私たちのプロトコルは、覚醒マウスにおけるミクログリアダイナミクスとニューロン活動の同時イメージングを可能にします。ミクログリアの監視行動やニューロンとの相互作用を調べるために広く応用できます。この方法の利点は、堅牢な頭部固定により、モーションアーチファクトが画像データを汚染しにくいことです。
また、高フレームレートでのイメージング後の復元により、データからモーションアーチファクトを排除することができます。この方法では、AAV注射と頭蓋窓移植の手術は技術的に要求が厳しいです。最初は失敗がちなので、イライラしないでもっと練習してください。
注入装置を準備するには、チューブを介して26ゲージのハミルトンシリンジに接続されたガラスピペットを定位固定装置のピペットホルダーに置きます。次に、ピペットホルダーを垂直軸から前方に60度傾けます。ガラスピペット、シリンジ、および接続チューブに流動パラフィンを満たし、シリンジをマイクロインジェクターに置きます。
麻酔をかけたマウスに鎮痛剤を投与し、補助イヤーバーを取り付けます。次に、動物を背側を上にして脳定位固定装置に固定します。手術部位から脱毛し、手術部位を消毒した後、正中線に沿って頭皮を2センチの長さで切開し、右一次視覚野の上の頭蓋骨の露出を確保します。
鉗子を使用して、露出した頭蓋骨の骨膜を取り除きます。正中線の横方向に3ミリメートル、ラムダ線の前方に5ミリリットルの定位固定装置座標に頭蓋骨をドリルで開けて、直径約0.5ミリメートルの小さな穴を作ります。次に、マウスの露出した頭蓋骨に約2センチメートル×2センチメートルの透明なフィルムを置きます。
ピペッターを使用してフィルム上に1マイクロリットルのAAV溶液液滴を排出する。シリンジを進めます。そして、フィルム上のAAV溶液の液滴にガラスピペットチップを置き、シリンジをそっと引いてAAV溶液を吸引します。
次に、頭蓋骨に作られた穴を通して、脳表面から500マイクロメートルの深さまでガラスピペットを挿入します。次いで、マイクロインジェクターを用いて、1時間あたり2マイクロリットルの注入体積流量で0.5マイクロリットルのAAV溶液を注入する。針を引き出し、生理食塩水で脳表面を洗い流します。
穴を開けて頭蓋骨のマークに沿って円形の溝を作成します。破片をきれいにして頭蓋骨の視認性を確保し、掘削中の加熱を防ぐために生理食塩水を塗布します。中央の頭蓋骨を鉗子でそっと押します。
穴あけ深さは、抵抗が少なく垂直に動けば十分です。溝が十分な深さに達したら、鉗子の先端を中央の頭蓋骨断片の底に挿入します。そっと持ち上げて取り外し、脳の表面を露出させます。
27ゲージの針を使用して、露出した脳表面の端にある硬膜を刺して引き裂きます。硬膜の端に開けられた穴に鉗子の先端を挿入し、それを剥がして脳表面を露出させます。生理食塩水中に止血繊維を1本ずつ分散させた後、断続硬膜が存在する穴の縁に沿って止血繊維を配置する。
露出した脳表面に頭蓋窓を置き、窓をそっと押しながら瞬間接着剤で頭蓋骨に接着します。その後、露出した頭蓋骨全体に瞬間接着剤を塗ります。次に、ヘッドプレートを頭蓋骨に注意深く取り付けて、ヘッドプレートの四角い穴の中央にある頭蓋窓を見つけます。
接着剤が十分に硬化したら、露出した頭蓋骨に歯科用セメントを塗布して、ヘッドとヘッドブレードの間のアタッチメントを強化します。カスタムメイドのシェーディングデバイスと視覚刺激用のLCDモニターを取り付けるには、まずレンズを脳表面に焦点を合わせるように配置してから、このレンズの位置を元のZ位置として設定します。XY座標を一定に保ち、対物レンズを持ち上げます。
マウスと脳定位固定装置を対物レンズから取り外します。シリコンを使用してヘッドプレートの上部に遮光装置を取り付け、ヘッドプレートと遮光装置の間のスペースがしっかりと密閉されていることを確認します。遮光装置に蒸留水を入れます。
次に、対物レンズの下の定位固定装置フレームでマウスを固定します。脳表面の焦点面を慎重にリセットし、対物レンズの深さを確認します。対物レンズを黒いアルミホイルで覆い、LCDモニターからの光の汚染を防ぎます。
10インチの液晶モニターをマウスの目の前に12.5センチメートルに設定して、視覚刺激を提示します。EGFPおよびR-CaMP用の蛍光提出収集フィルターと励起波長を1, 000ナノメートルに設定します。ピクセルあたり0.25ミクロンの空間分解能で画像を取得します。
R-CaMP陽性ニューロンとEGFP陽性ミクログリアを同時にイメージングできるイメージング領域を見つけます。レイヤー2では、3。30ヘルツのフレームレートで画像を取得します。
画像取得と同時に、0度から150度まで30度刻みで6方向、12方向に漂流格子視覚刺激をマウスに提示する。画像取得後、マウスを顕微鏡ステージから取り外します。シェーディングデバイスと定位固定装置をマウスから取り外し、マウスをホームケージに戻します。
このプロトコルを使用して、8週齢のトランスジェニックマウスの一次視覚野でAAV注射と頭蓋窓移植を行い、続いてR-CaMPベースの神経活動と層2、3のミクログリアダイナミクスの2つの光子イメージングを行いました。格子視覚刺激をマウスに提示し、副生脊椎の視覚反応をカルシウムトレースを使用して分析しました。ミクログリア突起は速いダイナミクスを示し、10秒以内に形態を変化させた。
12週齢のトランスジェニックマウスの一次視覚野の層2、3で2光子イメージングを使用して、R-CaMPがニューロンで観察され、ここではマゼンタで見られました。EGFPはミクログリアで観察され、緑色で見られました。EGFPおよびR-CaMPについても個々のシグナルが観察された。
この方法では、AAVインジェクションの成功が重要です。AAV注入に失敗した主な理由は、時計ガラスピペットと組織の損傷です。ミクログリアの監視行動とSNAPのミクログリア相互作用は、アルツハイマー病などのさまざまな病原性メカニズムで一般的であることが確認されています。
私たちの方法は、この分野に焦点を当てた研究に有益です。
