JASはデュークがん研究所、デューク大学泌尿生殖器腫瘍学研究所、および整形外科のデューク大学の学部からの支援を認めています。 HLは、理論生物物理学のための国立科学財団（NSF）センターによってサポートされていました（NSF PHY-1427654）およびNSF DMS-1361411、およびテキサス州の癌研究におけるCPRITとして（がん予防とテキサス州の研究所）奨学生ライス大学。 KEWはメアリー・C・ファラック-カーソン、JN Onuchic、サミル・M・ハナッシュ、ケネス・J・ピエンタ、ドナルドS. Coffeyのに有用な議論の恩恵を受けたNIH F32 CA192630 MKJ及びHLによって支持されました。

試薬の調製<ol><li>ウシ胎児血清（FBS）およびペニシリン - ストレプトマイシン（5,000 U / mL）をDMEMの500mLのに5mlを50ミリリットルを添加することによって、細胞培養のためのDMEMを調製します。この媒体は最大6ヶ月間4℃で保存することができます。 </li><li> 10μMの最終濃度にヌクレアーゼフリー水で凍結乾燥されたプライマーを再懸濁します。 -20℃で保存して再懸濁したプライマー。 </li><li>放射性免疫沈降アッセイ（RIPA）緩衝液（150mMのNaCl、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、50mMトリス、pH8.0）に調製します。使用前にプロテアーゼ阻害剤カクテルを補足し、使用時には氷の上のバッファを維持します。 4°Cで保存。 </li><li> 0.45μmのポリエーテルスルホンフィルターを用いて滅菌水およびシリンジフィルター中10mg / mLのポリブレン（臭化ヘキサジメトリン）を準備。ソリューションは、最大6ヶ月間4℃で保存することができます。 </li><li> PBSの10mLの中10mgを溶解することによりニトロブルーテトラゾリウムクロリドの1mg / mlのワーキング溶液を調製します。 4°Cで保存。</li></ol> GRHL2 2.レンチウイルス形質導入 1日目 <ol><li>プレート補充DMEM 2mL中の6ウェルプレートのウェルあたり3×10 5 HEK293T細胞。自動細胞カウンターを用いて細胞を定量化します。 5％CO 2で37℃で一晩培養した後、60％コンフルエント-細胞は40でなければなりません。 </li></ol> 2日目 <ol start="2"><li> 1.8pΔ8.9μgのとのpCMV-VSV0.2μgのと共に無血清培地200μlの2空ベクターμgの（のpCMV-UBC-EGFP）又は2のpCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24μgの、25を希釈-Gヘルパープラスミド。別個のチューブにおいて、トランスフェクションあたり無血清培地の200μL（二つのサンプル400μL8μL）中の脂質ベースのトランスフェクション試薬の4μLに希釈します。各プラスミド溶液に、トランスフェクション試薬混合物の200μLを加え、室温で20分間インキュベートします。 </li><li> incuba中、ンは、真空吸引によって培地を除去し、PBS 1mLで細胞を洗浄することによりHEK293T細胞を洗浄します。無血清培地の800μLとPBSを交換してください。 5％CO 2中で37℃で2時間細胞を各ウェルにステップ2.2滴下からのプラスミド混合物をインキュベートし、20分後、トランスフェクション試薬の200μLを加えます。 </li><li>慎重に真空吸引によりトランスフェクション培地を除去して補充したDMEMの2mLで交換してください。一晩の培養インキュベーターにセルを返します。 注：HEK293T細胞は緩く付着しています。メディアの交換は、皿またはフラスコの底から細胞を除去することを制限するように注意して行わなければなりません。 </li></ol> 3日目 <ol start="5"><li>補充DMEM 2 mlにトランスフェクトされたHEK293T細胞とプレートの6ウェルプレートのウェルあたり3×10 5 RD細胞を培地をリフレッシュ。一晩の培養細胞。 RD細胞は、市販のヒト横紋筋肉腫細胞株です。 </li></ol> 4日目 </P&gt; <ol start="6"><li> HEK293T細胞からのウイルスのメディアを収集します。新しい15 mLコニカルにHEK293T細胞および場所からDMEM培地をピペット。慎重に新しいDMEM培地に交換し、次の日のために戻っインキュベーターでHEK293T細胞を置きます。 </li><li>二つの新しい50mlにウイルス培地1mL当たりの10mg / mLのポリブレンコニカルチューブ（空ベクタートランスフェクション用とGRHL2トランスフェクションのための別）の2μLを加えます。 3mLのシリンジからプランジャーを取り外し、先端に0.45μmのポリエーテルスルホンフィルターを取り付けることにより、シリンジフィルターウイルス媒体。 <ol><li>注射器のバレルにステップ2.6に収集ウイルスメディアを追加し、そしてポリブレンを含有する新しい50 mLコニカルチューブに培地を突入。真空吸引によってRD細胞から培地を除去し、RD細胞濾過ウイルスメディアを追加します。 </li></ol></li></ol> 5日目 <ol start="8"><li>ウイルスのメディアが収集された後に繰り返して4日目HEK293T細胞を破棄することができます。 </li></ol> 7日目 </強いです&gt; <ol start="9"><li> PBS 1mlで洗浄RD細胞およびウェルあたり0.05％トリプシンの200μLを加えます。 、5分間37℃でインキュベート補充した培地2 mLを加え、そして新しい15 mLコニカルに細胞懸濁液を移動させます。室温と吸引メディアで5分間250×gで遠心分離細胞。 DMEM 1mLの（5％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充した）中に再懸濁します。 注：FBSの高い割合を使用するには、フローサイトメトリーの間に目詰まりを起こすことがあり<ol><li>フローサイトメトリーのためのフィルタセル。氷上のチューブと場所チューブ、フローサイトメトリーに30μmのフィルターを通して1mLのRD細胞懸濁液を適用するためにピペットを使用。 </li><li> DMEMの0.5 mLを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブにソート+ EGFP細胞26は、氷上で、10％FBSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン及び場所を補充しました。プレートEGFP +培養インキュベーター中、12ウェルプレート及び場所の単一のウェルに添加したDMEM 1mLの合計で細胞を選別しました。 ;注：フローサイトメトリーからこの形質導入後のEGFP +細胞の収率は、通常、低い（50,000〜100,000細胞）です。ステップ3に進む前に、14日 - 細胞は、10培養する必要があるかもしれません。 </li></ol></li></ol> miR-200Sの3リバーストランスフェクション<ol><li>反復凍結/融解サイクルを回避するために、-20℃で、ヌクレアーゼフリーのH 2つの Oアリコートストック及びストアを使用したmiR-200模倣体の50μMのストックを調製。 </li><li> 300μlの無血清培地を無血清培地300μLまたは50μM陰性対照miRNAの9μLを各50μMのmiR-200模倣（MIR-200A、のmiR-200B、およびmiR-200C）の3μLを加えます。 </li><li>無血清培地の600μLに対するsiRNA特異的トランスフェクション試薬の6μLを添加し、2本のチューブ、ステップ3.2からの二つのmiR混合物の各々のための1つに、この混合物の300μLを分割します。トランスフェクション試薬の300μLの混合物でステップ3.2からそれぞれのmiR混合物の300μLを組み合わせます。部屋TEで20分間インキュベートmperature。 </li><li>インキュベートしながら、処置あたり無血清培地の2.4mLの（250個の細胞/μL）でセクション2で作成したEVやGRHL2を発現60万EGFP + RD細胞の細胞懸濁液を調製します。 </li><li> 24ウェルプレートでは、6つのウェルにステップ3.3からのmiR-200の混合物または陰性対照ミックスウェル当たり100μLを追加し、それぞれのmiRミックスの3つのウェルに各細胞懸濁液400μLを加えます。 </li><li>一晩CO 2 5％で37℃で細胞をインキュベートし、完全に次の日DMEMを補完するために、メディアを変更します。適切な緩衝液（下記参照）を使用して分析のために2日後に細胞を回収。 METを受けRD肉腫細胞のタイムラプスイメージングは​​、補足資料として提供されています。画像の自動化生細胞イメージャ27を使用して10倍を目的とした各ウェルごとに2時間。 </li></ol> 4. RNA抽出、逆転写、および定量PCR <ol><li>標準RNAを使用して、製造業者の指示に従ってRNAを抽出抽出キット24。抽出されたRNAは、-80℃で保存することができます。 </li><li> RNA濃度を定量化します。解凍し、氷上でRNAで動作します。 RNA濃度を定量化するために、製造業者のプロトコルに従ってプレートリーダー分光光度計を用いて260nmでのUV吸光度を測定します。ヌクレアーゼフリー水で最低の濃度になるように、全ての試料を希釈します。 </li><li>相補的DNA（cDNA）にトータルRNAの逆転写を行います。 20μlの反応容量24に転写し、ヌクレアーゼフリー水、逆PCRバッファ、dNTPミックス（100ミリモル）、ランダムヘキサマープライマーを用いてトータルRNAのない未満100 ngのを結合しません。製造者のプロトコールに従ってRTサイクルを実行します。 cDNAを-20℃で長期保存することができます。 </li><li>ヌクレアーゼを含まないH 2 Oの80μL100μLに20μLの反応を希釈</li><li>蛍光ベースの挿入色素2倍のqPCRマスターミックスの5μL、各10μMプライマーの0.06μLを混合サンプルあたりの希釈RT反応のND 2μL。 </li><li>蛍光ベースのマスターミックスのための製造業者のプロトコルに従って、定量PCRを実行します。 </li><li>デルタCT法によるmRNAの相対量を定量化し、GAPDHに正規化します。各治療群の標準偏差±生物学的複製の平均mRNA発現をプロットします。 注：RNAを扱う場合には、特別な注意事項は、RNaseフリーのプラスチックおよび試薬を使用するなどのRNase、との接触を避けるように注意する必要があります。非使い捨て機器は、RNアーゼを削除するには、使用前に処理しなければなりません。 </li></ol> 5.免疫蛍光染色<ol><li>次のステップ3.6、24ウェルフォーマットでRD細胞からの真空吸引により吸引媒体。 </li><li>ウェル当たり4％パラホルムアルデヒド（PFA）の500μLを加えることによって細胞を固定し、室温（RT）で15分間インキュベートします。必要に応じて固定後、リン酸場所細胞を4℃で一晩生理食塩水（PBS）とストアバッファリング。 </li><li>透過処理PBS + 0.2％のTriton-X100の500μLを添加し、RTで30分間インキュベートすることにより細胞。真空吸引によって、透過化緩衝液を除去し、PBSで3回洗浄します。 </li><li> 5％ウシ血清アルブミン（BSA）/ PBS 500μLでブロックし、室温で30分間、細胞をインキュベートします。必要であれば、細胞を4℃で一晩保存することができます。 </li><li>一次抗体の希釈を準備します。 15 mLコニカルに5％BSAのピペットを200μL/ウェルPBS（12個のウェル= 2.4 mL）および5％BSA 1mLあたり一次抗体の1μLを追加/ PBSは、必要に応じ。真空吸引によってブロッキングバッファーを除去し、各ウェルに希釈した一次抗体200μLを分注します。 <ol><li>室温で又は一晩4℃で1時間、5％BSA / PBS中で一次抗体を希釈千：1で細胞をインキュベートします。インキュベーション後、PBSで細胞を2回洗浄します。 </li></ol></li><li>上記のように5％BSA / PBSの同じ体積の二次抗体の希釈液を調製。 2000希釈：1を使用して遠赤色色素結合二次抗体を追加します。さらに追加ミックスにHoechst色素を1μg/ mLです。 PBSを削除し、各ウェルにミックスの200μLを追加します。 <ol><li>暗所で室温で1時間インキュベートします。 PBSで3回洗浄し、PBSで細胞を残し、そして箔を用いた光から細胞を保護します。必要であれば、細胞を4℃で保存することができます。 </li></ol></li><li> 650nmの - 励起波長594を有する倒立落射蛍光顕微鏡で400倍総合倍率で画像セル。 </li></ol> 6.ウェスタンブロッティング<ol><li>氷冷PBSで2回3.6から細胞を洗浄します。氷の上に、1×RIPA緩衝液の50μLで溶解細胞は、1×プロテアーゼ阻害剤カクテルを補いました。 </li><li> 15分間4℃でロック溶解物を、1.5mLのチューブにライセートを収集し、そしてサンプルを明確に5分間高速（2万XG）で遠心分離。必要に応じて細胞溶解物を-80℃で長期保存することができます。 </li><li>ブラッドフォードアッセイを用いて総タンパク質を定量し、新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに等量のタンパク質をアリコート。ブリン2-メルカプトエタノールを補充したRIPA緩衝液と3倍のLaemmliローディング緩衝液を用いて等量のg個のサンプル。 </li><li> 95℃で5分間、1XのLaemmliサンプルローディングバッファーでサンプルをインキュベートし、45分間200 Vで4-12％のトリス - グリシンゲルを用いてSDS-PAGEを実行します。タンパク質の量は、細胞株に応じた範囲をロードしました。いくつかのケースでは、全タンパク質の50〜100μgの間葉系細胞株におけるE-カドヘリンを検出するために必要とされます。 </li><li> 1×トリス - グリシントランスファー緩衝液中の50 Vで2時間ニトロセルロース膜に転写タンパク質。 </li><li> BSAベースのブロッキング緩衝液中で室温または一晩、4℃で1時間ブロック膜。 </li><li> 、ブロッキング緩衝液5ml 1,000濃度を膜に希釈液を追加し、穏やかに室温で又は一晩4℃で1時間、揺らしながらインキュベート：1で一次抗体を希釈します。 0.05％Tween-20を用いて膜をPBSで3回洗浄します。 </li><li>赤外蛍光結合secondarと共にRTで1時間膜をインキュベート1のY抗体：上記のようにブロッキング緩衝液20,000希釈。 </li><li> 0.05％のTween-20を含むPBS中で膜を2回洗浄し、PBS中で次に一度。 </li><li>標準の赤外蛍光検出を用いた画像の膜。 </li></ol> 7.足場非依存性増殖アッセイ注：詳細軟寒天アッセイプロトコルの場合、28を参照してください。 <ol><li>湯浴中で42°Cまで暖かい滅菌2X DMEM培地。この間、熱が3分間マイクロ波中で1％アガロースを事前オートクレーブ。必要に応じて、一度に又は完全に溶融するまでさらに30秒間電子レンジ。 42°Cの水浴にアガロース移動します。 </li><li>無菌フード内の42℃の水を用いてビーカー中で50 mLコニカルチューブを置き、1で1％アガロース及び2X DMEM培地を混ぜる：6ウェルプレートにウェルあたり混合物1.5mlのための1比アカウンティング。必ずピペッティング誤差を考慮して、気泡を避けるために、余分なDMEM /アガロースを準備します。 </li><li>に混合物を追加ウェルの側面、気泡フォームを確保せず、室温で30分間放置。 </li><li>底層が固化されている間、培地を吸引し、1mLのPBSで1回洗浄することにより、ステップ3でトランスフェクトされたRD細胞の各群を準備します。吸引PBSと0.05％トリプシンの0.2 mLを加え、5分間37℃でインキュベートします。 </li><li>単一細胞懸濁液を形成するために、メディア及び粉砕物細胞の0.8 mLのトリプシンを中和します。 15 mLコニカルチューブに細胞懸濁液を移します。 </li><li>細胞を数え、ウェルあたり10,000個の細胞に必要な細胞懸濁液の体積を計算します。 </li><li>完全に溶融するまでの時間で30秒、続いて3分間マイクロ波で0.6％アガロースを加熱します。 42°Cの水浴にアガロース移動します。 </li><li>無菌フード内の42℃の水を用いてビーカー中で50 mLコニカルチューブを置きます。 6ウェルプレートにウェル当たり混合物の1.5mLのを準備するために1：1の比で0.6％アガロース希釈細胞懸濁液を混合します。必ずピペッティング誤差を考慮して混ぜアガロース/余分な細胞懸濁液を調製し、泡を避けるために。 注：ここは42°Cで動作することが重要です。温度が低すぎると、混合物は、めっき前に固化し、42°C以上の温度では細胞生存率に影響を与えます。 </li><li>細胞を数回粉砕することによってよく混合し、気泡フォームを保証しない、ウェルに細胞混合物を添加し、RTで20分間凝固させ。 </li><li> 各ウェルに添加した培地2 mLを加え、インキュベーターにプレートを移動させます。 <ol><li> 3-4週間または多細胞コロニーが形成するまで、週に一度メディアを変更します。真空吸引により培地を除去する際の寒天に触れないように注意してください。代替的に、液体媒体の最上層を除去するために、P1000を使用します。 </li><li>ニトロブルーテトラゾリウムクロリド溶液の200μL（PBS中1mg / ml）を添加することによって、軟寒天プレートを染色し、37℃で一晩プレートをインキュベートします。撮像のためにPBSで翌日のメディアを交換してください。 </li><li>倒立顕微鏡で40倍総合倍率での画像ウェル。 </li><li>コロニー面積と数のためのImageJの分析を行います。プロットは、標準偏差±生物学的複製のコロニー数を意味します。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition%2C+TGF-beta%2C+and+osteopontin+in+wound+healing+and+tissue+remodeling+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Burn+Care+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury.</a> J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).</li>
<li>Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT-MET+in+renal+disease%3A+should+we+curb+our+enthusiasm%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">EMT-MET in renal disease: should we curb our enthusiasm.</a> Cancer Lett. 341 (1), 24-29 (2013).</li>
<li>Carew, R. M., Wang, B., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+EMT+in+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The role of EMT in renal fibrosis.</a> Cell Tissue Res. 347 (1), 103-116 (2012).</li>
<li>Willis, B. C., Borok, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+EMT%3A+mechanisms+and+implications+for+fibrotic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced EMT: mechanisms and implications for fibrotic lung disease.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (3), L525-L534 (2007).</li>
<li>Ye, X., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-Mesenchymal+Plasticity%3A+A+Central+Regulator+of+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial-Mesenchymal Plasticity: A Central Regulator of Cancer Progression.</a> Trends Cell Biol. 25 (11), 675-686 (2015).</li>
<li>Li, L., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+human+cancer%3A+comprehensive+reprogramming+of+metabolism%2C+epigenetics%2C+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in human cancer: comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation.</a> Pharmacol Ther. 150, 33-46 (2015).</li>
<li>Tsai, J. H., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+plasticity+in+carcinoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis.</a> Genes Dev. 27 (20), 2192-2206 (2013).</li>
<li>Bitting, R. L., Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Garcia-Blanco, M. A., Armstrong, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+epithelial+plasticity+in+prostate+cancer+dissemination+and+treatment+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of epithelial plasticity in prostate cancer dissemination and treatment resistance.</a> Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 441-468 (2014).</li>
<li>Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Migration+and+Invasion+Uncoupled%3A+Increased+Migration+Is+Not+an+Inexorable+Consequence+of+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular Migration and Invasion Uncoupled: Increased Migration Is Not an Inexorable Consequence of Epithelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Mol Cell Biol. 34 (18), 3486-3499 (2014).</li>
<li>Mathow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zeb1+affects+epithelial+cell+adhesion+by+diverting+glycosphingolipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Zeb1 affects epithelial cell adhesion by diverting glycosphingolipid metabolism.</a> EMBO Rep. 16 (3), 321-331 (2015).</li>
<li>Ware, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+resistance+to+gefitinib+mediated+by+cellular+reprogramming+and+the+acquisition+of+an+FGF2-FGFR1+autocrine+growth+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">A mechanism of resistance to gefitinib mediated by cellular reprogramming and the acquisition of an FGF2-FGFR1 autocrine growth loop.</a> Oncogenesis. 2, e39(2013).</li>
<li>Yauch, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+versus+mesenchymal+phenotype+determines+in+vitro+sensitivity+and+predicts+clinical+activity+of+erlotinib+in+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients.</a> Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8686-8698 (2005).</li>
<li>Jolly, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+elucidating+the+connection+between+epithelial-mesenchymal+transitions+and+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Towards elucidating the connection between epithelial-mesenchymal transitions and stemness.</a> J R Soc Interface. 11 (101), 20140962(2014).</li>
<li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133 (4), 704-715 (2008).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+is+regulated+via+microRNA-200%2FZEB1+axis+control+of+tumour+cell+PD-L1+expression+and+intratumoral+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Metastasis is regulated via microRNA-200/ZEB1 axis control of tumour cell PD-L1 expression and intratumoral immunosuppression.</a> Nat Commun. 5, 5241(2014).</li>
<li>Nicolazzo, C., Gradilone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+circulating+tumor+cells+in+soft+tissue+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Significance of circulating tumor cells in soft tissue sarcoma.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , 697395(2015).</li>
<li>Somarelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://mcb.asm.org/content/early/2016/07/08/MCB.00373-16.abstract">Mesenchymal-epithelial transition in sarcomas is controlled by the combinatorial expression of miR-200s and GRHL2.</a> Mol Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-Mesenchymal+Transition+Phenotype+Is+Associated+with+Clinicopathological+Factors+That+Indicate+Aggressive+Biological+Behavior+and+Poor+Clinical+Outcomes+in+Invasive+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype Is Associated with Clinicopathological Factors That Indicate Aggressive Biological Behavior and Poor Clinical Outcomes in Invasive Breast Cancer.</a> J Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).</li>
<li>Humphries, B., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA-200+family%3A+small+molecules+with+novel+roles+in+cancer+development%2C+progression+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy.</a> Oncotarget. 6 (9), 6472-6498 (2015).</li>
<li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+of+primary+high-grade+soft+tissue+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling of primary high-grade soft tissue sarcomas.</a> Genes Chromosomes Cancer. 51 (11), 982-996 (2012).</li>
<li>Petrof, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+GRHL2+result+in+an+autosomal-recessive+ectodermal+Dysplasia+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in GRHL2 result in an autosomal-recessive ectodermal Dysplasia syndrome.</a> Am J Hum Genet. 95 (3), 308-314 (2014).</li>
<li>Werner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+the+transcription+factor+grainyhead-like+2+%28GRHL2%29+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer.</a> J Biol Chem. 288 (32), 22993-23008 (2013).</li>
<li>Werth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+grainyhead-like+2+regulates+the+molecular+composition+of+the+epithelial+apical+junctional+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex.</a> Development. 137 (22), 3835-3845 (2010).</li>
<li>Somarelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-Epithelial+Transition+in+Sarcomas+Is+Controlled+by+the+Combinatorial+Expression+of+MicroRNA+200s+and+GRHL2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-Epithelial Transition in Sarcomas Is Controlled by the Combinatorial Expression of MicroRNA 200s and GRHL2.</a> Mol Cell Biol. 36 (19), 2503-2513 (2016).</li>
<li>Varma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factors+Grainyhead-like+2+and+NK2-homeobox+1+form+a+regulatory+loop+that+coordinates+lung+epithelial+cell+morphogenesis+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcription factors Grainyhead-like 2 and NK2-homeobox 1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation.</a> J Biol Chem. 287 (44), 37282-37295 (2012).</li>
<li>Pruitt, S. C., Mielnicki, L. M., Stewart, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fluorescent+protein+expressing+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fluorescent protein expressing cells by flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 263, 239-258 (2004).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+morphological+screen+identifies+novel+microRNAs+that+regulate+neuroblastoma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">A high-content morphological screen identifies novel microRNAs that regulate neuroblastoma cell differentiation.</a> Oncotarget. 5 (9), 2499-2512 (2014).</li>
<li>Borowicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soft+agar+colony+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The soft agar colony formation assay.</a> J Vis Exp. (92), e51998(2014).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+proteomics+and+genomics+analysis+reveals+a+novel+mesenchymal+to+epithelial+reverting+transition+in+leiomyosarcoma+through+regulation+of+slug%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Integrated proteomics and genomics analysis reveals a novel mesenchymal to epithelial reverting transition in leiomyosarcoma through regulation of slug.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (11), 2405-2413 (2010).</li>
<li>Alba-Castellon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snail1+expression+is+required+for+sarcomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Snail1 expression is required for sarcomagenesis.</a> Neoplasia. 16 (5), 413-421 (2014).</li>
<li>Takaishi, M., Tarutani, M., Takeda, J., Sano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+to+Epithelial+Transition+Induced+by+Reprogramming+Factors+Attenuates+the+Malignancy+of+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal to Epithelial Transition Induced by Reprogramming Factors Attenuates the Malignancy of Cancer Cells.</a> PLoS One. 11 (6), e0156904(2016).</li>
</ol>

著者は、開示することは何もありません。

肉腫はまれですが、間葉系細胞系譜の非常に攻撃的な癌。彼らの間葉系統にもかかわらず、肉腫のサブセットは、より多くの上皮様状態への表現型の転移を起こすように見えます。より多くの上皮様腫瘍の患者は、24あまり積極的であるとして、このMET-のようなスイッチは、予後関連性を持っています。その臨床的関連性にもかかわらず、肉腫でこれらの表現型の遷移を駆?...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55520/induction-of-mesenchymal-epithelial-transitions-in-sarcoma-cells">Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells</a>. An author name was updated.
One of the authors&#39; names was corrected from:
Shenghan Xu
to:
Shengnan Xu

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55520/induction-of-mesenchymal-epithelial-transitions-in-sarcoma-cells">Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells</a>. An author name was updated.

Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

表現型の可塑性は、細胞の表現型との間の可逆的な遷移を指し、一般に二つのタイプ、上皮 - 間葉（EMT）遷移と間葉ツー上皮移行（MET）に分割されています。この表現型の可塑性は、このような開発や創傷治癒1と多細胞生物の正常なプロセスにおいて重要な役割を果たしています。しかしながら、これらの同じ経路および遺伝子発現プログラムはまた、線維症のような疾患につながることができ、（2に概説、3、4）、癌転移（参考文献5、6、7、8に概説）。転移の間に、例えば、EMTは、細胞極性、細胞-細胞相互作用を破壊、および浸潤9,10を促進します。一緒に、EMTが貢献します癌細胞の普及を促進する表現型状態秒。また、EMTはまた、癌細胞の代謝6の規制緩和、薬物抵抗11、12の開発を含む積極的な表現型を駆動する他の表現型の変化、増加腫瘍開始能13,14及び免疫回避15をホストのホストにつながります。 表現型可塑性はよく癌の進行に研究されてきました。しかし、肉腫はまた、表現型の可塑性を示します。癌における表現型の可塑性の同じドライバーのいくつかはまた、肉腫の可塑性と積極性に貢献しているかのよう興味深いことに、それが表示されます。例えば、肉腫患者からの循環腫瘍細胞（CTCのは）のEpCAM、典型的には上皮細胞16に見出される細胞表面タンパク質を発現することが示されています。 ADDItionally、250個の軟部組織肉腫サンプルは遺伝子発現に基づいて、上皮様または間葉様に分類しました。上皮様バイオマーカーの署名の患者は間葉様バイオマーカーの署名17の患者よりも良い予後を持っていました。これは、より多くの上皮様癌の患者は、より間葉様腫瘍18の患者と比較して、より良い結果を持っている多くの癌腫、と一致しています。 いくつかの肉腫は、バイオマーカーおよびMETと一致した遺伝子発現の経路を表示しますが、この表現型可塑性の分子基盤はよくわかっていないまま。肉腫にMETのメカニズムおよびドライバを研究するために、我々は2上皮固有の要因を使用してMET誘導のモデルを開発し、マイクロRNA（MIR）-200家族とgrainyheadのような2（GRHL2）。 MIR-200S messenの3&#39; のUTRに結合することによって遺伝子発現を調節する小さな非コードRNAのファミリーでありますGERのRNAとタンパク質への翻訳を阻止します。 miR-141およびmiR-200Aを含むもの、およびmiR-200B、MIR-200C、およびmiR-429を含む他の - のmiR-200ファミリーは、2つのサブグループから成ります。 miR-200ファミリーのメンバーは、上皮組織に富んでいる、とのmiR-200Sの損失は癌19に転移と関連しています。 miR-200ファミリーはまた、正常組織20と比較して、軟組織肉腫にダウンレギュレートされます。 miR-200Sと同様に、GRHL2は、上皮の開発21のために重要である重要な調節因子です。例えばE-カドヘリンなどの上皮の遺伝子をアップレギュレートする2つの方法でGRHL2転写因子が作用する：1）上皮細胞において、GRHL2直接EMTマスタレギュレータ、ZEB1 22を抑制する。 2）GRHL2直接上皮遺伝子23の転写を活性化します。私たちの以前の研究は、肉腫細胞におけるmiR-200SとGRHL2の組み合わせ表現を示していますMET様表現型24を誘導します。ここで、我々は、miR-200SとGRHL2の異所性発現を使用して肉腫細胞におけるMET誘導のin vitroモデルを作成するための詳細なプロトコルを提示します。

<table><tbody><tr><td>Countess automated counter</td><td>Life technologies</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess cell counting chamber slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc</td><td>LI-COR Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 Real Time PCR System</td><td>Thermo Fisher</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>PCR microplate</td><td>Corning</td><td>321-29-051</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4602</td><td></td></tr><tr><td>Starting Block (PBS) Blocking Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>37538</td><td>BSA-based blocking buffer</td></tr><tr><td>Agarose General Purpose LE</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0732</td><td>Running buffer</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0734</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>SLBG8489</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran 0.45 &amp;mu;m nitrocellulose</td><td>GE Healthcare Lifesciences</td><td>10600012</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep Kit</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-358</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer (4X)</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAi Max</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Ragents</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>miRVana miRNA mimic negative control #1</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464058</td><td>neg miRNA</td></tr><tr><td>hsa-miR-200 mirVana miRNA mimic</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464066</td><td>miR200A</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA mimic</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200B</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA mimic</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200C</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life technologies</td><td>11088-021</td><td>serum-free media</td></tr><tr><td>anti-Ecadherin antibody</td><td>BD Bioscience</td><td>610182</td><td></td></tr><tr><td>anti-beta actin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-69879</td><td></td></tr><tr><td>anti-EpCam</td><td>Ab Serotec</td><td>MCA18706</td><td></td></tr><tr><td>anti-ZO1</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800W</td><td>LI-COR Inc</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680</td><td>LI-COR Inc</td><td>926-32223</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A211241</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab150075</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatesse Inhibitor</td><td>Thermo Fisher</td><td>1861281</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Partec CellTrics</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td>30 &amp;mu;m filter for flow</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>AGCCACATCGCTCAGACAC</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>GCCCAATACGACCAAATCC</td></tr><tr><td>Ecadherin-F</td><td>IDT</td><td></td><td>TGGAGGAATTCTTGCTTTGC</td></tr><tr><td>Ecadherin-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGCTCTCCTCCGAAGAAAC</td></tr><tr><td>ZEB1-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC</td></tr><tr><td>ZEB1-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGATTACACCCAGACTGC</td></tr><tr><td>NOTCH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GGCAATCCGAGGACTATGAG</td></tr><tr><td>NOTCH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCAGAACGCACTCGTTGAT</td></tr><tr><td>nitro blue tetrazolium&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N5514</td><td></td></tr><tr><td>hexadimethrine bromide</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>polybrene</td></tr><tr><td>3 mL syringe</td><td>BD Bioscience</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Sterile syringe filter</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>5mL polypropylene round-bottom tube</td><td>352063</td><td></td><td>flow cytometry tubes</td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>4368814</td><td>reverse transcription kit</td></tr><tr><td>4% paraformaldyhyde</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281612</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr></tbody></table>

induction of mesenchymal-epithelial transitions in sarcoma cells

表現型の可塑性は、細胞が一過別系統の形質を獲得する現象をいいます。癌の進行中に、表現型可塑性が侵略、普及および転移を駆動します。表現型の可塑性の研究のほとんどは、上皮由来の癌の文脈でされているが実際に、それはmesenchymal-に似た現象を受け肉腫のサブセットで、また、表現型の可塑性を示し、起源に間葉ある肉腫を、判明します上皮移行（MET）。ここで、我々は、それぞれ、順次GRHL2およびmiR-200ファミリーは、細胞形質導入およびトランスフェクションを使用して発現肉腫患者samples.Weで観察されたこのMET状現象を模倣するためのmiR-200ファミリーとgrainyhead様2（GRHL2）を含む方法を開発しました、より良い肉腫細胞におけるこれらの表現型の遷移の分子基盤を理解します。 miR-200SとGRHL2を表現肉腫細胞が強化された上皮characteristを実証しました細胞形態および上皮および間葉バイオマーカーの変化にICS。これらのメソッドを使用して今後の研究では、より良い、このような移動、浸潤、転移性の傾向、および治療抵抗として肉腫細胞にMETのようなプロセスの表現型の結果を理解するために使用することができます。

肉腫細胞におけるMETの誘導のためのスキーマ肉腫細胞におけるMET状変化の誘導のための一般的なタイムラインは、 図1に示されています。プロトコルは、miR-200ファミリー（ 図1B）のトランスフェクションに続いてGRHL2（ 図1A）を 、形質導入することによって開始します。 GRHL2またはmiR-20...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells at JoVE.com

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

ここでは、マイクロRNA-200ファミリーメンバーとgrainyhead様2（GRHL2）の合成異所性発現に基づく肉腫細胞における間葉上皮移行（MET）を誘導する細胞培養方法を提示します。この方法は、癌の悪性度や治療上の表現型可塑性の生物学的影響をよりよく理解するために適しています。

肉腫細胞における間葉上皮移行の誘導

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

induction-of-mesenchymal-epithelial-transitions-in-sarcoma-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K ビュー.  Duke University. ここでは、マイクロRNA-200ファミリーメンバーとgrainyhead様2（GRHL2）の合成異所性発現に基づく肉腫細胞における間葉上皮移行（MET）を誘導する細胞培養方法を提示します。この方法は、癌の悪性度や治療上の表現型可塑性の生物学的影響をよりよく理解するために適しています。 

ビデオ: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

癌細胞による内皮細胞単層の侵入を測定するリアルタイム電気インピーダンス基づく手法

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

医学

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under the influence of specific environmental signals, these adult stem cells can release paracrine mediators leading to accelerated tumor growth and metastasis. Defining the crosstalk between tumor and MSCs is of primary importance to understand the mechanisms underlying cancer progression and identify novel targets for therapeutic intervention. 
Cancer cells produce high amounts of extracellular vesicles (EVs), which can profoundly affect the behavior of target cells in the tumor microenvironment or at distant sites. Tumor EVs enclose functional biomolecules, including inflammatory RNAs and (onco)proteins, that can educate stromal cells to enhance the metastatic behavior of cancer cells or to participate in the pre-metastatic niche formation. In this article, we describe the development of a preclinical cancer mouse model that enables specific evaluation of the EV-mediated crosstalk between tumor and mesenchymal stem cells. First, we describe the purification and characterization of tumor-secreted EVs and the assessment of the EV internalization by MSCs. We then make use of a multiplex bead-based immunoassay to evaluate the alteration of the MSC cytokine expression profile induced by cancer EVs. Finally, we illustrate the generation of a bioluminescent orthotopic xenograft mouse model of osteosarcoma that recapitulates the tumor-MSC interaction, and show the contribution of EV-educated MSCs to tumor growth and metastasis formation. 
Our model provides the opportunity to define how cancer EVs shape a tumor-supporting environment, and to evaluate whether blockade of the EV-mediated communication between tumor and MSCs prevents cancer progression.

Direct injection of cancer-derived extracellular vesicles (EVs) leads to reprogramming of bone marrow supporting tumor progression; however, which cells mediate this effect is unclear. Herein, we describe a step-by-step protocol to investigate EV-mediated tumor-mesenchymal stem cell (MSC) interactions in vivo, revealing a crucial role for EV-educated MSCs in metastasis.

腫瘍と間葉系幹細胞の間細胞小胞を介した通信を定義する骨肉腫のマウスの前臨床モデル

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

がん研究

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

開発<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイは、間葉細胞受けた上皮間葉移行の収縮機能を評価します

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

発生生物学

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during embryonic development that also commonly occurs in glioblastoma, the most frequent malignant brain tumor. EMT has also been observed in multiple carcinomas outside the brain including breast cancer, lung cancer, colon cancer, gastric cancer. EMT is centrally linked to malignancy by promoting migration, invasion and metastasis formation. The mechanisms of EMT induction are not fully understood. Here we describe an in vitro system for standardized isolation of cortical neural stem cells (NSCs) and subsequent EMT-induction. This system provides the flexibility to use either single cells or explant culture. In this system, rat or mouse embryonic forebrain NSCs are cultured in a defined medium, devoid of serum and enzymes. The NSCs expressed Olig2 and Sox10, two transcription factors observed in oligodendrocyte precursor cells (OPCs). Using this system, interactions between FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling involving Zeb1, Zeb2, and Twist2 were observed where TGF&#946;-activation significantly enhanced cell migration, suggesting a synergistic BMP-/TGF&#946;-interaction. The results point to a network of FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling to be involved in EMT induction and maintenance. This model system is relevant to investigate EMT in vitro. It is cost-efficient and shows high reproducibility. It also allows for the comparison of different compounds with respect to their migration responses (quantitative distance measurement), and high-throughput screening of compounds to inhibit or enhance EMT (qualitative measurement). The model is therefore well suited to test drug libraries for substances affecting EMT.

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

癌細胞浸潤への応用による腫瘍間質微小環境の組織工学

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

生物工学

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of TGF-&#946; signaling can lead to breast cancer. TGF-&#946; elicits its effects on proliferation and differentiation via specific cell surface TGF-&#946; type I and type II receptors (i.e., T&#946;RI and T&#946;RII) that contain an intrinsic serine/threonine kinase domain. Upon TGF-&#946;-induced heteromeric complex formation, activated T&#946;RI elicits intracellular signaling by phosphorylating SMAD2 and SMAD3. These activated SMADs form heteromeric complexes with SMAD4 to regulate specific target genes, including plasminogen activation inhibitor 1 (PAI-1, encoded by the SERPINE1 gene). The induction of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) allows epithelial cancer cells at the primary site or during colonization at distant sites to gain an invasive phenotype and drive tumor progression. TGF-&#946; acts as a potent inducer of breast cancer invasion by driving EMT. Here, we describe systematic methods to investigate TGF-&#946; signaling and EMT responses using premalignant human MCF10A-RAS (M2) cells and mouse NMuMG epithelial cells as examples. We describe methods to determine TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation by Western blotting, SMAD3/SMAD4-dependent transcriptional activity using luciferase reporter activity and SERPINE1 target gene expression by quantitative real-time-polymerase chain reaction (qRT-PCR). In addition, methods are described to examine TGF-&#946;-induced EMT by measuring changes in morphology, epithelial and mesenchymal marker expression, filamentous actin staining and immunofluorescence staining of E-cadherin. Two selective small molecule TGF-&#946; receptor kinase inhibitors, GW788388 and SB431542, were used to block TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation, target genes and changes in EMT marker expression. Moreover, we describe the transdifferentiation of mesenchymal breast Py2T murine epithelial tumor cells into adipocytes. Methods to examine TGF-&#946;-induced signaling and EMT in breast cancer may contribute to new therapeutic approaches for breast cancer.

We describe a systematic workflow to investigate TGF-&#946; signaling and TGF-&#946;-induced EMT by studying the protein and gene expression involved in this signaling pathway. The methods include Western blotting, a luciferase reporter assay, qPCR, and immunofluorescence staining.

乳がんおよび正常細胞におけるTGF-βシグナル伝達とTGF β誘発性上皮間葉間質転移の研究

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully recapitulate aspects of cancer progression such as proliferation and invasion. Although patient-derived organoids and patient-derived xenograft organoids are pathophysiologically relevant, they are costly to propagate, difficult to manipulate, and comprised primarily of the most proliferative cell types within the tumor microenvironment (TME). These limitations prevent their use for elucidating cellular mechanisms of disease progression that depend upon tumor-associated stromal cells which are found within the TME and known to contribute to metastasis and therapy resistance. 
Here, we report on methods for cultivating epithelial-stromal multicellular 3D cultures. The advantages of these methods include a cost-effective system for rapidly generating organoid-like 3D cultures within scaffold-free environments that can be used to track invasion at single-cell resolution within hydrogel scaffolds. Specifically, we demonstrate how to generate these heteromulticellular 3D cultures using BT-474 breast cancer cells in combination with fibroblasts (BJ-5ta), monocyte-like cells (THP-1), and/or endothelial cells (EA.hy926). Additionally, differential fluorescent labeling of cell populations enables time-lapse microscopy to define 3D culture assembly and invasion dynamics. 
Notably, the addition of any two stromal cell combinations to 3D cultures of BT-474 cells significantly reduces circularity of the 3D cultures, consistent with the presence of organoid-like or secondary spheroid structures. In tracker dye experiments, fibroblasts and endothelial cells co-localize in the peripheral organoid-like protrusions and are spatially segregated from the primary BT-474 spheroid. Finally, heteromulticellular 3D cultures of BT-474 cells have increased hydrogel invasion capacity. Since we observed these protrusive structures in heteromulticellular 3D cultures of both non-tumorigenic and tumorigenic breast epithelial cells, this work provides an efficient and reproducible method for generating organoid-like 3D cultures in a scaffold-free environment for subsequent analyses of phenotypes associated with solid tumor progression.

There is a critical need for 3D cancer models that capture heterocellular crosstalk to study cancer metastasis. Our study presents the generation of heteromulticellular stromal-epithelial in a scaffold and scaffold-free environment that can be used to study invasion and cellular spatial distributions.

上皮癌細胞のスキャフォールドフリー3D培養におけるヘテロ多細胞間質細胞による浸潤の促進

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

生物学

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

肉腫細胞における間葉上皮移行の誘導

要約

さらに動画を探す

癌細胞による内皮細胞単層の侵入を測定するリアルタイム電気インピーダンス基づく手法

腫瘍と間葉系幹細胞の間細胞小胞を介した通信を定義する骨肉腫のマウスの前臨床モデル

開発

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックスモデル

癌細胞浸潤への応用による腫瘍間質微小環境の組織工学

乳がんおよび正常細胞におけるTGF-βシグナル伝達とTGF β誘発性上皮間葉間質転移の研究

上皮癌細胞のスキャフォールドフリー3D培養におけるヘテロ多細胞間質細胞による浸潤の促進

間葉転換を誘導し、上皮の分析

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

肉腫細胞における間葉上皮移行の誘導

要約

さらに動画を探す

癌細胞による内皮細胞単層の侵入を測定するリアルタイム電気インピーダンス基づく手法

腫瘍と間葉系幹細胞の間細胞小胞を介した通信を定義する骨肉腫のマウスの前臨床モデル

開発

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

癌細胞浸潤への応用による腫瘍間質微小環境の組織工学

乳がんおよび正常細胞におけるTGF-βシグナル伝達とTGF β誘発性上皮間葉間質転移の研究

上皮癌細胞のスキャフォールドフリー3D培養におけるヘテロ多細胞間質細胞による浸潤の促進

間葉転換を誘導し、上皮の分析

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックスモデル