JASはデュークがん研究所、デューク大学泌尿生殖器腫瘍学研究所、および整形外科のデューク大学の学部からの支援を認めています。 HLは、理論生物物理学のための国立科学財団（NSF）センターによってサポートされていました（NSF PHY-1427654）およびNSF DMS-1361411、およびテキサス州の癌研究におけるCPRITとして（がん予防とテキサス州の研究所）奨学生ライス大学。 KEWはメアリー・C・ファラック-カーソン、JN Onuchic、サミル・M・ハナッシュ、ケネス・J・ピエンタ、ドナルドS. Coffeyのに有用な議論の恩恵を受けたNIH F32 CA192630 MKJ及びHLによって支持されました。

試薬の調製<ol><li>ウシ胎児血清（FBS）およびペニシリン - ストレプトマイシン（5,000 U / mL）をDMEMの500mLのに5mlを50ミリリットルを添加することによって、細胞培養のためのDMEMを調製します。この媒体は最大6ヶ月間4℃で保存することができます。 </li><li> 10μMの最終濃度にヌクレアーゼフリー水で凍結乾燥されたプライマーを再懸濁します。 -20℃で保存して再懸濁したプライマー。 </li><li>放射性免疫沈降アッセイ（RIPA）緩衝液（150mMのNaCl、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、50mMトリス、pH8.0）に調製します。使用前にプロテアーゼ阻害剤カクテルを補足し、使用時には氷の上のバッファを維持します。 4°Cで保存。 </li><li> 0.45μmのポリエーテルスルホンフィルターを用いて滅菌水およびシリンジフィルター中10mg / mLのポリブレン（臭化ヘキサジメトリン）を準備。ソリューションは、最大6ヶ月間4℃で保存することができます。 </li><li> PBSの10mLの中10mgを溶解することによりニトロブルーテトラゾリウムクロリドの1mg / mlのワーキング溶液を調製します。 4°Cで保存。</li></ol> GRHL2 2.レンチウイルス形質導入 1日目 <ol><li>プレート補充DMEM 2mL中の6ウェルプレートのウェルあたり3×10 5 HEK293T細胞。自動細胞カウンターを用いて細胞を定量化します。 5％CO 2で37℃で一晩培養した後、60％コンフルエント-細胞は40でなければなりません。 </li></ol> 2日目 <ol start="2"><li> 1.8pΔ8.9μgのとのpCMV-VSV0.2μgのと共に無血清培地200μlの2空ベクターμgの（のpCMV-UBC-EGFP）又は2のpCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24μgの、25を希釈-Gヘルパープラスミド。別個のチューブにおいて、トランスフェクションあたり無血清培地の200μL（二つのサンプル400μL8μL）中の脂質ベースのトランスフェクション試薬の4μLに希釈します。各プラスミド溶液に、トランスフェクション試薬混合物の200μLを加え、室温で20分間インキュベートします。 </li><li> incuba中、ンは、真空吸引によって培地を除去し、PBS 1mLで細胞を洗浄することによりHEK293T細胞を洗浄します。無血清培地の800μLとPBSを交換してください。 5％CO 2中で37℃で2時間細胞を各ウェルにステップ2.2滴下からのプラスミド混合物をインキュベートし、20分後、トランスフェクション試薬の200μLを加えます。 </li><li>慎重に真空吸引によりトランスフェクション培地を除去して補充したDMEMの2mLで交換してください。一晩の培養インキュベーターにセルを返します。 注：HEK293T細胞は緩く付着しています。メディアの交換は、皿またはフラスコの底から細胞を除去することを制限するように注意して行わなければなりません。 </li></ol> 3日目 <ol start="5"><li>補充DMEM 2 mlにトランスフェクトされたHEK293T細胞とプレートの6ウェルプレートのウェルあたり3×10 5 RD細胞を培地をリフレッシュ。一晩の培養細胞。 RD細胞は、市販のヒト横紋筋肉腫細胞株です。 </li></ol> 4日目 </P&gt; <ol start="6"><li> HEK293T細胞からのウイルスのメディアを収集します。新しい15 mLコニカルにHEK293T細胞および場所からDMEM培地をピペット。慎重に新しいDMEM培地に交換し、次の日のために戻っインキュベーターでHEK293T細胞を置きます。 </li><li>二つの新しい50mlにウイルス培地1mL当たりの10mg / mLのポリブレンコニカルチューブ（空ベクタートランスフェクション用とGRHL2トランスフェクションのための別）の2μLを加えます。 3mLのシリンジからプランジャーを取り外し、先端に0.45μmのポリエーテルスルホンフィルターを取り付けることにより、シリンジフィルターウイルス媒体。 <ol><li>注射器のバレルにステップ2.6に収集ウイルスメディアを追加し、そしてポリブレンを含有する新しい50 mLコニカルチューブに培地を突入。真空吸引によってRD細胞から培地を除去し、RD細胞濾過ウイルスメディアを追加します。 </li></ol></li></ol> 5日目 <ol start="8"><li>ウイルスのメディアが収集された後に繰り返して4日目HEK293T細胞を破棄することができます。 </li></ol> 7日目 </強いです&gt; <ol start="9"><li> PBS 1mlで洗浄RD細胞およびウェルあたり0.05％トリプシンの200μLを加えます。 、5分間37℃でインキュベート補充した培地2 mLを加え、そして新しい15 mLコニカルに細胞懸濁液を移動させます。室温と吸引メディアで5分間250×gで遠心分離細胞。 DMEM 1mLの（5％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充した）中に再懸濁します。 注：FBSの高い割合を使用するには、フローサイトメトリーの間に目詰まりを起こすことがあり<ol><li>フローサイトメトリーのためのフィルタセル。氷上のチューブと場所チューブ、フローサイトメトリーに30μmのフィルターを通して1mLのRD細胞懸濁液を適用するためにピペットを使用。 </li><li> DMEMの0.5 mLを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブにソート+ EGFP細胞26は、氷上で、10％FBSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン及び場所を補充しました。プレートEGFP +培養インキュベーター中、12ウェルプレート及び場所の単一のウェルに添加したDMEM 1mLの合計で細胞を選別しました。 ;注：フローサイトメトリーからこの形質導入後のEGFP +細胞の収率は、通常、低い（50,000〜100,000細胞）です。ステップ3に進む前に、14日 - 細胞は、10培養する必要があるかもしれません。 </li></ol></li></ol> miR-200Sの3リバーストランスフェクション<ol><li>反復凍結/融解サイクルを回避するために、-20℃で、ヌクレアーゼフリーのH 2つの Oアリコートストック及びストアを使用したmiR-200模倣体の50μMのストックを調製。 </li><li> 300μlの無血清培地を無血清培地300μLまたは50μM陰性対照miRNAの9μLを各50μMのmiR-200模倣（MIR-200A、のmiR-200B、およびmiR-200C）の3μLを加えます。 </li><li>無血清培地の600μLに対するsiRNA特異的トランスフェクション試薬の6μLを添加し、2本のチューブ、ステップ3.2からの二つのmiR混合物の各々のための1つに、この混合物の300μLを分割します。トランスフェクション試薬の300μLの混合物でステップ3.2からそれぞれのmiR混合物の300μLを組み合わせます。部屋TEで20分間インキュベートmperature。 </li><li>インキュベートしながら、処置あたり無血清培地の2.4mLの（250個の細胞/μL）でセクション2で作成したEVやGRHL2を発現60万EGFP + RD細胞の細胞懸濁液を調製します。 </li><li> 24ウェルプレートでは、6つのウェルにステップ3.3からのmiR-200の混合物または陰性対照ミックスウェル当たり100μLを追加し、それぞれのmiRミックスの3つのウェルに各細胞懸濁液400μLを加えます。 </li><li>一晩CO 2 5％で37℃で細胞をインキュベートし、完全に次の日DMEMを補完するために、メディアを変更します。適切な緩衝液（下記参照）を使用して分析のために2日後に細胞を回収。 METを受けRD肉腫細胞のタイムラプスイメージングは​​、補足資料として提供されています。画像の自動化生細胞イメージャ27を使用して10倍を目的とした各ウェルごとに2時間。 </li></ol> 4. RNA抽出、逆転写、および定量PCR <ol><li>標準RNAを使用して、製造業者の指示に従ってRNAを抽出抽出キット24。抽出されたRNAは、-80℃で保存することができます。 </li><li> RNA濃度を定量化します。解凍し、氷上でRNAで動作します。 RNA濃度を定量化するために、製造業者のプロトコルに従ってプレートリーダー分光光度計を用いて260nmでのUV吸光度を測定します。ヌクレアーゼフリー水で最低の濃度になるように、全ての試料を希釈します。 </li><li>相補的DNA（cDNA）にトータルRNAの逆転写を行います。 20μlの反応容量24に転写し、ヌクレアーゼフリー水、逆PCRバッファ、dNTPミックス（100ミリモル）、ランダムヘキサマープライマーを用いてトータルRNAのない未満100 ngのを結合しません。製造者のプロトコールに従ってRTサイクルを実行します。 cDNAを-20℃で長期保存することができます。 </li><li>ヌクレアーゼを含まないH 2 Oの80μL100μLに20μLの反応を希釈</li><li>蛍光ベースの挿入色素2倍のqPCRマスターミックスの5μL、各10μMプライマーの0.06μLを混合サンプルあたりの希釈RT反応のND 2μL。 </li><li>蛍光ベースのマスターミックスのための製造業者のプロトコルに従って、定量PCRを実行します。 </li><li>デルタCT法によるmRNAの相対量を定量化し、GAPDHに正規化します。各治療群の標準偏差±生物学的複製の平均mRNA発現をプロットします。 注：RNAを扱う場合には、特別な注意事項は、RNaseフリーのプラスチックおよび試薬を使用するなどのRNase、との接触を避けるように注意する必要があります。非使い捨て機器は、RNアーゼを削除するには、使用前に処理しなければなりません。 </li></ol> 5.免疫蛍光染色<ol><li>次のステップ3.6、24ウェルフォーマットでRD細胞からの真空吸引により吸引媒体。 </li><li>ウェル当たり4％パラホルムアルデヒド（PFA）の500μLを加えることによって細胞を固定し、室温（RT）で15分間インキュベートします。必要に応じて固定後、リン酸場所細胞を4℃で一晩生理食塩水（PBS）とストアバッファリング。 </li><li>透過処理PBS + 0.2％のTriton-X100の500μLを添加し、RTで30分間インキュベートすることにより細胞。真空吸引によって、透過化緩衝液を除去し、PBSで3回洗浄します。 </li><li> 5％ウシ血清アルブミン（BSA）/ PBS 500μLでブロックし、室温で30分間、細胞をインキュベートします。必要であれば、細胞を4℃で一晩保存することができます。 </li><li>一次抗体の希釈を準備します。 15 mLコニカルに5％BSAのピペットを200μL/ウェルPBS（12個のウェル= 2.4 mL）および5％BSA 1mLあたり一次抗体の1μLを追加/ PBSは、必要に応じ。真空吸引によってブロッキングバッファーを除去し、各ウェルに希釈した一次抗体200μLを分注します。 <ol><li>室温で又は一晩4℃で1時間、5％BSA / PBS中で一次抗体を希釈千：1で細胞をインキュベートします。インキュベーション後、PBSで細胞を2回洗浄します。 </li></ol></li><li>上記のように5％BSA / PBSの同じ体積の二次抗体の希釈液を調製。 2000希釈：1を使用して遠赤色色素結合二次抗体を追加します。さらに追加ミックスにHoechst色素を1μg/ mLです。 PBSを削除し、各ウェルにミックスの200μLを追加します。 <ol><li>暗所で室温で1時間インキュベートします。 PBSで3回洗浄し、PBSで細胞を残し、そして箔を用いた光から細胞を保護します。必要であれば、細胞を4℃で保存することができます。 </li></ol></li><li> 650nmの - 励起波長594を有する倒立落射蛍光顕微鏡で400倍総合倍率で画像セル。 </li></ol> 6.ウェスタンブロッティング<ol><li>氷冷PBSで2回3.6から細胞を洗浄します。氷の上に、1×RIPA緩衝液の50μLで溶解細胞は、1×プロテアーゼ阻害剤カクテルを補いました。 </li><li> 15分間4℃でロック溶解物を、1.5mLのチューブにライセートを収集し、そしてサンプルを明確に5分間高速（2万XG）で遠心分離。必要に応じて細胞溶解物を-80℃で長期保存することができます。 </li><li>ブラッドフォードアッセイを用いて総タンパク質を定量し、新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに等量のタンパク質をアリコート。ブリン2-メルカプトエタノールを補充したRIPA緩衝液と3倍のLaemmliローディング緩衝液を用いて等量のg個のサンプル。 </li><li> 95℃で5分間、1XのLaemmliサンプルローディングバッファーでサンプルをインキュベートし、45分間200 Vで4-12％のトリス - グリシンゲルを用いてSDS-PAGEを実行します。タンパク質の量は、細胞株に応じた範囲をロードしました。いくつかのケースでは、全タンパク質の50〜100μgの間葉系細胞株におけるE-カドヘリンを検出するために必要とされます。 </li><li> 1×トリス - グリシントランスファー緩衝液中の50 Vで2時間ニトロセルロース膜に転写タンパク質。 </li><li> BSAベースのブロッキング緩衝液中で室温または一晩、4℃で1時間ブロック膜。 </li><li> 、ブロッキング緩衝液5ml 1,000濃度を膜に希釈液を追加し、穏やかに室温で又は一晩4℃で1時間、揺らしながらインキュベート：1で一次抗体を希釈します。 0.05％Tween-20を用いて膜をPBSで3回洗浄します。 </li><li>赤外蛍光結合secondarと共にRTで1時間膜をインキュベート1のY抗体：上記のようにブロッキング緩衝液20,000希釈。 </li><li> 0.05％のTween-20を含むPBS中で膜を2回洗浄し、PBS中で次に一度。 </li><li>標準の赤外蛍光検出を用いた画像の膜。 </li></ol> 7.足場非依存性増殖アッセイ注：詳細軟寒天アッセイプロトコルの場合、28を参照してください。 <ol><li>湯浴中で42°Cまで暖かい滅菌2X DMEM培地。この間、熱が3分間マイクロ波中で1％アガロースを事前オートクレーブ。必要に応じて、一度に又は完全に溶融するまでさらに30秒間電子レンジ。 42°Cの水浴にアガロース移動します。 </li><li>無菌フード内の42℃の水を用いてビーカー中で50 mLコニカルチューブを置き、1で1％アガロース及び2X DMEM培地を混ぜる：6ウェルプレートにウェルあたり混合物1.5mlのための1比アカウンティング。必ずピペッティング誤差を考慮して、気泡を避けるために、余分なDMEM /アガロースを準備します。 </li><li>に混合物を追加ウェルの側面、気泡フォームを確保せず、室温で30分間放置。 </li><li>底層が固化されている間、培地を吸引し、1mLのPBSで1回洗浄することにより、ステップ3でトランスフェクトされたRD細胞の各群を準備します。吸引PBSと0.05％トリプシンの0.2 mLを加え、5分間37℃でインキュベートします。 </li><li>単一細胞懸濁液を形成するために、メディア及び粉砕物細胞の0.8 mLのトリプシンを中和します。 15 mLコニカルチューブに細胞懸濁液を移します。 </li><li>細胞を数え、ウェルあたり10,000個の細胞に必要な細胞懸濁液の体積を計算します。 </li><li>完全に溶融するまでの時間で30秒、続いて3分間マイクロ波で0.6％アガロースを加熱します。 42°Cの水浴にアガロース移動します。 </li><li>無菌フード内の42℃の水を用いてビーカー中で50 mLコニカルチューブを置きます。 6ウェルプレートにウェル当たり混合物の1.5mLのを準備するために1：1の比で0.6％アガロース希釈細胞懸濁液を混合します。必ずピペッティング誤差を考慮して混ぜアガロース/余分な細胞懸濁液を調製し、泡を避けるために。 注：ここは42°Cで動作することが重要です。温度が低すぎると、混合物は、めっき前に固化し、42°C以上の温度では細胞生存率に影響を与えます。 </li><li>細胞を数回粉砕することによってよく混合し、気泡フォームを保証しない、ウェルに細胞混合物を添加し、RTで20分間凝固させ。 </li><li> 各ウェルに添加した培地2 mLを加え、インキュベーターにプレートを移動させます。 <ol><li> 3-4週間または多細胞コロニーが形成するまで、週に一度メディアを変更します。真空吸引により培地を除去する際の寒天に触れないように注意してください。代替的に、液体媒体の最上層を除去するために、P1000を使用します。 </li><li>ニトロブルーテトラゾリウムクロリド溶液の200μL（PBS中1mg / ml）を添加することによって、軟寒天プレートを染色し、37℃で一晩プレートをインキュベートします。撮像のためにPBSで翌日のメディアを交換してください。 </li><li>倒立顕微鏡で40倍総合倍率での画像ウェル。 </li><li>コロニー面積と数のためのImageJの分析を行います。プロットは、標準偏差±生物学的複製のコロニー数を意味します。 </li></ol></li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-Mesenchymal+Transition+Phenotype+Is+Associated+with+Clinicopathological+Factors+That+Indicate+Aggressive+Biological+Behavior+and+Poor+Clinical+Outcomes+in+Invasive+Breast+Cancer.">Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype Is Associated with Clinicopathological Factors That Indicate Aggressive Biological Behavior and Poor Clinical Outcomes in Invasive Breast Cancer.</a> J Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).</li><li>Humphries, B., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA-200+family:+small+molecules+with+novel+roles+in+cancer+development,+progression+and+therapy.">The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy.</a> Oncotarget. 6 (9), 6472-6498 (2015).</li><li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+of+primary+high-grade+soft+tissue+sarcomas.">MicroRNA profiling of primary high-grade soft tissue sarcomas.</a> Genes Chromosomes Cancer. 51 (11), 982-996 (2012).</li><li>Petrof, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+GRHL2+result+in+an+autosomal-recessive+ectodermal+Dysplasia+syndrome.">Mutations in GRHL2 result in an autosomal-recessive ectodermal Dysplasia syndrome.</a> Am J Hum Genet. 95 (3), 308-314 (2014).</li><li>Werner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+of+the+transcription+factor+grainyhead-like+2+(GRHL2)+in+breast+cancer.">Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer.</a> J Biol Chem. 288 (32), 22993-23008 (2013).</li><li>Werth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+grainyhead-like+2+regulates+the+molecular+composition+of+the+epithelial+apical+junctional+complex.">The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex.</a> Development. 137 (22), 3835-3845 (2010).</li><li>Somarelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal-Epithelial+Transition+in+Sarcomas+Is+Controlled+by+the+Combinatorial+Expression+of+MicroRNA+200s+and+GRHL2.">Mesenchymal-Epithelial Transition in Sarcomas Is Controlled by the Combinatorial Expression of MicroRNA 200s and GRHL2.</a> Mol Cell Biol. 36 (19), 2503-2513 (2016).</li><li>Varma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factors+Grainyhead-like+2+and+NK2-homeobox+1+form+a+regulatory+loop+that+coordinates+lung+epithelial+cell+morphogenesis+and+differentiation.">The transcription factors Grainyhead-like 2 and NK2-homeobox 1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation.</a> J Biol Chem. 287 (44), 37282-37295 (2012).</li><li>Pruitt, S. C., Mielnicki, L. M., Stewart, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fluorescent+protein+expressing+cells+by+flow+cytometry.">Analysis of fluorescent protein expressing cells by flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 263, 239-258 (2004).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+morphological+screen+identifies+novel+microRNAs+that+regulate+neuroblastoma+cell+differentiation.">A high-content morphological screen identifies novel microRNAs that regulate neuroblastoma cell differentiation.</a> Oncotarget. 5 (9), 2499-2512 (2014).</li><li>Borowicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+soft+agar+colony+formation+assay.">The soft agar colony formation assay.</a> J Vis Exp. (92), e51998 (2014).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+proteomics+and+genomics+analysis+reveals+a+novel+mesenchymal+to+epithelial+reverting+transition+in+leiomyosarcoma+through+regulation+of+slug.">Integrated proteomics and genomics analysis reveals a novel mesenchymal to epithelial reverting transition in leiomyosarcoma through regulation of slug.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (11), 2405-2413 (2010).</li><li>Alba-Castellon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snail1+expression+is+required+for+sarcomagenesis.">Snail1 expression is required for sarcomagenesis.</a> Neoplasia. 16 (5), 413-421 (2014).</li><li>Takaishi, M., Tarutani, M., Takeda, J., Sano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+to+Epithelial+Transition+Induced+by+Reprogramming+Factors+Attenuates+the+Malignancy+of+Cancer+Cells.">Mesenchymal to Epithelial Transition Induced by Reprogramming Factors Attenuates the Malignancy of Cancer Cells.</a> PLoS One. 11 (6), e0156904 (2016).</li></ol>

著者は、開示することは何もありません。

肉腫はまれですが、間葉系細胞系譜の非常に攻撃的な癌。彼らの間葉系統にもかかわらず、肉腫のサブセットは、より多くの上皮様状態への表現型の転移を起こすように見えます。より多くの上皮様腫瘍の患者は、24あまり積極的であるとして、このMET-のようなスイッチは、予後関連性を持っています。その臨床的関連性にもかかわらず、肉腫でこれらの表現型の遷移を駆?...

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Shenghan Xu
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Shengnan Xu

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Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

表現型の可塑性は、細胞の表現型との間の可逆的な遷移を指し、一般に二つのタイプ、上皮 - 間葉（EMT）遷移と間葉ツー上皮移行（MET）に分割されています。この表現型の可塑性は、このような開発や創傷治癒1と多細胞生物の正常なプロセスにおいて重要な役割を果たしています。しかしながら、これらの同じ経路および遺伝子発現プログラムはまた、線維症のような疾患につながることができ、（2に概説、3、4）、癌転移（参考文献5、6、7、8に概説）。転移の間に、例えば、EMTは、細胞極性、細胞-細胞相互作用を破壊、および浸潤9,10を促進します。一緒に、EMTが貢献します癌細胞の普及を促進する表現型状態秒。また、EMTはまた、癌細胞の代謝6の規制緩和、薬物抵抗11、12の開発を含む積極的な表現型を駆動する他の表現型の変化、増加腫瘍開始能13,14及び免疫回避15をホストのホストにつながります。 表現型可塑性はよく癌の進行に研究されてきました。しかし、肉腫はまた、表現型の可塑性を示します。癌における表現型の可塑性の同じドライバーのいくつかはまた、肉腫の可塑性と積極性に貢献しているかのよう興味深いことに、それが表示されます。例えば、肉腫患者からの循環腫瘍細胞（CTCのは）のEpCAM、典型的には上皮細胞16に見出される細胞表面タンパク質を発現することが示されています。 ADDItionally、250個の軟部組織肉腫サンプルは遺伝子発現に基づいて、上皮様または間葉様に分類しました。上皮様バイオマーカーの署名の患者は間葉様バイオマーカーの署名17の患者よりも良い予後を持っていました。これは、より多くの上皮様癌の患者は、より間葉様腫瘍18の患者と比較して、より良い結果を持っている多くの癌腫、と一致しています。 いくつかの肉腫は、バイオマーカーおよびMETと一致した遺伝子発現の経路を表示しますが、この表現型可塑性の分子基盤はよくわかっていないまま。肉腫にMETのメカニズムおよびドライバを研究するために、我々は2上皮固有の要因を使用してMET誘導のモデルを開発し、マイクロRNA（MIR）-200家族とgrainyheadのような2（GRHL2）。 MIR-200S messenの3&#39; のUTRに結合することによって遺伝子発現を調節する小さな非コードRNAのファミリーでありますGERのRNAとタンパク質への翻訳を阻止します。 miR-141およびmiR-200Aを含むもの、およびmiR-200B、MIR-200C、およびmiR-429を含む他の - のmiR-200ファミリーは、2つのサブグループから成ります。 miR-200ファミリーのメンバーは、上皮組織に富んでいる、とのmiR-200Sの損失は癌19に転移と関連しています。 miR-200ファミリーはまた、正常組織20と比較して、軟組織肉腫にダウンレギュレートされます。 miR-200Sと同様に、GRHL2は、上皮の開発21のために重要である重要な調節因子です。例えばE-カドヘリンなどの上皮の遺伝子をアップレギュレートする2つの方法でGRHL2転写因子が作用する：1）上皮細胞において、GRHL2直接EMTマスタレギュレータ、ZEB1 22を抑制する。 2）GRHL2直接上皮遺伝子23の転写を活性化します。私たちの以前の研究は、肉腫細胞におけるmiR-200SとGRHL2の組み合わせ表現を示していますMET様表現型24を誘導します。ここで、我々は、miR-200SとGRHL2の異所性発現を使用して肉腫細胞におけるMET誘導のin vitroモデルを作成するための詳細なプロトコルを提示します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Countess automated counter</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc</td>
			<td>LI-COR Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA7 Real Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>321-29-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK4602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starting Block (PBS) Blocking Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>37538</td>
			<td>BSA-based blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose General Purpose LE</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris/Glycine/SDS Buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc</td>
			<td>161-0732</td>
			<td>Running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris/Glycine Buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc</td>
			<td>161-0734</td>
			<td>Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>SLBG8489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran 0.45 &#956;m nitrocellulose</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>10600012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA MiniPrep Kit</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>11-358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Tetra Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc</td>
			<td>1658005EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAi Max</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Ragents</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRVana miRNA mimic negative control #1</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4464058</td>
			<td>neg miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-miR-200 mirVana miRNA mimic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4464066</td>
			<td>miR200A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>has-miR-200 mirVana miRNA mimic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4404066</td>
			<td>miR200B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>has-miR-200 mirVana miRNA mimic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4404066</td>
			<td>miR200C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11088-021</td>
			<td>serum-free media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ecadherin antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-beta actin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-69879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-EpCam</td>
			<td>Ab Serotec</td>
			<td>MCA18706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ZO1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>402200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800W</td>
			<td>LI-COR Inc</td>
			<td>925-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680</td>
			<td>LI-COR Inc</td>
			<td>926-32223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse AlexaFluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A211241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit AlexaFluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ab150075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatesse Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1861281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Dual Color</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partec CellTrics</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2326</td>
			<td>30 &#956;m filter for flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH-F</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>AGCCACATCGCTCAGACAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH-R</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>GCCCAATACGACCAAATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecadherin-F</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>TGGAGGAATTCTTGCTTTGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecadherin-R</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>CGCTCTCCTCCGAAGAAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEB1-F</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEB1-R</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>CGATTACACCCAGACTGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOTCH-F</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>GGCAATCCGAGGACTATGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOTCH-R</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>CTCAGAACGCACTCGTTGAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitro blue tetrazolium&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N5514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hexadimethrine bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>polybrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL polypropylene round-bottom tube</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
			<td>flow cytometry tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4368814</td>
			<td>reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldyhyde</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of mesenchymal-epithelial transitions in sarcoma cells

表現型の可塑性は、細胞が一過別系統の形質を獲得する現象をいいます。癌の進行中に、表現型可塑性が侵略、普及および転移を駆動します。表現型の可塑性の研究のほとんどは、上皮由来の癌の文脈でされているが実際に、それはmesenchymal-に似た現象を受け肉腫のサブセットで、また、表現型の可塑性を示し、起源に間葉ある肉腫を、判明します上皮移行（MET）。ここで、我々は、それぞれ、順次GRHL2およびmiR-200ファミリーは、細胞形質導入およびトランスフェクションを使用して発現肉腫患者samples.Weで観察されたこのMET状現象を模倣するためのmiR-200ファミリーとgrainyhead様2（GRHL2）を含む方法を開発しました、より良い肉腫細胞におけるこれらの表現型の遷移の分子基盤を理解します。 miR-200SとGRHL2を表現肉腫細胞が強化された上皮characteristを実証しました細胞形態および上皮および間葉バイオマーカーの変化にICS。これらのメソッドを使用して今後の研究では、より良い、このような移動、浸潤、転移性の傾向、および治療抵抗として肉腫細胞にMETのようなプロセスの表現型の結果を理解するために使用することができます。

肉腫細胞におけるMETの誘導のためのスキーマ肉腫細胞におけるMET状変化の誘導のための一般的なタイムラインは、 図1に示されています。プロトコルは、miR-200ファミリー（ 図1B）のトランスフェクションに続いてGRHL2（ 図1A）を 、形質導入することによって開始します。 GRHL2またはmiR-20...

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Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

ここでは、マイクロRNA-200ファミリーメンバーとgrainyhead様2（GRHL2）の合成異所性発現に基づく肉腫細胞における間葉上皮移行（MET）を誘導する細胞培養方法を提示します。この方法は、癌の悪性度や治療上の表現型可塑性の生物学的影響をよりよく理解するために適しています。

肉腫細胞における間葉上皮移行の誘導

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

induction-of-mesenchymal-epithelial-transitions-in-sarcoma-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K ビュー.  Duke University. ここでは、マイクロRNA-200ファミリーメンバーとgrainyhead様2（GRHL2）の合成異所性発現に基づく肉腫細胞における間葉上皮移行（MET）を誘導する細胞培養方法を提示します。この方法は、癌の悪性度や治療上の表現型可塑性の生物学的影響をよりよく理解するために適しています。 

ビデオ: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

発生生物学

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro is essential for mechanistic studies of the endothelial-hematopoietic transition and hematopoietic specification. Here, we describe a method for the efficient induction of HE from human pluripotent stem cells (hPSCs) by way of overexpression of different sets of transcription factors. The combination of ETV2 and GATA1 or GATA2 TFs is used to induce HE with pan-myeloid potential, while a combination of GATA2 and TAL1 transcription factors allows for the production of HE with erythroid and megakaryocytic potential. The addition of LMO2 to GATA2 and TAL1 combination substantially accelerates differentiation and increases erythroid and megakaryocytic cells production. This method provides an efficient and rapid means of HE induction from hPSCs and allows for the observation of the endothelial-hematopoietic transition in a culture dish. The protocol includes hPSCs transduction procedures and post-transduction analysis of HE and blood progenitors.

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 &#215; g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

遠心重力によって脂肪由来幹細胞の軟骨形成分化誘導

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

生きた蛙およびゼブラフィッシュの胚における低酸素の誘導

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

ひと初代細胞における細胞老化の誘導性

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are extremely scarce, but expanded CPCs could be useful for cell therapy. A prerequisite for their use is their ability to differentiate in a controlled manner into the various cardiac lineages using defined and efficient protocols. In addition, upon in vitro expansion, CPCs isolated from patients or preclinical disease models may offer fruitful research tools for the investigation of disease mechanisms.
Current studies use different markers to identify CPCs. However, not all of them are expressed in humans, which limits the translational impact of some preclinical studies. Differentiation protocols that are applicable irrespective of the isolation technique and marker expression will allow for the standardized expansion and priming of CPCs for cell therapy purpose. Here we describe that the priming of CPCs under a low fetal bovine serum (FBS) concentration and low cell density conditions facilitates the endothelial differentiation of CPCs. Using two different subpopulations of mouse and rat CPCs, we show that laminin is a more suitable substrate than fibronectin for this purpose under the following protocol: after culturing for 2 - 3 days in medium including supplements that maintain multipotency and with 3.5% FBS, CPCs are seeded on laminin at &#60;60% confluence and cultured in supplement-free medium with low concentrations of FBS (0.1%) for 20 - 24 hours before differentiation in endothelial differentiation medium. Because CPCs are a heterogeneous population, serum concentrations and incubation times may need to be adjusted depending on the properties of the respective CPC subpopulation. Considering this, the technique can be applied to other types of CPCs as well and provides a useful method to investigate the potential and mechanisms of differentiation and how they are affected by disease when using CPCs isolated from respective disease models.

This protocol describes an endothelial differentiation technique for cardiac progenitor cells. It particularly focuses on how serum concentration and cell-seeding density affect the endothelial differentiation potential.

低血清条件下で心臓前駆細胞の内皮への分化の誘導

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...