この研究は、中西部大学健康科学研究助成助成金、EEHに授与された資金、およびKJLに授与された中西部大学研究およびスポンサープログラムの教員補助プログラムの助成を受けて行われました。 Affiliated LaboratoriesおよびAffiliated Dermatologyが追加サポートを提供しました。彼らの技術的支援のためにSarah Potekhen、Jamie Barto、Stefani Fawks、Cody Jording、Stacie Schimke、Heather Kissel、Ali Zaidiに感謝します。

ヒト組織サンプルに関する全ての実験は、Western IRB（WIRB Protocol＃20142461）によって承認された。これらの処置のための組織収集の単一の基準は、生検で証明されたSCCの診断である。除外基準は元のIRBプロトコルで概説されていませんが、血液媒介性伝染性疾患の患者のサンプルは使用されませんでした。皮膚組織、血液、および唾液の採取に先立ち、インフォームドコンセントが得られた。 Midwestern Institutional Review Boardは、Midwestern University（AZ＃807）の診療所ベースのバイオリポジトリサンプルでの検証作業を承認しました。 1.皮膚腫瘍組織の処理注：これは、モズの組織学者によって行われます。 <ol><li> RNAおよび外植片培養のための新鮮な扁平上皮癌（SCC）組織の処理 <ol><li>組織をモース外科医が切除した後、10〜50mg（≧10mm 3 </sup&gt;）組織サンプルを、追加の処理の前に、弛緩の間に組織の先端側の中心から除去する（これは、スライドを平らにするように組織を操作するプロセスである）。 注：これは、腫瘍がMohs手術の一部である組織学的評価の前に10〜50mgのサイズの試料（10mm 2以上 ）を除去するのに十分な大きさである場合にのみ可能です。腫瘍の大きさが最小で2mm 3を除去するのに十分でない場合は、RNAの処理を続行しないでください（ステップ5をスキップしてください）。 </li><li>ピンセットを用いて、培養培地（DMEM：Ham&#39;s F-12,25mM HEPES、100IU / mLペニシリン、および100μg/ mLストレプトマイシンの1：1混合物）を含有する標識1.5mLチューブに生存可能な組織を移し、組織は完全に培地に浸される。このチューブを4℃で保存してから処理してください。 </li><li>組織をRNA単離および発現解析（ステップ5を参照）および/または構築するために使用する24時間以内に外植培養（ステップ6参照）を行う。 </li><li>クライオスタットの組織ホルダー（または「チャック」）に、患者から取り出した腫瘍サンプルの残りの部分（ステップ1.1.1）を置きます。最適な切断温度（OCT）の化合物に組織を埋め込み、モース組織学の完成および実験分析のためのさらなる組織学的スライドの調製を可能にするために、ホルダー内の組織を凍結する。 </li></ol></li><li> 組織学的スライドの調製 <ol><li>クライオスタットを使用して7μmの厚さの組織切片を切断し、各腫瘍サンプルに対して2つ（またはそれ以上）のスライドを作成する。各スライドに完全腫瘍の3つのセクションが含まれていることを確認します。 注：2つのスライドのうちの1つは、Mohs histotechnologistによってH＆Eで染色され、追加のスライドはIF、IHC、またはFISH解析で処理されます。 </li><li>スライドを1〜2秒間アセトンに入れて組織を固定する。これらのスライドを乾燥させておく。 H＆Eをしないでください実験プロトコルに応じて、将来の免疫蛍光（IF）、免疫組織化学（IHC）、または蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）分析に使用するスライドを染色またはカバースリップする。 </li></ol></li><li> モホ組織の処理 <ol><li>モースの処理が完了したら（ステップ1.1-1.2）、クライオスタットチャンバー内で作業し、クライオ包埋培地からサンプルを取り出し、標識された極低温チューブに組織を入れる。 </li><li>組織が融解する前に、ラベルされたバイアルを液体窒素に入れます。サンプルをタンパク質および/またはDNA分析に使用する場合は、液体窒素または-80℃のフリーザーに数分以内で移して、将来のタンパク質発現およびDNA変異解析のために保存することができます（ステップ4-5を参照） 。 注：ポストモースサンプルからインタクトなRNAが望まれる場合は、クライオ包埋培地からの除去中にサンプルを凍結した状態に保つことが不可欠です。極端な注意が行使されない場合このステップでは、モース後サンプルは、タンパク質および/またはDNA分析のために予約する必要があります。 </li></ol></li><li> 新しいANTの処理 <ol><li>モースの閉鎖時に、モース外科医からANTを入手する。 </li><li>正常組織の頂端側からSCCサンプル（上記参照）から採取したものと等しいかそれ以上の量のANTを除去し、それを培地（DMEM：Ham&#39;s F- 12に、25mM HEPES、100IU / mLのペニシリン、および100μg/ mLのストレプトマイシンを補充したもの）を使用した。 </li><li>同じ培養液に組織を完全に浸し、その後の処理まで4℃で保存します（ステップ4-6参照）。 </li></ol></li></ol> 2.血液、唾液および口腔スワブ処理<ol><li>約10mLの血液を静脈穿刺を介してEDTA採取チューブで採取する。 </li><li> 収集チューブから滅菌した15または50 mLの遠心チューブに血液を移します。気泡を避けて、約200μLを1.5mLの極低温管に移す。この全血サンプルを-80°Cで保存し、必要に応じて将来の遺伝子型同定および組織マッチングに使用します。 <ol><li>残りの血液を1000 xgで30分間遠心し、標準的な手順に従って血漿画分を集める。 </li><li>分注した血漿を1.5 mLの低温チューブで1 mL刻みに分け、将来の液体生検分析で使用するために-80°Cで保存します。 </li></ol></li><li>口腔内スワブサンプルを得るために滅菌スワブを使用し、室温で滅菌チューブにスワブを保存する。 </li><li>必要に応じて、唾液サンプルを入手し、室温で滅菌チューブに保存します。 注：これらのサンプルは、必要に応じて、将来の遺伝子型同定および組織マッチングに使用することができます。 </li></ol> 3.サンプルの記録保管<ol><li>情報を患者サンプルのチェックリストからバイオリポジトリデータベースに転送する。患者情報と診断情報を含める患者の表からの鼻。 </li><li>各サンプルのバーコード付きラベルを印刷し、データベースにそれぞれ記録して、収集した各サンプルを患者データとリンクさせます。 </li><li>サンプルを研究室に移す前に、識別されていないサンプルの分布をバイオリポジトリデータベースに記録する。 </li></ol> 4.タンパク質単離およびウエスタンブロット分析<ol><li>各組織サンプル（SCCおよび/またはANT）を、100mgの組織当たりプロテアーゼインヒビターを含む500μLの細胞溶解バッファーを含むバイアルに入れ、組織を溶解する。 注：50mMトリスpH8.0,150mM NaCl、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、1.0％NP-40、および0.1％SDSからなるラジオイムノ沈降アッセイ（RIPA）緩衝液を使用した。他の細胞溶解緩衝液を使用することができる。 </li><li>組織ホモジナイザーを用いて4℃で20秒間隔で5分間組織をホモジナイズする。サンプルを21,000 xgおよび4℃で20分間スピンし、タンパク質を含む上清を新鮮なtuに集めるさあ。同じ条件を用いて上清を再遠心し、最終上清を新しいチューブに集める。 </li><li>電気泳動4〜20％SDS-ポリアクリルアミドグラジエントゲルを用いて各サンプルから30〜50μgのタンパク質を抽出する。必要に応じて、クーマシーブルーでゲルを染色し、タンパク質バンドを可視化します。 </li><li>発現されたタンパク質のウェスタンブロット分析が必要な場合は、標準プロトコールに従ってゲルからポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜にタンパク質を移す。移動後、PonceauはPVDF膜を染色して、必要に応じてタンパク質バンドを可視化する。 </li><li> PVDF膜とプローブをブロックして、標準プロトコールに従って目的のタンパク質を検出します。ウェスタンブロット分析のために製造業者が推奨する濃度で、主要な抗体に特異的な対応する二次抗体と共に、目的のタンパク質に特異的な一次抗体を使用する。 </li><li>化学発光基質を用いてプローブされた膜を露出させ、imagiシステム。 </li></ol> RNA単離および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR） <ol><li>直ちに、RNA安定化溶液を含む1.5mLチューブに新鮮な組織サンプル（SCCおよび/またはANT）を置き、凍結組織転移溶液を入れた1.5mLチューブにMohs組織サンプルを置き、製造元の推奨に従ってください。組織が完全に浸漬されていることを確認します。これらのサンプルは、使用するまで-80℃で保存してください。 </li><li> RNAサンプルを-80℃から取り出し、氷上で解凍する。 50〜100mgの組織当たり1mLのRNA抽出バッファー（フェノール/グアニジンチオシアネート）を含む新しい1.5mLチューブに組織を移す。 </li><li>組織ホモジナイザーを用いて組織を溶解する。 6サイクルのホモジナイゼーションを行い、続いてサンプルを冷却します。各サイクルは、4℃および40秒の冷却期間で20秒の均質化からなる。ホモジナイゼーション後、サンプルを室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 0.2を加える1mLのRNA抽出バッファーあたり1mLのクロロホルムで洗浄し、チューブを15秒間手で激しく振とうする。室温で2〜3分間インキュベートする。 </li><li>サンプルを12,000 xg、4℃で15分間スピンします。サンプルの水相を取り出し、新しい1.5 mLチューブに入れます。 </li><li>水相にステップ5.2で使用したRNA抽出バッファー1 mLあたり100 mLのイソプロパノール0.5 mLを加え、室温で10分間インキュベートする。 注：RNA収量が低いと予想される場合（ すなわち、開始組織量が10mg未満の場合）、サンプルは-80℃で一晩沈殿する可能性があります。さらに、500μLのRNA抽出バッファーあたり5μgのRNaseフリーグリコーゲンを、イソプロパノール沈殿工程の間に添加してRNA収量を改善することができる。 </li><li>サンプルを12,000 xgで4℃で10分間スピンします。上清を除去し、ペレットを1mLの75％エタノールで洗浄する。 </li><li>サンプルを短時間ボルテックスしてから、7,500 xgと4°で回転させます5分間Cで処理した。洗浄液を捨て、ペレットを5〜10分間風乾します。 </li><li> RNAペレットを20μLのRNaseフリー水に再懸濁します。 <ol><li>必要に応じて、製造元の推奨に従ってRNAクリーンアップキットを使用して各RNAサンプルを精製します。 注：このステップを実行すると、サンプルからRNAが失われます。 </li></ol></li><li> 1.2％ホルムアルデヒド-MOPSアガロースゲルを用いて1μgのサンプルを電気泳動し、RNAの品質を分析する。 注：代替として、バイオアナライザーを使用してサンプルを分析し、RIN番号13を得る。 </li><li>関心対象の標的mRNA（またはmiRNA）のqPCR分析のために逆転写プロトコールを用いてRNAをcDNAに逆転写する。 </li></ol> 6.組織外植片培養<ol><li>組織を70％エタノールに浸すことにより、培養前に切除した組織を滅菌する。 </li><li>スライドまたはディッシュ上に組織を置き、十分な培地（DMEM：Ham＆＃1の1：1混合物）組織を（組織の乾燥を防ぐために）覆うために、10％FBS、25mM HEPES、100IU / mLペニシリン、および100μg/ mLストレプトマイシンを補充したF-12。メスを用いて、組織を砕いて（&lt;1 mm 3 ）破砕します。 </li><li>組織断片を35mm組織培養皿に移し、各断片の上に約20μLの胎児ウシ血清（FBS）を加える。 </li><li>培養フード内で20〜30分間、またはほとんど乾燥するまで、ディッシュを開いたままにしておきます。 </li><li>各ディッシュに1mLの培地（10％FBS、25mM HEPES、100IU / mLペニシリンおよび100μg/ mLストレプトマイシンを補充したDMEM：Ham&#39;s F-12の1：1混合物）を添加し、37℃でインキュベートする5％CO 2中のC。必要に応じて継代培養するか、培養物をサブクローニングする。 </li></ol>

<ol>
	<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biorepositories:+Building+better+biobanks.">Biorepositories: Building better biobanks.</a> Nature. 486, 141-146 (2012).</li><li>Ambrosone, C. B., Nesline, M. K., Davis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+cancer+center+data+bank+and+biorepository+for+multidisciplinary+research.">Establishing a cancer center data bank and biorepository for multidisciplinary research.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 15, 1575-1577 (2006).</li><li>Baird, P. M., Gunter, E. W., Vaught, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+biobank.">Building a biobank.</a> Biopreserv Biobank. 14, 87-88 (2016).</li><li>Caixeiro, N. J., Lai, K., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+assessment+and+preservation+of+RNA+from+biobank+tissue+specimens:+a+systematic+review.">Quality assessment and preservation of RNA from biobank tissue specimens: a systematic review.</a> J Clin Pathol. 69, 260-265 (2016).</li><li>Campbell, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+ISBER+best+practices+for+repositories:+Collection,+storage,+retrieval+and+distribution+of+biological+materials+for+research.">Development of the ISBER best practices for repositories: Collection, storage, retrieval and distribution of biological materials for research.</a> Biopreserv Biobank. 10, 232-233 (2012).</li><li>Neumeister, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+assess+tissue+quality.">Tools to assess tissue quality.</a> Clin Biochem. 47, 280-287 (2014).</li><li>Vaught, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NCI+perspective+on+creating+sustainable+biospecimen+resources.">An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources.</a> J Natl Cancer Inst Monogr. 2011, 1-7 (2011).</li><li>Fu, T., Aasi, S. Z., Hollmig, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+high-risk+squamous+cell+carcinoma+of+the+skin.">Management of high-risk squamous cell carcinoma of the skin.</a> Curr Treat Options Oncol. 17, (2016).</li><li>Rasmussen, C., Thomas-Virnig, C., Allen-Hoffmann, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+human+epidermal+keratinocyte+cell+culture.">Classical human epidermal keratinocyte cell culture.</a> Methods Mol Biol. 945, 161-175 (2013).</li><li>Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+culture:+Methods+and+protocols.">Cancer cell culture: Methods and protocols.</a> , 151-159 (2011).</li><li>Berglund, S. R., Schwietert, C. W., Jones, A. A., Stern, R. L., Lehman, J., Goldberg, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+methodology+for+sequential+extraction+of+RNA+and+protein+from+small+human+skin+biopsies.">Optimized methodology for sequential extraction of RNA and protein from small human skin biopsies.</a> J Invest Dermatol. 127, 349-353 (2007).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7, 1-14 (2006).</li><li>Cooper, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+glycosylation+of+MUC1+in+epidermolysis+bullosa-associated+and+sporadic+cutaneous+squamous+cell+carcinomas.">Expression and glycosylation of MUC1 in epidermolysis bullosa-associated and sporadic cutaneous squamous cell carcinomas.</a> Br J Dermatol. 151, 540-545 (2004).</li><li>Riihila, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H:+a+biomarker+for+progression+of+cutaneous+squamous+cell+carcinoma.">Complement factor H: a biomarker for progression of cutaneous squamous cell carcinoma.</a> J Invest Dermatol. 134, 498-506 (2014).</li><li>Ha Lan, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+p40+isoform+of+p63+has+high+specificity+for+cutaneous+sarcomatoid+squamous+cell+carcinoma.">Expression of the p40 isoform of p63 has high specificity for cutaneous sarcomatoid squamous cell carcinoma.</a> J Cutan Pathol. 41, 831-838 (2014).</li><li>Alomari, A. K., Glusac, E. J., McNiff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p40+is+a+more+specific+marker+than+p63+for+cutaneous+poorly+differentiated+squamous+cell+carcinoma.">p40 is a more specific marker than p63 for cutaneous poorly differentiated squamous cell carcinoma.</a> J Cutan Pathol. 41, 839-845 (2014).</li><li>Qiao, B., Johnson, N. W., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+in+oral+squamous+cell+carcinoma+triggered+by+transforming+growth+factor-beta1+is+Snail+family-dependent+and+correlates+with+matrix+metalloproteinase-2+and+-9+expressions.">Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma triggered by transforming growth factor-beta1 is Snail family-dependent and correlates with matrix metalloproteinase-2 and -9 expressions.</a> Int J Oncol. 37, 663-668 (2010).</li><li>Vaught, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+biospecimen+research.">Developments in biospecimen research.</a> Br Med Bull. 114, 29-38 (2015).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

著者らの知る限り、このプロトコールは、費用対効果と迅速なアプローチの両方で皮膚組織サンプルの臨床調達に焦点を当てた最初のものです。 Mohsマイクロサージャリーを受けている患者は、通常、特定の時間帯にスケジュールされ、収集はこれらの期間に限定されます。サンプル収集には、患者のケアに携わる医療補助員、腫瘍サンプルを処理するモース組織学者、サンプルの採取およ?...

がんやバイオマーカーの研究は質の高いヒトの組織サンプルの供給に依存しており、限られた供給は研究1,2を妨げている。多くの皮膚科学的研究は、供給不足、品質の変化、およびヒト組織の使用に関連するコストによって制限される。大規模な専用バイオバンクを構築するコストは約200万ドルと推定されており、これらのコストは人体組織の使用を多くの研究者の手の届かないところに置きます。さらに、研究サンプルを生成し保存するプロセスは、注意深く実行されなければ、臨床操作に影響を与え、患者のケアを遅らせるリスクをもたらす。推奨されるベストプラクティスとサンプルのバリデーション4,5,6に従って、皮膚癌サンプルに焦点を当てた費用効果の高いクリニックベースのバイオリポジトリが確立されました。 <pこのプロトコルは、扁平上皮癌（SCC）、基底細胞癌（BCC）およびメラノーマ皮膚癌を除去するために多量のモース顕微鏡手術を行う皮膚科診療所で開発されました。ボランティアドナーは、この患者集団から募集することができます。収集場所にバイオリポジトリを設置して、治療を遅らせることなく、同意された患者の組織や血液を迅速に採取することが重要です。同じ診療所から採取した検体を集めることは、採取技術のばらつきを最小限に抑え、検体の品質のばらつきを最小限に抑えます。これは、下流のアプリケーション7,8で問題になります。 Mohs顕微鏡手術技術の目標は、可能な限り多くの健康な組織を保存しながら、すべての癌組織を確実に除去することです。この手順は、腫瘍組織の薄層の漸進的除去を含む。それぞれの連続する層は彼のものです皮膚科医によって（腫瘍組織を凍結切除し、H＆E染色を行った後に）論理的に検査して、すべての癌組織が除去されたかどうかを決定する。患者がオフィスに留まる間、組織の次の層の切除および検査が実行される。この手法は、SCC 9の最良の治療選択肢と考えられています。この時点で、創傷は閉鎖され、治癒および美容的外観を改善するために、隣接する正常組織（ANT）が頻繁に摘出される。したがって、腫瘍を除去するためのこの外科的処置は、将来の研究のために組織学的に特徴付けられた組織を収集するのに理想的に適している。 腫瘍組織、隣接する正常組織、唾液、および血液サンプルを取得するための調達手順は、通常の職務に最小限の影響を及ぼすように設計されています（ 図1 ）。医療アシスタントは、手順のために患者を準備しながら血液採取を行う。 Mohs手順の完了後、M<html>オハイオ組織学者は標本の追加の組織スライドを準備し、その組織をバイオリポジトリに移す。バイオリポジトリの確立に関連するコストには、凍結保存フリーザの購入、適度な臨床検査スペースの作成、および在庫追跡プログラムの開発が含まれる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55583/55583fig1.jpg" /> 図1：サンプル収集と責任スタッフのシーケンス。患者のチェックインと患者の同意が得られると、医療アシスタントは頬の綿棒を採取して採血を行う。皮膚科医および医療補助員は、腫瘍を切除し、創傷を閉鎖し、その間SCCおよびANT標本をそれぞれ収集する。専用の実験技術者が血液を処理し、組織培養、保存、およびバイオリポジトリへの入室についてSCCおよびANT標本を区分する。ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 収集されたサンプルの多様性は、さまざまな実験的アプローチを可能にします（ 図2 ）。患者から採取した試料は、頬拭き（唾液も必要に応じて採取することができる）、全血、および切除組織である。口腔スワブおよび全血由来のサンプルは、遺伝子タイピングおよび組織適合のために、処理することなく保存される。将来の分析のために、全血を白血球（WBC）と血漿画分に分離する。モース処理後、凍結した腫瘍を液体窒素に直接入れ、-80℃の冷凍庫に移す。新鮮な生存可能な腫瘍組織およびANT試料を、以前の技術10,11の改変を用いて培養し、次いで凍結保存する。収集中、各サンプルタイプの数は、スプレッドシートに記録されてから<html>正確な処理を容易にする在庫追跡プログラム（ 表1 ）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55583/55583fig2.jpg" /> 図2：臨床医ベースのバイオリポジトリのサンプル収集と処理の概要。頬側スワブおよび血液サンプルを患者から採取し、下流の遺伝子型決定および組織適合のために保存する。全血は、白血球（WBC）単離およびCTC分析ならびに血漿採取および液体生検分析のためにさらに処理される。 Mohs手順中に切除された組織は、診断目的のために組織学的に処理され、その後、組織学的スライドはさらなる免疫組織化学的分析のために実験的に使用され得る。切除された組織試料が十分に大きい場合、新鮮な組織の一部を取り出し、タンパク質およびRNAの単離および培養細胞系の確立のために切片化する。55583 / 55583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>コレクション日： </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>患者1 </td><td>患者2 </td><td>患者3 </td><td>患者4 </td><td>患者5 </td></tr><tr><td>頭文字と誕生日</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>目の色</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>サンプルタイプ</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>サンプルの場所</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>唾液</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> W穴の血</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラズマ</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>腫瘍の生存率</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織正常Viable </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>腫瘍モース液体窒素</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織正常液体窒素</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1：サンプルコレクションを記録するチェックリスト収集された各サンプルと共に追跡され、記録されたデータには、患者のイニシャル、生年月日、および肌の色のための目の色、試験片除去のオン。唾液サンプル数、採血量、および採取した生存および保存された組織標本の数も、後の使用のための参考文献として記録される。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55583/Table1.xlsx">このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。</a> サンプル収集手順を検証するために、各サンプルタイプはダウンストリームアプリケーションでテストされています。以前の技術12の改変を用いて、腫瘍およびANTはタンパク質およびRNA単離に首尾よく用いられ、DNA単離のために潜在的に使用され得る。組織切片から確立された生存外植片を顕微鏡検査し、保存された組織スライドを免疫組織化学および免疫蛍光のために使用した。 本明細書に記載されたプロトコールに従って、このモデルを他の皮膚科診療所、他の腫瘍型（メラノーマなど）にまで拡張することが可能であり、、およびヒト癌への多面的研究のためのヒト組織サンプルを提供するための他の外科的専門性および実践を含む。このプロトコルのわずかな変更は、他のプラクティスにとって必要である可能性が高いが、原則として、このプロトコルは、患者治療の過程で収集された患者サンプルを日常的に廃棄する任意の外科手術に適用可能である。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-685-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50-949-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Medium Point General Purpose Forceps</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC9791321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50-363-579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CM1950 Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14047743909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Rapid-Chrome H&#38;E Frozen Section Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>99-900-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>03-337-7X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boca Scientific BuccalT-Swab&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC9679349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50-195-822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PI78443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-401-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet Morter Cordless Homogenizer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-141-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Free Pellet Pestle</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>121-141-364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma SteriCycle CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-998-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>SH30071.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco 1M Hepes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15-630-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell Culture 35 mm with Vent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1256591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24</td>
			<td>Abnova</td>
			<td>MAB12583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p40 (p63 delta) antibody</td>
			<td>Abnova</td>
			<td>ABX-144A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti MUC-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-7313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Snail + Slug (phospho S246)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab63568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Phallodin</td>
			<td>Molecular Probes&#160;</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Molecular Probes&#160;</td>
			<td>P36941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4300009901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX511F3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of a clinic-based biorepository

皮膚癌（ 例えば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌および黒色腫）の発生率は、過去数年間にわたって増加している。生物医学研究研究のための皮膚腫瘍サンプルが並行して要求されることが期待される。しかしながら、組織の入手可能性は、バイオリポジトリを確立するコストと、臨床操作を妨害しない臨床サンプルを得るために利用可能なプロトコルがないために限定されている。モース外科手術の日にルーチンの臨床手順に最小限の影響を与える皮膚腫瘍および関連する血液および唾液サンプルを収集および処理するためのプロトコルが確立された。腫瘍試料は、モース組織工学者による生検で証明された皮膚悪性腫瘍のための第1層のモース手術を受けている患者から収集され、処理される。隣接する正常組織は、手術終了時に収集される。採取することができる追加のサンプルは、全血および口腔スワブ。通常は廃棄される組織サンプルを利用することにより、診療所と臨床検査室の設定に基づいていくつかの重要な利点を提供するバイオリポジトリが生成された。これらには、幅広い収集サンプルが含まれています。病理学的報告を含む、識別されていない患者記録へのアクセス;典型的なドナーの場合、フォローアップ訪問中の追加サンプルへのアクセス。

腫瘍およびANTは、タンパク質単離において首尾よく使用され、ウェスタンブロッティングによって試験された。 図3に示すように、皮膚扁平上皮癌腫マーカー（Muc1 14 、FHL-1 15 、およびp40 16,17 ）は、本発明者らの診療所ベースのバイオリポジトリに収集および保存された患者サンプルで検出することが...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a Clinic-based Biorepository at JoVE.com

Establishment of a Clinic-based Biorepository

皮膚腫瘍は、しばしば、モース顕微鏡手術後に捨てられる。臨床支援スタッフが、臨床操作を妨害することなく、下流の実験室用途のための皮膚腫瘍（ 例えば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、および黒色腫）試料を効果的に処理および保存することを可能にするプロトコールがここに記載される。

クリニックベースのバイオリポジトリの設立

The incidence of skin cancer (e.g., squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, and melanoma) has been increasing over the past several years. It is ...

establishment-of-a-clinic-based-biorepository

Research

JoVE Journal

Medicine

6.4K ビュー.  Midwestern University. 皮膚腫瘍は、しばしば、モース顕微鏡手術後に捨てられる。臨床支援スタッフが、臨床操作を妨害することなく、下流の実験室用途のための皮膚腫瘍（ 例えば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、および黒色腫）試料を効果的に処理および保存することを可能にするプロトコールがここに記載される。 

ビデオ: Establishment of a Clinic-based Biorepository

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

免疫不全マウスにおけるヒト網膜芽細胞腫の腫瘍の確立と伝播

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

医学

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable cell lines are inoculated either by intravesical instillation (model of nonmuscle invasive growth) or intramural injection into the bladder wall (model of invasive growth). Both procedures are complex and highly time-consuming. Additionally, the superficial model has its shortcomings due to the lack of cell lines that are tumorigenic following instillation. Intramural injection, on the other hand, is marred by the invasiveness of the procedure and the associated morbidity for the host mouse.
With these shortcomings in mind, we modified previous methods to develop a minimally invasive approach for creating orthotopic bladder cancer xenografts. Using ultrasound guidance we have successfully performed percutaneous inoculation of the bladder cancer cell lines UM-UC1, UM-UC3 and UM-UC13 into 50 athymic nude. We have been able to demonstrate that this approach is time efficient, precise and safe. With this technique, initially a space is created under the bladder mucosa with PBS, and tumor cells are then injected into this space in a second step. Tumor growth is monitored at regular intervals with bioluminescence imaging and ultrasound. The average tumor volumes increased steadily in in all but one of our 50 mice over the study period.
In our institution, this novel approach, which allows bladder cancer xenograft inoculation in a minimally-invasive, rapid and highly precise way, has replaced the traditional model.

The established technique to inoculate primary invasive orthotopic bladder cancer xenografts requires laparotomy and mobilization of the bladder. This procedure inflicts significant morbidity on the mice, is technically challenging and time-consuming. We therefore developed a high-precision, percutaneous approach utilizing ultrasound guidance.

マウス同所性膀胱異種移植片の最小侵襲性の確立

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

全組織生検からヒト上皮EnteroidsとColonoidsの確立

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. Females are disproportionately afflicted by UTI: 50% of all women will have a UTI in their lifetime. Additionally, 20-40% of these women who have an initial UTI will suffer a recurrence with some suffering frequent recurrences with serious deterioration in the quality of life, pain and discomfort, disruption of daily activities, increased healthcare costs, and few treatment options other than long-term antibiotic prophylaxis. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the primary causative agent of community acquired UTI. Catheter-associated UTI (CAUTI) is the most common hospital acquired infection accounting for a million occurrences in the US annually and dramatic healthcare costs. While UPEC is also the primary cause of CAUTI, other causative agents are of increased significance including Enterococcus faecalis. Here we utilize two well-established mouse models that recapitulate many of the clinical characteristics of these human diseases. For UTI, a C3H/HeN model recapitulates many of the features of UPEC virulence observed in humans including host responses, IBC formation and filamentation. For CAUTI, a model using C57BL/6 mice, which retain catheter bladder implants, has been shown to be susceptible to E. faecalis bladder infection. These representative models are being used to gain striking new insights into the pathogenesis of UTI disease, which is leading to the development of novel therapeutics and management or prevention strategies.

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work&#8217;s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

マウスモデルにおけるUTIとCAUTIの樹立とその性状

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold. 
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.

Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.

プレート骨接合によって安定化マウスにおけるセグメント別大腿臨界サイズ欠陥モデルの確立

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

ウサギにおける完全なダクリオアデネクトー切除術を用いた重症ドライアイモデルの確立

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Establishment of a Mouse Severe Acute Pancreatitis Model using Retrograde Injection of Sodium Taurocholate into the Biliopancreatic Duct

The prevalence of acute pancreatitis (AP), especially severe acute pancreatitis (SAP), is increasing in younger age groups annually. However, there is a lack of effective treatments in the current clinical practice. With the easy accessibility of transgenic and knockout strains and their small size, which allows minimal doses of drugs required for in vivo evaluation, a well-established experimental model in mice is preferred for AP research. Moreover, SAP induced through sodium taurocholate (TC) is currently one of the most widely used and best characterized models. This model has been investigated for novel therapies and possible molecular events during the process of AP. Here, we present the generation of an AP mouse model using sodium taurocholate and a simple homemade microsyringe. Moreover, we also provide the methodology for the subsequent histology and serological testing.

A mouse model of severe acute pancreatitis is described herein. The procedure presented here is very rapid, simple, and accessible, thereby potentially allowing the study of the molecular mechanisms and different therapeutic interventions in acute pancreatitis in a convenient way.

ビリオ膵管へのタウロコール酸ナトリウムの逆行性注入を用いたマウス重症急性膵炎モデルの確立

The prevalence of acute pancreatitis (AP), especially severe acute pancreatitis (SAP), is increasing in younger age groups annually. However, there is a ...

Establishment and Evaluation of a Porcine Vein Graft Disease Model

Venous graft disease (VGD) is the leading cause of coronary artery bypass graft (CABG) failure. Large animal models of CABG-VGD are needed for the investigation of disease mechanisms and the development of therapeutic strategies. 
To perform the surgery, we enter the cardiac chamber through the third intercostal space and carefully dissect the internal mammary vein and immerse it in normal saline. The right main coronary artery is then treated for ischemia. The target vessel is incised, a shunt plug is placed, and the distal end of the graft vein is anastomosed. The ascending aorta is partially blocked, and the proximal end of the graft vein is anastomosed after perforation. The graft vein is checked for patency, and the proximal right coronary artery is ligated. 
CABG surgery is performed in minipigs to harvest the left internal mammary vein for its use as a vascular graft. Serum biochemical tests are used to evaluate the physiological status of the animals after surgery. Ultrasound examination shows that the proximal, middle, and distal end of the graft vessel are unobstructed. In the surgical model, turbulent blood flow in the graft is observed upon histological examination after the CABG surgery, and venous graft stenosis associated with intimal hyperplasia is observed in the graft. The study here provides detailed surgical procedures for the establishment of a repeatable CABG-induced VGD model.

In this protocol, novel pig vein bypass grafting was performed through a small incision in the left chest wall without cardiopulmonary bypass. A postoperative pathology study was done, which showed intimal thickening.

ブタ静脈移植病モデルの確立と評価

Venous graft disease (VGD) is the leading cause of coronary artery bypass graft (CABG) failure. Large animal models of CABG-VGD are needed for the ...

Establishment of a Simple and Effective Rat Model for Intraoperative Parathyroid Gland Imaging

Parathyroid gland (PG) identification is a critical unmet need in thyroidectomy. The identification of the PG is challenging in thyroid surgery as it is similar in color to the thyroid gland. The lack of effective animal models in preclinical research is a severe limitation for the development of PG identification techniques. This protocol allows for the establishment of a simple and effective rat model for PG identification. In this model, black iron oxide nanoparticles (IONPs) are injected locally in the thyroid gland and rapidly diffuse within the thyroid gland but not the PG. A negatively stained PG and a positively stained thyroid gland can be easily identified by the naked eye without requiring external microscopes. The position of the PG can be identified by increasing the color contrast between the thyroid gland and the PG, based on the color of the black IONPs. This rat model is low-cost and convenient for PG identification, and the IONPs are a novel PG contrast agent.

To date, the development of parathyroid gland (PG) identification methods is limited by the lack of animal models in preclinical research. Here, we establish a simple and effective rat model for intraoperative PG imaging and evaluate its effectiveness by using iron oxide nanoparticles as a novel PG contrast agent.

術中副甲状腺イメージングのための簡便かつ効果的なラットモデルの確立

Parathyroid gland (PG) identification is a critical unmet need in thyroidectomy. The identification of the PG is challenging in thyroid surgery as it is ...

RVボリューム過負荷マウスモデルを確立するための修正動静脈瘻手術

Establishment and Confirmation of a Postnatal Right Ventricular Volume Overload Mouse Model

Right ventricular (RV) volume overload (VO) is common in children with congenital heart disease. In view of distinct developmental stages,the RV myocardium may respond differently to VO in children compared to adults. The present study aims to establish a postnatal RV VO model in mice using a modified abdominal arteriovenous fistula. To confirm the creation of VO and the following morphological and hemodynamic changes of the RV, abdominal ultrasound, echocardiography, and histochemical staining were performed for 3 months. As a result, the procedure in postnatal mice showed an acceptable survival and fistula success rate. In VO mice, the RV cavity was enlarged with a thickened free wall, and the stroke volume was increased by about 30%-40% within 2 months after surgery. Thereafter, the RV systolic pressure increased, corresponding pulmonary valve regurgitation was observed, and small pulmonary artery remodeling appeared. In conclusion, modified arteriovenous fistula (AVF) surgery is feasible to establish the RV VO model in postnatal mice. Considering the probability of fistula closure and elevated pulmonary artery resistance, abdominal ultrasound and echocardiography must be performed to confirm the model status before application.

著者スポットライト:出生後右室容積過負荷マウスモデルの確立と確認  

This protocol presents the establishment and confirmation of a postnatal right ventricular volume overload (VO) model in mice with abdominal arteriovenous fistula (AVF), which can be applied to investigate how VO contributes to postnatal heart development.