転移は癌関連死の主な原因である。この現象は、がん細胞が原発腫瘍から脱離したときに起こり、最終的に遠くの標的器官に到達するために血液循環に入る。これらの剥離細胞が血液中に入ると、我々はそれらを二次腫瘍細胞と呼びます。
一方で、転移形成の主な原因であり、他方では腫瘍生検よりも容易であるため、可変材料を表します。確かに、それらは単純な血液穿刺によって収集することができる。血液検体中のこれらの細胞の数が少ないにもかかわらず、我々は3D制御された状態を使用してより大きな懸念を持つ患者の血液からいくつかの循環腫瘍細胞株を確立する最初のものである。
この細胞株は、ルーチン実験用の任意の市販細胞株で使用することができる。例えば、遺伝薬物スクリーニングのために、目的とするタンパク質に対して、腫瘍開始能力およびその転移電位を試験するin vivo実験についてもも行う。CTCは、循環腫瘍細胞株、低酸素症の3D条件で培養されるべきである。
CTCが球体を形成したら、それを中型に入れて、300 RCFで5分間遠心分離することができます。上清を捨て、アキュマックスの500マイクロリットルを加えます。我々は1つを中断し、37度で溶液を20分インキュベートする。
次に、解き放った球をPBSとペレットで洗浄します。ペレットを補充し直したDMEM/F12で再懸濁し、新しい24低付着プレートでマイクロリットル当たり5細胞の密度で細胞を見ます。遠心分離機CTC球は上清を除去し、PBSでペレットを2回洗浄します。
PFEの500マイクロリットルでよく混合し、20分間氷の上にチューブをインキュベート。次いで、固定球を遠心分離し、PBSでペレットを2回洗浄し、PBSの最大体積を排除し、20マイクロリットルのフィストゲルを形成した。懸濁液に持って行き、培養花瓶に液滴を作り、10分間乾燥させ、メスを使って取り外します。
必要な目的のタンパク質を標的とするCTCに対して、任意の所望の処理が可能になりました。CTC を収集し、前述したように球と Accumax との関連付けを解除します。Accumaxを排除し、ブロッキングバッファーの3 mLでペレットを再懸濁し、14マイクロメートルのセルストレーナーを介して懸濁液を転送して単一細胞溶液を得る。
細胞を数え、チューブにディスパッチし、200,000個の細胞の体積を追加し、チューブを遠心分離し、上清を捨てます。抗体データシートによると、チューブ、抗体の所望の体積、および別のチューブのアイソタイプを追加し、メーカーのガイダンスに従って手順を続行します。残りのチューブはラベル付けされず、生存率市場の使用がこの実験で強く示唆されています。
サイトメーターで、非ラベル付きチューブから始め、負の標識領域の電圧を設定します。これに続いて、アイソタイプチューブを配置します。アイソタイプは、正のシグナルと非特異的な信号を区別する負のコントロールとして機能します。
そして、目的のタンパク質が発現している場合は、正に標識されたゲートのシフトを見る必要がある目的の抗体を持つ標識された細胞で実験を終了します。これは、mL当たり200,000細胞の密度で補充された培地での解約CTCを中断する。超低付着96では、ウェルプレート、50マイクロリットルの体積を密封し、低酸素でプレートを24時間インキュベートする。
翌日、試験薬物の異なる濃度の50マイクロリットルを追加し、さらに細胞生存率の塩基を決定し、さらに48時間プレートをインキュベートするためにDMEM / F12の同じボリュームを追加します。3日目に、薬剤を再構成し、各ウェルに70マイクロリットルのミックスを加える。プレートを軌道シェーカーに20分間置き、発光を測定します。
このアッセイは、CTCの細胞増殖に及ぼす影響を評価するために多数の薬物を試験するのに有用なツールである。エペンドルフでは、PBSの100マイクロリットルの細胞を再懸濁して、マウスの背面の皮膚をつまみ、針を皮膚の下に挿入する。同じ場所に全容をゆっくりと注入し、2日ごとに腫瘍の成長を監視し、腫瘍が1.5立方センチメートルのサイズを超えた場合にマウスを犠牲にする。
手術の前に、皮下に鎮痛剤を注入し、マウスの側側の側腹側で、10番目の肋骨の下に小さな切開を行う。脾臓をそっと持ち上げ、滅菌ガーゼの上に置きます。インスリン注射器を使用して、PBSに再懸濁されたCTCの50マイクロリットルを注入し、針を取り外さずに3分間待ちます。
一方の側から動脈血管をリゲートし、もう一方の側から静脈血管をリゲートします。その後、2つの合字の真上を切って脾臓を取り除く。腹部腹膜と皮膚を縫い合わせ、よくその領域を消毒します。
本実験の目的は、大腸癌患者由来のCTCが、目に見える転移性の先見性を誘発することによって肝臓を植民地化する能力を試験することである。クリニック腫瘍細胞株の分離と確立は、基礎的および翻訳的研究の両方のための創発的なツールである。例えば、インビボ研究がこの大腸癌細胞株の移動および浸潤能力に関与していることを示した関心のある遺伝子を有する場合、マウスの脾臓に注射する前に循環腫瘍細胞株でこの遺伝子をノックアウトし、肝臓を植民地化させるのは、生体内での結果を確認する良いツールであるかもしれない。
翻訳研究のために、循環腫瘍細胞株を単離するという私たちの主な視点は、この貴重な材料をパーソナライズされた医学に使用することです。患者の血液サンプルから、利用可能な薬物のパネルをスクリーニングし、最終的に帰属する細胞毒性を評価するのに十分な材料を持つために、培養中のCTCを2〜3週間分離して増幅する
