オリーブは、髄質の最も腹側部分であり、したがって、生きている動物に到達することは非常に困難です。ここでは、脳の脳の脳を腹側から出すプロトコルを紹介し、GRINレンズを用いて、カルシウムセンサーを発現する劣ったオリーブニューロンの神経活動を記録する。この方法は、生命に重要な脳幹への損傷を回避し、空間的時間的活動パターンと劣ったオリーブの入力統合に関する調査を可能にする。
手術は多くの重要な構造を有する複雑な咽喉領域で行われるので、高レベルの外科技術を有する研究者によって行われることが不可欠である。20ゲージカテーテルの先端から長さ5~6ミリメートル、幅0.8mmのスリットを切断して挿管チューブを用意します。先端を切り落とし、骨折表面を砂で切り、ペンチで曲げて、鈍くて曲げられた針を準備します。
これは気管切開中の気管を支えるために使用されます。15%の手術ツールと消耗品を組み立てるに生理食塩水で1ミリリットルケタミンあたり15ミリグラムを希釈します。暖房パッドを摂氏38度に設定します。
ステレオタックスフレームで、ノセッコを180度水平に回します。オリーブの劣ったマウスを以前にウイルスを運ぶGCaMP6sによってトランスフェクションしたマウスの重量を量り、注射のための希釈ケタミンの量を計算する。5%イソファランを備えたプレフィル誘導ボックス、マウスの麻酔を行います。
ステレオタックスフレームにマウスを取り付け、腹側を上に取り付けます。マウスの喉と太ももの領域を剃ります。脱毛クリームで残った髪を取り除きます。
喉の皮膚にキシロカインゼリーを局所的に塗布する。直腸熱センサーでマウス温度を監視します。腹腔内に1ミリリットルの予熱生理食塩水を注入する。
後肢のつま先に強いピンチで麻酔の深さを評価します。検出可能な応答を呼び出すべきではありません。正中線に沿って喉の皮膚に垂直切開を行います。
鈍い解剖法を使用して、その下の内臓から首の皮膚を分離し、皮膚を切断します。結合組織から唾液腺を解放し、それらを横に反転して、ステノ甲状腺筋肉で覆われた気管を露出させる。腹腔内は、動物の体重1キログラム当たり5ミリリットルで希釈ケタミンの最初の用量を注入する。
慎重に気管を露出するために細かい鉗子の先端と中線に沿ってステノ甲状腺筋肉を分割.鈍い解剖法を使用して鉗子で血管および食道から気管を切り離す。動物の体重1キログラム当たり2.5ミリリットルで希釈ケタミンの第二の用量を注入します。
横方向に気管の下に鈍い針を挿入します。鈍い針で気管を持ち上げます。縫合糸を3番目の気管リングの周りを回り、甲状腺を半分の円の針で尾行させます。
このリングに4つの楽器のネクタイを作ります。胸部の皮を同じ半円の針で突き刺し、糸を皮膚に通します。気管を糸でそっと持ち上げ、気管尾を甲状腺に切ります。
胸の皮膚に向かって気管を引っ張ります。その下に手術用スポンジの小片を追加することによって気管の開口部を上げます。洗浄ティッシュの薄いストリップと気管の開口部の先端の中に残っている液体を取除きます。
ステレオタキシックなノセコーンから挿管チューブにイオブルランの流れを切り替えます。挿管チューブを気管に挿入します。チューブのスリットの一部が気管の外側に残っていることを確認して呼吸を可能にします。
3~4本の楽器を結ぶと、マウス胸部の皮膚に気管を固定します。管切開チューブを固定するために縫合糸で気管を結びます。細かい鉗子で筋線維に沿って、ステノ甲状腺の筋肉をスリット.
スプリングハサミで孤立した部分を切り落とします。筋肉の血管の損傷を最小限に抑えるために、筋肉から慎重に残った気管と喉頭を解放します。残った気管と喉頭を取り除く。
鉗子で付着した組織から食道を解放し、春のはさみでそれを切り落とす。脳幹とアトラスの腹側のアーチを覆う縦方向の筋肉を取り除きます。アトラス腹側のアーチと前ツベルを覆う筋肉を取り除きます。
ロンダの腹側のアーチをロングールで切ります。アトラスの前塊茎を取り除く。血液と体液を取り除き、頭間のマグナムと脳幹を見ます。
後頭部の骨を回転骨で取り除くことによって、前頭部のマグナムを拡大する。軟骨を取り除き、硬膜の骨膜層を細かい鉗子で慎重に剥がし、腹側脳幹をはっきりと見る。マウスの太ももにSpO2センサーをクランプして、心拍数、酸素飽和度、呼吸速度などのバイタルサインを監視します。
GRINレンズを注入ロッドに取り付けます。70%エタノール浸し洗浄組織でレンズを丁寧に洗浄してください。ステレオタックスフレーム上の移植ロッドを固定し、移植ロッドにミニチュア顕微鏡を取り付けます。
GRINレンズを浸漬するために、脳幹領域に生理食糸を数滴加えます。GRINレンズで脳幹に近づく。表面領域に劣ったオリーブニューロンを発現するGCaMP6sは、長方形状の領域、残りのアトラスに約0.5〜1.7ミリメートルのロストラル、および正中線に約2.6〜1.1ミリメートルの横方向に見つけることができます。
ミニチュア顕微鏡で励起ブルーのLEDをオンにして、GCaMP6sのトランスフェクション劣ったオリーブニューロンを見つけます。ニューロンは、様々なGCaMP6s発現レベルに起因する異なるベースライン蛍光強度を示す。左側のビデオの円状の下にあるオリーブニューロンソマタのカルシウムレベルの変化は、デルタFを右側のFトレースで割って示しています。
マウスは暖かく保たれ、水分補給されますが、麻酔や手術の長期化によって必然的に弱くなります。マウスの体調が記録に適するように、手術の持続時間を短くしておくことが不可欠です。熟練した研究者は70分で手術を終えることができます。
この方法は、修飾を伴って、腹側脳幹の他の隣接領域を研究するために使用することができる。
