inhibition+promotes+tumor+apoptosis+and+regression+in+PIK3CA+wild-type,+KRAS+mutant+colorectal+cancer.">Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer.</a> Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).</li><li>Coffee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+BRAF+and+PI3K/mTOR+blockade+is+required+for+effective+treatment+of+BRAF(V600E)+colorectal+cancer.">Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer.</a> Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).</li><li>Belmont, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+dual+blockade+of+the+kinases+PI3K+and+mTOR+in+KRAS-mutant+colorectal+cancer+models+results+in+combined+sensitivity+to+inhibition+of+the+receptor+tyrosine+kinase+EGFR.">Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR.</a> Sci Signal. 7 (351), ra107 (2014).</li><li>Hung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+mouse+model+for+sporadic+and+metastatic+colon+tumors+and+its+use+in+assessing+drug+treatment.">Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).</li><li>Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Inducible,+Large-Intestine-Specific+Transgenic+Mouse+Model+for+Colitis+and+Colitis-Induced+Colon+Cancer+Research.">An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research.</a> Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).</li><li>Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+transgenic+mouse+for+colorectal+cancer+research+with+intestinal+cre+expression+limited+to+the+large+intestine.">Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine.</a> Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).</li><li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+inducible+colon-specific+Cre+enzyme+mouse+line+for+colon+cancer+research.">Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

皮下マウスモデルでのその前臨床的に証明された活性にもかかわらず、新規化合物の大部分は臨床試験に失敗し、決して診療所に到達しない。 11皮下マウスモデルのこの明らかな不足を正確に腫瘍の生物学および増殖パターンは、直接元の臓器への腫瘍細胞の注射に基づく同所性マウスモデルの開発につながっているシミュレートします。 オルソトー?...

結腸直腸癌（CRC）は、西欧諸国における癌の死の最も一般的な原因の1つである。 1原発腫瘍はしばしば切除することができるが、遠隔転移の発生は劇的に予後を悪化させ、しばしば死に至る。腫瘍から切り離し2、3転移の生物学的相関循環している腫瘍細胞（CTCのは）、、、標的臓器に上皮に取り付け、循環の中で生き残る臓器に侵入し、最終的に新たな病変への脱却します。 4のCTCが予後関連性、5、6、7、8であることが知られているが、それらの生物学9は、部分的にのみCRCにおけるそれらの極端な希少性の結果として理解されます。 10 マウスモデルは強力なtです癌生物学のさまざまな側面を研究する古典的な皮下腫瘍モデルは、免疫担当者（同系マウス腫瘍細胞が使用される場合）または免疫不全のいずれかであり得るレシピエントマウスへの腫瘍細胞の皮下注射によって産生される。皮下腫瘍モデルは安価であり、データを迅速に生成する。それらのエンドポイント腫瘍増殖は容易かつ非侵襲的に測定することができる。しかしながら、そのようなモデルにおいて抗腫瘍活性を示した新規化合物の88％が臨床試験に失敗している。 11これは人間とマウスの種間の違いに一部原因があります。しかし、この失敗の大部分は皮下マウスモデルの予測値が低いためです。 したがって、腫瘍細胞が起源の器官に注入され、したがって元の微小環境で増殖する正所性のマウスモデルは、がん研究においてますます使用されている。 図11 、図 12 、 </sアップ&gt; 13、14の同所モデルは、局所的な腫瘍の成長条件をシミュレートしないだけでなく、腫瘍増殖の解剖学的に正しいサイトの結果として、同所マウスモデルはまた、転移の現実的なシミュレーションを可能にし、したがって、CTCの生物学8、15、16またはCRCの異なる治療への応答を研究するために使用されています。 13、17 同所性マウスモデルの主な欠点は、その技術的な複雑さです。細胞が注入される臓器に応じて、実験者が再現性のある腫瘍を誘導するまでの学習曲線はかなり長い。これは、腫瘍細胞を腸壁に注入する必要があるため、結腸直腸癌モデルに特に適用され、穿孔、腫瘍細胞漏出、または腔内腫瘍細胞の損失をもたらすことが多い。これは、原型組織サンプル、2D細胞株および3Dオルガノイド培養からの細胞調製方法およびマウスの盲腸へのそれらの注入を記載することを意図している。ここに記載されている技術は、高度に均一な腫瘍をもたらし、そして注射に使用される細胞系の腫瘍生物学に応じて、レシピエントマウスにおける遠隔転移およびCTCの再現性のある形成をもたらす。 15

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cell culture Media and Components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634010</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15630056</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>Glutamax-I Supplement (200 mM)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>35050038</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>61965026</td><td>basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)</td></tr><tr><td>TrypLE Express enzymatic dissociation buffer</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free)</td><td>CORNING B.V. Life Sciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>6-/48-well plates with lid</td><td>CORNING</td><td>3516/3548</td><td></td></tr><tr><td>cell culture flask 75 cm&amp;sup2;, 250 mL</td><td>VWR International GmbH</td><td>734-2066</td><td></td></tr><tr><td>cell culture flask 150 cm&amp;sup2;, 600 mL</td><td>Corning B.V. Life Sciences</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL</td><td>Sarstedt AG &amp;amp; Co.</td><td>72.706.400/ 72.695.400</td><td></td></tr><tr><td>15 mL, 50 mL centrifuge tubes</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>188271/227270</td><td></td></tr><tr><td>TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine)</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes (glass, 150 mm)</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>11546963/ FB50251</td><td>thinly pulled by using a bunsen burner</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>for primary tumor tissue preparation</td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>for primary tumor tissue preparation</td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>for primary tumor tissue preparation</td></tr><tr><td>Human Tumor Dissociation Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>for primary tumor tissue preparation</td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Corning B.V. Life Sciences</td><td>352350</td><td>for primary tumor tissue preparation</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgical Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>AbbVie Germany GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Medical oxygen</td><td>Air Liquide Medical GmbH</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Temgesic</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen - opthalmic ointment</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>10047757</td><td></td></tr><tr><td>Normal saline 0.9% (E154)</td><td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>10013</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>Braun</td><td>235144</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO</td><td>Braun/neoLab</td><td>194291661</td><td></td></tr><tr><td>30G injection needle</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>cellulose swabs</td><td>Lohmann &amp;amp; Rauscher Deutschland</td><td>13356</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Forceps</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissor - ToughCut</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Needle Holder</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip Kit</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture)</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson Medical GmbH</td><td>Z1012H</td><td></td></tr><tr><td>Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PS/PK</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicro Pump with Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-4</td><td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td></tr><tr><td>Footswitch for SYS-Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>15867</td><td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td></tr><tr><td>Three-axis Manual Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M325</td><td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td></tr><tr><td>Magnetic Stand for Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M10</td><td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td></tr><tr><td>Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand</td><td>World Precision Instruments</td><td>5479</td><td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td></tr><tr><td>Hot Plate 062</td><td>Labotect</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>Isis - Hair shaver</td><td>AESCULAP - Braun</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Binocular Surgical Microscope</td><td>Parkland Scientific</td><td>VS-2Z</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;CTC isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td></td></tr><tr><td>Density gradient medium &amp;ndash; Ficoll</td><td>StemCell - Lymphoprep</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324210</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8</td><td>BioLegend</td><td>118210</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish, &amp;oslash; 60 x 15 mm, 21 cm&amp;sup2;, Vent</td><td>Greiner bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Cell Culture Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferman 4r Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTram Air</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>aspiration pump connected to the micromanipulator</td></tr><tr><td>Dmz Universal Microelectrode Puller</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td>required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration</td></tr><tr><td>Prism Glass Capillaries</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td>picking buffer</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>picking buffer</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>picking buffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td>picking buffer</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunohistochemistry&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324201</td><td>EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)</td></tr><tr><td>HRP rabbit anti-mouse IgG</td><td>Abcam</td><td>ab97046</td><td>EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)</td></tr></tbody></table>

isolation of circulating tumor cells in an orthotopic mouse model of colorectal cancer

容易な適用性および費用対効果の利点にもかかわらず、皮下マウスモデルには重大な制限があり、腫瘍生物学および腫瘍細胞の播種を正確にシミュレートしない。これらの限界を克服するために、正三角形のマウスモデルが導入されている。しかしながら、そのようなモデルは、特に大腸のような中空器官において、技術的に要求されている。確実に増殖し転移する均一な腫瘍を作製するためには、腫瘍細胞の調製および注射の標準化技術が不可欠である。 我々は、非常に均一な腫瘍を発達させ、腫瘍の生物学的研究および治療的試験に使用できる結腸直腸癌（CR）の同所性マウスモデルを開発した。原発腫瘍、二次元（2D）細胞系または三次元（3D）オルガノイドのいずれかからの腫瘍細胞が盲腸内に注入され、注入された腫瘍細胞の転移能に応じて、高度に転移性の腫瘍を形成する。加えて、CTCsは定期的に見つけることができます。ここでは、2D細胞株および3Dオルガノイドならびに原発腫瘍組織、腫瘍移植マウスからの外科および注入技術ならびにCTCの単離ならびにトラブルシューティングのためのヒントを提供する。

このモデルにおける結腸直腸腫瘍の成功し、再現性のある世代は、漏出または漏出のない細胞の正確な注入に決定的に依存する。これが達成されれば、このモデルは非常に信頼性が高く、人工腹膜播種の結果は非常にまれです。腫瘍の成長動力学ならびにそれらの拡散様式は、使用されるオルガノイドおよび細胞の生物学に依存する。 15 HCT116細胞は...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer at JoVE.com

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

本発明者らは、腫瘍細胞またはオルガノイドをマウスの盲腸に注入することによる同所性結腸直腸腫瘍の確立およびこのモデルからの循環腫瘍細胞（CTC）のその後の単離について記載する。

結腸直腸癌モデルマウスにおける循環腫瘍細胞の単離

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

isolation-circulating-tumor-cells-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.9K ビュー.  Technische Universität Dresden. 本発明者らは、腫瘍細胞またはオルガノイドをマウスの盲腸に注入することによる同所性結腸直腸腫瘍の確立およびこのモデルからの循環腫瘍細胞（CTC）のその後の単離について記載する。 

ビデオ: Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

肺組織に腫瘍のセルの視覚化を循環させるため肺植民地化アッセイの確立

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

がん研究

Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature cancer cells growing in their natural location, replicate human disease with high fidelity. Two techniques can be used to establish this model. Both techniques are similar and require mouse anesthesia and laparotomy for exposure of the cecum. One technique involves injection of a colorectal cancer cell suspension into the cecal wall. Cancer cells are first grown in culture, harvested when subconfluent and prepared as a single cell suspension. A small volume of cells is injected slowly to avoid leakage. The other technique involves transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. A mouse with a previously established subcutaneous colorectal tumor is euthanized and the tumor is removed using sterile technique. The tumor piece is divided into small pieces for transplantation to another mouse. Prior to transplantation, the cecal wall is lightly damaged to facilitate tumor cell infiltration. The time to developing primary tumors and liver metastases will vary depending on the technique, cell line, and mouse species used. This orthotopic mouse model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Two techniques can be used to establish this model: injection of a cancer cell suspension into the cecal wall or transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. This model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

大腸癌の同所性マウスモデル

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature ...

生物学

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an urgent need to understand the mechanisms behind metastasis development, and thus to propose efficient treatments for advanced cancer. Metastatic cancers are hard to treat, as biopsies are invasive and inaccessible. Recently, there has been considerable interest in liquid biopsies including both cell-free circulating deoxyribonucleic acid (DNA) and circulating tumor cells from peripheral blood and we have established several circulating tumor cell lines from metastatic colorectal cancer patients to participate in their characterization. Indeed, to functionally characterize these rare and poorly described cells, the crucial step is to expand them. Once established, circulating tumor cell (CTC) lines can then be cultured in suspension or adherent conditions. At the molecular level, CTC lines can be further used to assess the expression of specific markers of interest (such as differentiation, epithelial or cancer stem cells) by immunofluorescence or cytometry analysis. In addition, CTC lines can be used to assess drug sensitivity to gold-standard chemotherapies as well as to targeted therapies. The ability of CTC lines to initiate tumors can also be tested by subcutaneous injection of CTCs in immunodeficient mice.
Finally, it is possible to test the role of specific genes of interest that might be involved in cancer dissemination by editing CTC genes, by short hairpin ribonucleic acid (shRNA) or Crispr/Cas9. Modified CTCs can thus be injected into immunodeficient mouse spleens, to experimentally mimic part of the metastatic development process in vivo.
In conclusion, CTC lines are a precious tool for future research and for personalized medicine, where they will allow prediction of treatment efficiency using the very cells that are originally responsible for metastasis.

Culturing CTCs allows a deeper functional characterization of cancer, through assaying specific marker expression, and assessing drug resistance and the ability to colonize the liver among other possibilities. Overall, CTC culture could be a promising clinical tool for personalized medicine to improve patient outcome.

循環腫瘍細胞株:基礎的・翻訳的研究のための革新的なツール

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...

An Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer using Human Stroma to Promote Metastasis

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant transgenic mouse models of ovarian cancer exist, these mice are expensive and take a long time to develop tumors. Intraperitoneal injection xenograft models lack human stroma and do not accurately model ovarian cancer metastasis. Even patient derived xenografts (PDX) do not fully recapitulate the human stromal microenvironment as serial PDX passages demonstrate significant loss of human stroma. The ability to easily model human ovarian cancer within a physiologically relevant stromal microenvironment is an unmet need. Here, the protocol presents an orthotopic ovarian cancer mouse model using human ovarian cancer cells combined with patient-derived carcinoma-associated mesenchymal stem cells (CA-MSCs). CA-MSCs are stromal progenitor cells, which drive the formation of the stromal microenvironment and support ovarian cancer growth and metastasis. This model develops early and diffuses metastasis mimicking clinical presentation. In this model, luciferase expressing ovarian cancer cells are mixed in a 1:1 ratio with CA-MSCs and injected into the ovarian bursa of NSG mice. Tumor growth and metastasis are followed serially over time using bioluminescence imaging. The resulting tumors grow aggressively and form abdominal metastases by 14 days post injection. Mice experienced significant decreases in body weight as a marker of systemic illness and increased disease burden. By day 30 post injection, mice met endpoint criteria of &gt;10% body weight loss and necropsy confirmed intra-abdominal metastasis in 100% of mice and 60%-80% lung and parenchymal liver metastasis. Collectively, orthotopic engraftment of ovarian cancer cells and stroma cells generates tumors that closely mimic the early and diffuse metastatic behavior of human ovarian cancer. Furthermore, this model provides a tool to study the role of ovarian cancer cell: stroma cell interactions in metastatic progression.

Orthotopic engraftment of ovarian cancer cells mixed with human stromal cells provides a mouse model that exhibits rapid, diffuse metastatic behavior that is characteristic of human ovarian cancer. This model also allows for the study of tumor cell and stromal cell interactions, as well as their role in tumor progression and metastasis.

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the tumor microenvironment, play a crucial role in metastatic CRC progression and predict poor patient prognosis. However, there is a lack of satisfactory mouse models to study the crosstalk between metastatic cancer cells and CAFs. Here, we present a method to investigate how liver metastasis progression is regulated by the metastatic niche and possibly could be restrained by stroma-directed therapy. Portal vein injection of CRC organoids generated a desmoplastic reaction, which faithfully recapitulated the fibroblast-rich histology of human CRC liver metastases. This model was tissue-specific with a higher tumor burden in the liver when compared to an intra-splenic injection model, simplifying mouse survival analyses. By injecting luciferase-expressing tumor organoids, tumor growth kinetics could be monitored by in vivo imaging. Moreover, this preclinical model provides a useful platform to assess the efficacy of therapeutics targeting the tumor mesenchyme. We describe methods to examine whether adeno-associated virus-mediated delivery of a tumor-inhibiting stromal gene to hepatocytes could remodel the tumor microenvironment and improve mouse survival. This approach enables the development and assessment of novel therapeutic strategies to inhibit hepatic metastasis of CRC.

Portal vein injection of colorectal cancer (CRC) organoids generates stroma-rich liver metastasis. This mouse model of CRC hepatic metastasis represents a useful tool to study tumor-stroma interactions and develop novel stroma-directed therapeutics such as adeno-associated virus-mediated gene therapies.

肝転移間質を研究するための結腸直腸癌オルガノイドの門脈注入

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D tumoroids. Since patient derived tumor organoids can retain the characteristics of the original tumor, these reliable preclinical models enable cancer drug screening and the study of drug resistance mechanisms. However, CRC related death in patients is mostly associated with the presence of metastatic disease. It is therefore essential to evaluate the efficacy of anti-cancer therapies in relevant in vivo models that truly recapitulate the key molecular features of human cancer metastasis. We have established an orthotopic model based on the injection of CRC patient-derived cancer cells directly into the cecum wall of mice. These tumor cells develop primary tumors in the cecum that metastasize to the liver and lungs, which is frequently observed in patients with advanced CRC. This CRC mouse model can be used to evaluate drug responses monitored by microcomputed tomography (&#181;CT), a clinically relevant small-scale imaging method that can easily identify primary tumors or metastases in patients. Here, we describe the surgical procedure and the required methodology to implant patient-derived cancer cells in the cecum wall of immunodeficient mice.

This protocol describes the orthotopic implantation of patient-derived cancer cells in the cecum wall of immunodeficient mice. The model recapitulates advanced colorectal cancer metastatic disease and allows for the evaluation of new therapeutic drugs in a clinically relevant scenario of lung and liver metastases.

進行性大腸癌を再現するマウスへの患者由来癌細胞の同所性移植

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

マウス癌モデルからの循環腫瘍細胞の単離と伝播

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

医学

Intracecal Tumor Cell Injection: A Technique to Deliver Cancer Cells for Establishing Orthotopic Colorectal Cancer Mouse Model

Source: Kochall, S., et al. <a href="https://www.jove.com/v/55357"> Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer </a> J. Vis. Exp. (2017)
The video describes the technique for intracecal injection of cancerous cells to develop an orthotopic mouse model with highly uniform tumors. Therefore, the orthotopic mouse model allows realistic simulation of metastasis, providing a valuable tool to study the phenotype changes during tumor growth and dissemination.

Intracecal腫瘍細胞注射:同所性結腸直腸癌マウスモデルを確立するための癌細胞送達技術

Source: Kochall, S., et al.  Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer  J. Vis. Exp. (2017)
The video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

大腸がん

動物モデル研究

Establishing Experimental Metastases Mouse Model: Implanting GFP Expressing CRC Organoid Cells in PDX Model to Detect Micrometastases

Source: Okazawa, Y. et al.&#160; <a href="https://www.jove.com/v/57374"> High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video describes the protocol for generating metastases by the PDX derived CRC organoids labeled with GFP lentivirus into the spleen of an immunodeficient mouse. Cancer micrometastases colonizing other organs can be detected using a fluorescence microscope to assess the GFP expression.

実験的転移マウスモデルの確立:GFP発現CRCオルガノイド細胞をPDXモデルに移植して微小転移を検出する

Source: Okazawa, Y. et al.&#160;  High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a ...

Spontaneous Metastasis Mouse Models: A Platform to Study the Metastatic Potential of Orthotopically Injected Colorectal Cancer Cells

Source: Okazawa, Y., et al. <a href="https://www.jove.com/v/57374"> High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes the protocol to establish a spontaneous metastasis mouse model of colorectal cancer patient-derived xenografts or PDXs. These xenograft models partially mimic the features of human carcinomas and understand the critical aspects of human malignancies, including invasion and metastasis.&#160;