この方法は、骨腫瘍研究のための機能的な足場を調製するための効率的な戦略を提供する。骨外細胞化マトリックスを脱細胞化し、骨肉腫細胞の生存および活動に対する可変的な血清相溶性を示した。この技術の主な利点は、骨由来マトリックス中の骨肉腫細胞培養が臨床骨肉腫組織病理学と同様に非常に異種形態を示していることである。
この方法は、骨肉腫、ユーイング肉腫、および骨への転移の他の悪性腫瘍などの骨腫瘍の発達、薬物感受性の進行を調査するための理想的なモデルを提供する。まず、4〜6週齢のBALB/cマウスを得て、無菌手術用ハサミを使用してマウスを安楽死させた後、後肢から新鮮な脛骨、脛骨、大腿骨を切断する。ピンセットの助けを借りて、上皮組織を剥がし、できるだけ多くの軟部組織を取り除きます。
無菌10 mM PBS溶液で脚の骨を2回洗い流し、6センチメートルの皿の中の血液を取り除きます。骨を75%エタノールで3分間皿に浸し、PBSで2回洗いすます。清潔な骨を無菌の50ミリリットル遠心管に保管し、滅菌PBSチューブを摂氏80度で保存します。
凍った骨を室温で解凍し、摂氏80度で再び1時間凍結します。骨を細胞のリシスと組織の分解のための2つ以上の凍結融解サイクルに服従させる。その後、0.5正常なHClで満たされた無菌50ミリリットル遠心管に骨を入れ、骨の完全かつ均等なカバレッジを確保するために穏やかな揺れで軌道シェーカーの室温で一晩インキュベートします。
脱灰後、塩酸溶液を完全に脱栓し、流水の下で骨を1時間リンスします。その後、蒸留水を使用して、軌道シェーカーで1回15分間骨を2回洗浄します。ソリューションを完全にデカンスします。
脱塩した骨の脂質を抽出するには、メタノールとクロロホルムの1:1混合物で50ミリリットル遠心管に骨を入れます。クロロホルム分解防止のため、チューブをスズ箔で包み込んで光を避けます。そして、1時間軌道シェーカーにチューブを置きます。
その後、ピンセットを使用して、30分間スズ箔でメタノールの別のチューブに骨を移します。メタノールを完全に取り出し、眼窩シェーカーで蒸留水を15分間2回洗います。デカント最終洗浄水と滅菌条件下で進みます。
滅菌PBSで6センチメートルの皿で骨を3分間洗いすみます。無菌0.05%TE溶液40ミリリットルを50ミリリットルの遠心管に加え、37°Cの二酸化炭素インキュベーターで23時間骨をインキュベートします。TE溶液を廃棄し、90 g/mLアンピシリンと90 g/mLカナマイシンをオービタルシェーカーでそれぞれ15分間補充した滅菌PBSで2回リンスします。
最終洗浄を完全にデカントした後、抗生物質で滅菌PBSの40ミリリットルで再び補充する。多孔質空間の効果的な滅菌を達成するために穏やかな揺れで室温で24時間十分に洗います。次に、抗生物質で滅菌PBSで満たされた50ミリリットル遠心分離管に骨を移す。
調製された骨細胞外マトリックスは、摂氏4度で2ヶ月間保存することができる。BEMを75%エタノールに入れ、30秒間手で軽く振ります。その後、PBSで30秒間、2回リンスします。
BEMを清潔な6ウェル細胞培養プレートに移します。各ウェルに完全な培養培地の2ミリリットルを追加します。37°Cの二酸化炭素インキュベーターでBEMを一晩インキュベートします。
標識フェノールレッドを含む予め温めたPBSの100マイクロリットルでヒトOS細胞株を得る。ピペットを使用して、およそ10倍から5日までの濃度のOS細胞を一時停止します。BEMが培地に完全に浸漬された後、近位または遠位の骨端から、針をBEMの髄腔に穿孔し、OS細胞をBEMに注入する。
37°Cの加湿された5%の二酸化炭素雰囲気で最低2時間、OS-BEMモデルをインキュベートし、注入された細胞がBEMにしっかりと付着するようにします。次に、インキュベーターからプレートを取り出します。プレートに1ミリリットルの培養培地を加え、一晩インキュベーターに保管してBEM培養物の表面を完全にコーティングします。
OS-BEMモデルを滅菌用トゥイザー付きの6ウェルプレートの新しいウェルにそっと移し、1ミリリットルの新鮮な培養培地を再供給します。インキュベーターで14日間モデルを培養する。14日間のインキュベーション中は、中色をモニタリングし続けてください。
メディアがオレンジ色、あるいは黄色に変わったら、古い媒体の半分を捨てて新しい媒体を追加して、すぐにメディアをリフレッシュして、OSセルの健全な環境を維持します。反転蛍光顕微鏡下で細胞の状態を監視し続けます。OS細胞がプレートに膨張したら、OS-BEMモデルを滅菌ピンセットで別の新しいウェルにそっと移します。
14日間培養した後、PBSでOS-BEMモデルをそっとすすいで培養液を除去します。その後、15ミリリットル遠心分離管に移し、組織学的同定のために10%緩衝ホルマリンを加える。脱塩・脱細胞化後、BEMはネイティブマウスの骨に比べて強い弾力性と粘り強さを持つ半透明であるように見えます。
髄腔の空間に少し筋残渣が明確に観察される。天然骨および脱細胞化BEMの明視野イメージングは、細胞核の徹底的な除去を示す。コラーゲンネットワーク配置における自然多孔質構造は、脱細胞化BEMにおいて十分に維持される。
さらに、コラーゲンIおよびコラーゲンIVの免疫ヒストリカル染色は、細胞外マトリックスの主成分が脱細胞化後にマウス脛動物に保存されていることを示す。14日間の培養中、骨膜とエンドステウムの両方がOS細胞の増殖によって浸透する。細胞化されたBEM上のOS細胞は、OSセクションの細胞病理学的特徴と同様に、非常に異種の形態を示す。
14日間のBEMモデルで培養した後の免疫学的分析は、長期培養において大きな利点を示す。また、OS細胞およびBEM培養は、骨マトリックス糖タンパク質を高度に発現し、これは、骨マトリクスに特異的である。このin vitroの3次元モデルは、表現型の異質性と骨肉腫脱分化の調節メカニズムを実証するために使用されています。
